益氣復(fù)脈合劑抗烏頭堿致大鼠心肌細(xì)胞動作電位異常的研究*

武 乾，李昊媧，石曉路，孫明杰，林 謙，李 巖△

（1.北京市中醫(yī)藥防治重大疾病基礎(chǔ)研究重點實驗室，中國中醫(yī)科學(xué)院醫(yī)學(xué)實驗中心，北京 100700；2.首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京安貞醫(yī)院，北京 100029；3.北京中醫(yī)藥大學(xué)東方醫(yī)院，北京 100078）

益氣復(fù)脈合劑抗烏頭堿致大鼠心肌細(xì)胞動作電位異常的研究*

武 乾1，李昊媧2，石曉路1，孫明杰1，林 謙3，李 巖3△

（1.北京市中醫(yī)藥防治重大疾病基礎(chǔ)研究重點實驗室，中國中醫(yī)科學(xué)院醫(yī)學(xué)實驗中心，北京 100700；2.首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京安貞醫(yī)院，北京 100029；3.北京中醫(yī)藥大學(xué)東方醫(yī)院，北京 100078）

目的：利用膜片鉗技術(shù)闡述益氣復(fù)脈合劑抗心律失常的作用機(jī)制。方法：采用酶解法分離大鼠心肌細(xì)胞，利用膜片鉗方法考察益氣復(fù)脈合劑抗烏頭堿致大鼠心肌細(xì)胞動作電位異常的作用。結(jié)果：益氣復(fù)脈合劑可顯著縮短烏頭堿所致動作電位時程APD、APD50、APD90的延長，對靜息電位、超射、幅度及最大上升速率并無明顯改變。結(jié)論：益氣復(fù)脈合劑抗烏頭堿致室性心律失常的作用機(jī)制可能與抑制心室肌細(xì)胞的Ca2＋內(nèi)流以及K＋外流有關(guān)。

益氣復(fù)脈合劑；動作電位；全細(xì)胞膜片鉗

室性心律失常是指起源于心室的心律紊亂，不但有可能加重原有心臟疾病，還可能導(dǎo)致患者突然死亡［1］，嚴(yán)重威脅人類健康。目前西醫(yī)抗心律失常的藥物均存在致心律失常作用，尚未發(fā)現(xiàn)安全有效的藥物。中醫(yī)藥在室性心律失常的臨床治療上顯示出一定優(yōu)勢［2］，而對其抗心律失常的機(jī)制既往文獻(xiàn)也有報道。益氣復(fù)脈合劑具有益氣活血、祛痰安神功效，且臨床多年應(yīng)用有效。本課題組早期研究中證實，其具有抗烏頭堿致實驗性室性心律失常作用［3］，可有效延遲室性心律失常及心臟停搏出現(xiàn)時間。同時也對其可能的機(jī)制進(jìn)行了初步研究［4］，發(fā)現(xiàn)益氣復(fù)脈合劑可以縮短異丙腎上腺素導(dǎo)致的動作電位延長。在此基礎(chǔ)上，本研究旨在進(jìn)一步研究其抗心律失常作用機(jī)制，為抗心律失常中藥的研發(fā)提供完整、可靠的數(shù)據(jù)支持。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

清潔級健康雄性SD大鼠，體質(zhì)量（200±20）g，購自北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司（許可證0229769）。

1.2 藥物與試劑

益氣復(fù)脈合劑組成：中藥飲片黨參、黃連、半夏、鬼箭羽、川芎、丹參、赤芍、白芍、炙甘草、酸棗仁和遠(yuǎn)志購自康仁堂，由東方醫(yī)院制劑室水煮濃縮，藥物終濃度4.13 g／ml；烏頭堿（Acontine）購自成都曼思特生物科技有限公司（批號MUST?11031101）；Ⅱ型膠原酶（collagenase type 2）購自美國Washington公司；NaCl、KCl、HEPES、D?Glucose、NaOH、CaCl2、KOH、MgCl2、KH2PO4、MgSO4、L?Glutamic、Taurine、EGTA、Na2ATP等購自美國Alfa公司；牛血清白蛋白、二甲基亞砜（DMSO）購自美國Sigma公司。

1.3 主要溶液配制

烏頭堿溶液濃度為10 μmol／L。無鈣臺氏液（Tyrode solution，mmol／L）：NaCl 140.0，KCl 5.4，MgCl21.0，HEPEs 10.0，D?Glucose 10.0，NaOH調(diào)至pH 7.4；有鈣臺式液：在無鈣臺式液基礎(chǔ)上加1.8 mmol／L CaCl2；KB液（mmol／L）：KOH 80.0，KCl 40.0，KH2PO425.0，MgSO43.0，L?Glutamic 50.0，Taurine 20.0，EGTA 1.0，D?Glucose 10.0，KOH調(diào)節(jié)至pH 7.2；消化液：含60%Collagenase type 2＋20%BSA ＋50 μmol／L Ca2＋的無鈣臺氏液；動作電位電極內(nèi)液（mmol／L）：NaCl 10.0，KCl 120.0，MgCl25.0，HEPEs 20.0，EGTA 5.0，Na2ATP 3.0，KOH調(diào)節(jié)至pH 7.2；給藥溶液為有鈣臺式液＋10 μmol／L烏頭堿（Acontine）；浴槽溶液為有鈣臺式液。

1.4 實驗儀器與器材

RM6240型多通道信號處理系統(tǒng)，成都儀器廠；ALC?IP微量泵，上海奧爾科特生物科技有限公司；滲透壓儀Fiske 210，美國ADVANCE公司；微電極拉制儀，DMI?Universal Puller；放大器EPC 10，美國HEKA 公 司；微 操 MP?225，美 國 SUTTER INSTRUMENT COMPANY；顯微鏡 IX71，日本OLYMPUS公司；微電極B15014F，武漢微探科學(xué)儀器有限公司。

1.5 實驗方法

1.5.1 分組與給藥 空白對照組（簡稱對照組，Control）給予蒸餾水3.48 ml／kg／d灌胃，益氣復(fù)脈合劑組（簡稱中藥組，CM）給予益氣復(fù)脈合劑3.48 ml／kg／d灌胃，連續(xù)給藥7 d。

1.5.2 心室肌細(xì)胞分離 末次給藥1 h后，用10%水合氯醛溶液麻醉開胸，迅速取出心臟，置于4℃臺式液中清理和沖洗殘余血液，并迅速掛于Langendorff裝置上進(jìn)行主動脈逆行灌注，在36.7℃、6 ml／min恒速灌流。100%氧氣飽和的有鈣臺式液灌流約3 min后，切換100%氧氣飽和的無鈣臺式液灌流5 min，然后迅速切換消化液循環(huán)灌流，并持續(xù)通以100%氧氣。灌流中同步監(jiān)測灌注壓，當(dāng)灌注壓恢復(fù)到略低于初始灌流壓力時終止消化。用10 ml無鈣臺氏液灌流沖洗殘余消化液，然后于KB液中剪取左心室，并于KB液中保存。

1.5.3 全細(xì)胞膜片鉗記錄及數(shù)據(jù)處理 所用微電極三步拉制拋光，充灌電極液后電極阻抗約為2～6 MΩ。采用全細(xì)胞電流鉗技術(shù)記錄模式 C?CLAMP。細(xì)胞浴槽保持恒速灌流。取細(xì)胞懸液加入浴槽，臺式液灌流以2 ml／min恒速灌流。選取桿狀、橫紋清晰、無自主收縮的心室肌細(xì)胞進(jìn)行實驗。調(diào)節(jié)微操使電極尖端逐漸向所選定的細(xì)胞靠近，形成高阻封接后負(fù)壓抽吸打破細(xì)胞膜，形成全細(xì)胞模式。動作電位（action potential，AP）的刺激模式為脈寬5 ms、電流900 pA。在臺式液中記錄到動作電位后，穩(wěn)定10 min轉(zhuǎn)換為烏頭堿灌流液灌流30 min。記錄烏頭堿灌流前后的靜息電位（resting potential，RP）、動作電位幅度 （action potential amplitude，APA）、超射（overshoot，OS）、動作電位最大除極速率（maximum，Vmax）、動作電位時程（action potential duration，APD）、動作電位復(fù)極至25%、50%、90%的時間（action potential duration at 25%、50%、90%，APD25、APD50、APD90）。

1.5.4 統(tǒng)計學(xué)方法 采用 Fit Clamp、Origin 8.0、Excel 2007、SPSS 13.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析，實驗數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，組間及組內(nèi)前后比較采用單因素檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 益氣復(fù)脈合劑對心室肌細(xì)胞靜息電位、超射、幅度及最大上升速率的影響

表1顯示，烏頭堿灌流前后，中藥組與對照組在靜息電位、超射、動作電位幅度及最大上升速率方面比照灌流前無明顯變化（P＞0.05）。烏頭堿灌流后，中藥組較對照組在靜息電位、超射、動作電位幅度及最大上升速率方面無明顯變化（P＞0.05）。

表1 益氣復(fù)脈合劑對心室肌細(xì)胞靜息電位、超射、幅度及最大上升速率的影響（±s，n＝10）

表1 益氣復(fù)脈合劑對心室肌細(xì)胞靜息電位、超射、幅度及最大上升速率的影響（±s，n＝10）

組 別 例數(shù) 時 間 RP／mV OS／mV APA／mV Vmax（V／S）對照組 10 灌流前 －67.35±0.21 48.21±1.65 113.73±6.20 112.68±5.56 10 灌流后 －68.32±1.05 48.15±8.84 136.83±8.86△ 116.84±7.65中藥組 10 灌流前 －67.43±0.36 47.44±3.94 113.92±4.65 114.52±5.21 10 灌流后 －68.06±0.87 47.74±7.33 138.94±7.63△ 118.65±5.48

2.2 益氣復(fù)脈合劑對心室肌細(xì)胞動作電位時程的影響

表2圖1顯示，烏頭堿灌流前，中藥組與對照組在APD、APD25、APD50、APD90方面比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。烏頭堿灌流后，對照組APD、APD50、APD90均較灌流前顯著延長（P＜0.01），中藥組APD、APD50、APD90均較灌流前顯著延長（P＜0.05，P＜0.01，P＜0.01）；中藥組較對照組 APD、APD50、APD90顯著縮短（P＜0.01）。

3 討論

在選用抗心律失常藥物時，應(yīng)充分考慮其作用靶點，尤其是對各種離子通道的抑制作用。一個理想的抗心律失常藥物應(yīng)對至少2種以上靶點有作用。目前，西醫(yī)常用的抗心律失常藥物（AAD）均存在致心律失常作用［6］。Ic類抗心律失常藥物氟卡尼、恩卡尼和莫雷西嗪在治療急性心肌梗死后的惡性心律失常預(yù)初試驗（CAPT試驗）中均表現(xiàn)出良好的抑制室性心律失常作用和極佳的順從性，但CAST試驗卻證實其可顯著增加心肌梗死患者的猝死和死亡風(fēng)險。近20年來，隨著心臟起搏與心電生理專業(yè)的迅速發(fā)展，現(xiàn)在已有很多非藥物治療方法，但由于其適應(yīng)癥、并發(fā)癥及費用昂貴等原因，大多數(shù)心律失?；颊呷孕杷幬镏委煛＿_(dá)到抗烏頭堿所致室性心律失常的作用，這也與本課題前期動物實驗結(jié)果相符［3?4］。APA可以反映Na＋內(nèi)流的總量，體現(xiàn)了鈉離子通道的功能［7］；烏頭堿所致心室肌APD50的延長主要與Ca2＋內(nèi)流以及K＋外流有關(guān)［10］，這2種通道是心室肌細(xì)胞復(fù)極2期的主要電流；心室肌APD90的延長則主要與K＋外流有關(guān)，這是心室肌細(xì)胞終末快速復(fù)極期的主要電流。

表2 益氣復(fù)脈合劑對心室肌細(xì)胞動作電位時程的影響（±s）

表2 益氣復(fù)脈合劑對心室肌細(xì)胞動作電位時程的影響（±s）

注：與對照組比較：??P＜0.01；烏頭堿灌流前后組內(nèi)比較：△P＜0.05；烏頭堿灌流前后組內(nèi)比較：△△P＜0.01

組 別 例數(shù) 時 間 APD APD25 APD50／ms APD90／ms對照組 10 灌流前 72.63±5.66 6.53±2.13 17.65±1.15 50.50±3.75 10 灌流后 113.24±6.74△△ 6.74±3.01 30.10±1.75△△ 82.13±8.82△△中藥組 10 灌流前 73.56±2.14 6.28±2.54 18.15±2.75 52.50±4.15 10 灌流后 92.85±7.23??△ 6.76±3.58 22.45±2.32??△△ 59.73±5.56??△△

圖1 心室肌細(xì)胞動作電位

烏頭堿灌流后，較對照組而言中藥組的APD、APD50、APD90度均顯著縮短，由此可推測益氣復(fù)脈合劑拮抗烏頭堿致室性心律失常作用的機(jī)制可能與抑制心室肌細(xì)胞的Ca2＋內(nèi)流以及K＋外流有關(guān)。而本實驗顯示，烏頭堿灌流前后APA及Vmax則未見顯著差異，可推測本方抗心律失常作用機(jī)制可能與Na＋離子通道無關(guān)。如需確定益氣復(fù)脈合劑對相關(guān)K、Ca通道的確切影響，還需要進(jìn)一步的實驗研究。

中醫(yī)藥多成分多靶點的治療方式對此有較大優(yōu)勢。益氣復(fù)脈合劑以黨參為君，佐以炙甘草，二者合用益氣復(fù)脈、和胃生津；鬼箭羽、川芎、丹參、赤芍合用，活血祛瘀作用顯著；黃連、半夏燥濕化痰，白芍、酸棗仁、遠(yuǎn)志合用養(yǎng)血柔肝、寧心安神，兼有祛痰之功效，在臨床使用中都表現(xiàn)出較好的治療室性心律失常作用。本課題前期研究也顯示，本方可有效拮抗烏頭堿、異丙腎上腺素所致大鼠室性心律失常［3?4］。

心臟電信號傳導(dǎo)的基礎(chǔ)是心肌細(xì)胞跨膜離子通道電流。心肌細(xì)胞鈉、鉀、鈣等離子通道順序開放并保持動態(tài)平衡是心臟正常工作的基礎(chǔ)。動作電位分為5個時相：0相為快速去極，是Na＋快速內(nèi)流所致；1相為快速復(fù)極初期，由Ito通道K＋短暫外流所致；2相平臺期為緩慢復(fù)極，由Ca2＋及少量Na＋內(nèi)流與緩慢激活的IKs通路K＋外流所致；3相為快速復(fù)極末期，由快速開放的IKr通路的K＋外流所致；4相為靜息期，自動去極化是由內(nèi)向Na＋電流所致，非自律細(xì)胞在生理狀態(tài)下膜電位維持在靜息水平。一些心律失常易感因素可能通過影響鈉、鉀、鈣等離子通道的功能，引起離子通道間的平衡失調(diào)，使心肌電信號的傳導(dǎo)紊亂而致心律失常發(fā)生［1，5?6］。

通過本實驗可以看出，烏頭堿可以延長大鼠心肌細(xì)胞APD，過度延長APD即可誘發(fā)心律失常。而益氣復(fù)脈合劑則可通過縮短烏頭堿所致APD延長

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Research of Yiqi Fumai Mixture of Abnormal Myocardial Cell Action Potential in Rats Induced by Anti Aconitine

WU Qian1，LI Hao?wa2，SHI Xiao?lu1，SUN Ming?jie1，LIN Qian3，LI Yan3△
（1.Beijing Key Laboratory of TCM Basic Research on Prevention and Treatment of Major Disease Medical Experimental Center，CACMS，Beijing 100700，China；2.Beijing Anzhen Hospital，CMU，Beijing 100029，China；3，Dongfang Hospital BUCM，Beijing 100078，China）

Objective：To investigate the anti?arrhythmic mechanism of the Yiqi Fumai mixture by the patch technique.Methods：The whole cell patch clamp was used to record the affect of the Yiqi Fumai mixture on action potential with and without acontine perfusion.Results：In C?clamp mode，The Yiqi Fumai mixture can significantly extend APD，APD50and APD90after aconitine perfusion.Conclusion：Yiqi Fumai mixture has anit?ventricular arrhythmogenic effect of aconitine，and it can against the prolongation of APD caused by aconitine，which maybe related to the inhibiton of the late plateau Ca2＋current and repolarization K＋current.

Yiqi Fumai mixture；Action Potential；Whole Cell Patch Clamp

R285.5

：B

：1006?3250（2016）10?1330?03

2016?03?28

北京中醫(yī)藥大學(xué)2015年度中青年教師類自主選題（面上項目）（2015?JYB?JSMS118）?益氣復(fù)脈法干預(yù)房顫RFCA術(shù)后復(fù)發(fā)因素的研究

武 乾（1986?），女，山東人，助理研究員，醫(yī)學(xué)碩士，從事心血管疾病藥理的臨床與研究。

△

：李 巖（1983?），男，北京人，主治醫(yī)師，醫(yī)學(xué)博士，從事心血管藥理的臨床與研究，E?mail：erzitaba＠163.com。