Bcl- 2基因多態(tài)性、IL- 21單核苷酸多態(tài)性與系統(tǒng)性紅斑狼瘡易感性的相關(guān)性分析

李聲東　　陳阿瓊寧波市醫(yī)療中心李惠利醫(yī)院風(fēng)濕免疫科，浙江寧波　315003

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Bcl- 2基因多態(tài)性、IL- 21單核苷酸多態(tài)性與系統(tǒng)性紅斑狼瘡易感性的相關(guān)性分析

李聲東陳阿瓊
寧波市醫(yī)療中心李惠利醫(yī)院風(fēng)濕免疫科，浙江寧波315003

[摘要]目的研究Bcl-2基因多態(tài)性、IL-21單核苷酸多態(tài)性與系統(tǒng)性紅斑狼瘡易感性的相關(guān)性。方法隨機(jī)選取2012年5月～2015年5月間在我院接受治療的200例系統(tǒng)性紅斑狼瘡患者作為研究對(duì)象，將其分為實(shí)驗(yàn)組；選取健康研究對(duì)象200例，分為對(duì)照組。觀察兩組研究對(duì)象Bcl-2主要基因型分布、等位基因分布以及IL-21單核苷酸多態(tài)性rs2243188位點(diǎn)等位基因及其基因型分布與系統(tǒng)性紅斑狼瘡臨床癥狀的關(guān)系和Bcl-2與IL-21協(xié)同作用分析。結(jié)果兩組研究對(duì)象Bcl-2主要基因分布差異明顯，部分基因類型差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；兩組研究對(duì)象Bcl-2常見等位基因分布差異明顯，部分基因類型差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；IL-21單核苷酸多態(tài)性rs2243188位點(diǎn)等位基因及其基因型分布與系統(tǒng)性紅斑狼瘡臨床癥狀密切相關(guān)；同時(shí)攜帶Bcl-2 195 bp和IL-21 138 bp易感等位基因的個(gè)體較單獨(dú)攜帶Bcl-2 195 bp或IL-21 138 bp易感等位基因的個(gè)體患病的風(fēng)險(xiǎn)性更高。結(jié)論Bcl-2基因多態(tài)性、IL-21單核苷酸多態(tài)性與系統(tǒng)性紅斑狼瘡發(fā)病密切相關(guān)，致病原因可能為兩者直接參與系統(tǒng)性紅斑狼瘡發(fā)病部位或附近某個(gè)易感位點(diǎn)存在連鎖不平衡，兩者易感等位基因分布在決定系統(tǒng)性紅斑狼瘡易感性中存在協(xié)同作用。

[關(guān)鍵詞]Bcl-2基因多態(tài)性；IL-21單核苷酸多態(tài)性；系統(tǒng)性紅斑狼瘡易感性；相關(guān)性

系統(tǒng)性紅斑狼瘡是一種常見的自身免疫性結(jié)締組織疾病，發(fā)病原因一般包括家族遺傳、生活環(huán)境以及免疫系統(tǒng)異常，該病涉及全身多個(gè)系統(tǒng)和器官[1]，其主要特征為免疫系統(tǒng)異常、多種自身抗體生成、補(bǔ)體活化以及免疫復(fù)合物沉積[2]。系統(tǒng)性紅斑狼瘡多發(fā)于17～48歲的育齡女性，其臨床癥狀復(fù)雜多樣，并且極易反復(fù)發(fā)作，對(duì)患者的生活質(zhì)量產(chǎn)生了嚴(yán)重的影響[3]。目前，醫(yī)學(xué)界廣泛開展了對(duì)系統(tǒng)性紅斑狼瘡發(fā)病機(jī)制的研究，但具體原因尚不明確。為了進(jìn)一步探討研究Bcl-2基因多態(tài)性、IL-21單核苷酸多態(tài)性與系統(tǒng)性紅斑狼瘡易感性的相關(guān)性，本研究隨機(jī)選取了2012年5月～2015年5月間在我院接受治療的200例系統(tǒng)性紅斑狼瘡患者進(jìn)行研究，現(xiàn)將研究情況報(bào)道如下。

1　資料與方法

1.1一般資料

隨機(jī)選取2012年5月～2015年5月間在我院接受治療的200例系統(tǒng)性紅斑狼瘡患者作為研究對(duì)象，將其分為實(shí)驗(yàn)組，其中男20例，女180例，年齡25～72歲，平均（41.25±2.55）歲。另選取同期健康研究對(duì)象200例為對(duì)照組，其中男24例，女176例，年齡24～71歲，平均（41.55±2.45）歲。兩組患者年齡、性別等一般資料比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），具有可比性，本研究所有患者均自愿參與本研究。

1.2診斷標(biāo)準(zhǔn)

所有實(shí)驗(yàn)組選取研究對(duì)象均符合美國(guó)風(fēng)濕病學(xué)會(huì)修訂的系統(tǒng)性紅斑狼瘡分類標(biāo)準(zhǔn)[4]，患有顴部紅斑、盤狀紅斑、光過敏、口腔潰瘍、關(guān)節(jié)炎、漿膜炎、腎臟病變、神經(jīng)系統(tǒng)異常、血液學(xué)異常、免疫學(xué)異常、抗核抗體中四項(xiàng)以上者即可確診為系統(tǒng)性紅斑狼瘡。

1.3納入及排除標(biāo)準(zhǔn)

1.3.1納入標(biāo)準(zhǔn)實(shí)驗(yàn)組納入標(biāo)準(zhǔn)：符合上述診斷標(biāo)準(zhǔn)者。對(duì)照組納入標(biāo)準(zhǔn)為：①不符合系統(tǒng)性紅斑狼瘡分類標(biāo)準(zhǔn)中的任意一條；②研究對(duì)象本人以及其直系親屬不具有自身免疫性疾病史；③無重大疾病及家族史；④未長(zhǎng)期使用激素以及免疫抑制劑等藥物。

1.3.2排除標(biāo)準(zhǔn)實(shí)驗(yàn)組排除標(biāo)準(zhǔn)為：①患有其他全

身性疾病者；②意識(shí)不清晰無法完成調(diào)查表者。

1.4研究方法

具體過程如下：①抽取兩組研究對(duì)象外周靜脈血5 mL，放置在抗凝管中，運(yùn)送過程中注意對(duì)樣本進(jìn)行避光、保溫（溫度應(yīng)控制在1℃～4℃之間）以及防止溶血等措施，隨后提取所有樣本的基因組DNA，置-80℃的低溫冰箱中存儲(chǔ)備用；②對(duì)Bcl-2以及IL-21微衛(wèi)星引物設(shè)計(jì)和合成，在基因數(shù)據(jù)庫(kù)中通過輸入序號(hào)找到Bcl-2及IL-21基因端的序列，取其ATG密碼子端上游570 bp處的一個(gè)微衛(wèi)星標(biāo)記，完成引物合成之后，對(duì)其進(jìn)行去離子水溶解，配置成10 pmol/μL濃度，并在-20℃的環(huán)境下進(jìn)行避光保存；③聚合酶鏈反應(yīng)體系擴(kuò)充：聚合酶鏈反應(yīng)體系包括去離子水2.02 μL dNTP 0.2 μL，Bcl-2及IL-21正鏈引物0.2 μL、負(fù)鏈引物0.2 μL，Tsp DNA聚合酶0.05 μL，DNA模板2.5 μL。聚合酶鏈反應(yīng)循環(huán)設(shè)置：95℃變性2 min，之后94℃變性1 min、60℃30 s、72℃15 s，共進(jìn)行35個(gè)循環(huán)，最后一個(gè)循環(huán)72℃9 min，并在5℃的溫度中進(jìn)行保存；④配置濃度為5.8％的Long Ranger變性凝膠，對(duì)聚合酶鏈反應(yīng)的生成物按照1∶10的比例進(jìn)行去離子水稀釋后，取1.5 μL和3.5 μL Loading Buffer混合均勻之后進(jìn)行95℃變性3 min，并放置在冰上；取4 μL在36孔鯊齒書上上樣。使用ABI373進(jìn)行電泳和檢測(cè)，參數(shù)設(shè)置為Genescan模式、電流20 mA、電壓1500 V、功率30 W，并將溫度控制在40℃，在上下電泳槽中放置1× Tris硼酸緩沖液。

1.5觀察指標(biāo)

觀察兩組研究對(duì)象Bcl-2主要基因型分布、等位基因分布以及IL-21單核苷酸多態(tài)性rs2243188位點(diǎn)等位基因及其基因型分布與系統(tǒng)性紅斑狼瘡臨床癥狀的關(guān)系和Bcl-2與IL-21協(xié)同作用分析。

1.6統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件SPSS 19.0對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析和處理，計(jì)數(shù)資料采取率（％）表示，組間率采取χ2檢驗(yàn)；P＜0.05為差異統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，并對(duì)Bcl-2與IL-21協(xié)同作用進(jìn)行Logistic回歸分析。

2　結(jié)果

2.1兩組研究對(duì)象Bcl-2主要基因頻率的分布

通過對(duì)比可以發(fā)現(xiàn)，兩組研究對(duì)象Bcl-2主要基因分布差異明顯，部分基因類型差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見表1。

表1　兩組研究對(duì)象Bcl-2主要基因分布對(duì)比[n（％）]

表2　兩組研究對(duì)象Bcl-2常見等位基因分布對(duì)比[n（％）]

表3　IL-21單核苷酸多態(tài)性rs2243188位點(diǎn)等位基因及其基因型分布與系統(tǒng)性紅斑狼瘡臨床癥狀的關(guān)系[n（％）]

2.2兩組研究對(duì)象Bcl-2常見等位基因頻率的分布

通過對(duì)比可以發(fā)現(xiàn)，兩組研究對(duì)象Bcl-2常見等位基因分布差異明顯，基因型191、193、195、197以及203差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見表2。

2.3IL-21單核苷酸多態(tài)性rs2243188位點(diǎn)等位基因及其基因型分布與系統(tǒng)性紅斑狼瘡臨床癥狀的關(guān)系見表3。

2.4Bcl-2與IL-21協(xié)同作用分析

通過觀察可以發(fā)現(xiàn)，同時(shí)攜帶Bcl-2 195 bp和IL-21 138 bp易感等位基因的個(gè)體較單獨(dú)攜帶Bcl-2 195 bp或IL-21 138 bp易感等位基因的個(gè)體患病的風(fēng)險(xiǎn)性更高，見表4。

表4　兩組研究對(duì)象Bcl-2與IL-21易感等位基因協(xié)同作用分析對(duì)比[n（％）]

3　討論

系統(tǒng)性紅斑狼瘡是由多種病因共同導(dǎo)致的一種復(fù)雜的結(jié)締組織性疾病[5]，一般認(rèn)為該病與遺傳、生活環(huán)境以及感染和藥物等有關(guān)，但具體病因尚不明確[6]。細(xì)胞因子是淋巴細(xì)胞或者單核細(xì)胞等受到刺激而生成、分泌出的一類具有生物學(xué)活性的小分子蛋白物質(zhì)[7]。當(dāng)淋巴細(xì)胞出現(xiàn)非正?；罨驮鲩L(zhǎng)時(shí)，會(huì)產(chǎn)生多種自身抗體、細(xì)胞因子會(huì)表達(dá)異常[8]，進(jìn)而導(dǎo)致人體免疫系統(tǒng)調(diào)節(jié)紊亂，對(duì)系統(tǒng)性紅斑狼瘡的發(fā)病以及發(fā)展有著非常重要的推動(dòng)作用[9]。

Bcl-2具有抑制或者延緩一系列刺激誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡的作用[10]。在過度表達(dá)Bcl-2的轉(zhuǎn)基因生物體內(nèi)，B細(xì)胞存活時(shí)間得到延長(zhǎng)，容易引發(fā)大量自身抗體[11]，并出現(xiàn)狼瘡樣腎小球腎炎[12]。有臨床研究指出[13]，系統(tǒng)性紅斑狼瘡患者，尤其是處于活動(dòng)期的患者，體內(nèi)淋巴細(xì)胞過度表達(dá)Bcl-2基因，表明系統(tǒng)性紅斑狼瘡患者淋巴細(xì)胞可以逃逸細(xì)胞凋亡。并能夠處于活化增殖的狀態(tài)，引起自身免疫系統(tǒng)的失常[14]。

IL-21單核苷酸在細(xì)胞信號(hào)的轉(zhuǎn)導(dǎo)中發(fā)揮著重要的作用，同時(shí)能夠在多種自身免疫性疾病病理生理學(xué)機(jī)制中起到重要作用[15]。IL-21具有促炎和抗炎作用[16]，同時(shí)，IL-21可以刺激B細(xì)胞分化產(chǎn)生抵抗DNA的自身抗體[17]，而ds-DNA抗體又能夠發(fā)揮反作用，刺激IL-21的增加[18]，兩者互相作用，導(dǎo)致了病情的發(fā)展[19]。根據(jù)IL-21的這一特性，可以將其作為系統(tǒng)性紅斑狼瘡患者的診斷標(biāo)準(zhǔn)和治療效果觀察指標(biāo)[20]。

在本研究中，通過使用熒光標(biāo)記衛(wèi)星分型技術(shù)對(duì)200例系統(tǒng)性紅斑狼瘡患者以及200例健康研究對(duì)象進(jìn)行觀察對(duì)比，并對(duì)Bcl-2與IL-21協(xié)同作用進(jìn)行Logistic回歸分析可以發(fā)現(xiàn)，兩組研究對(duì)象Bcl-2主要基因和常見等位基因分布差異明顯，部分基因類型差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），并且IL-21單核苷酸多態(tài)性rs2243188位點(diǎn)等位基因及其基因型分布與系統(tǒng)性紅斑狼瘡臨床癥狀密切相關(guān)，同時(shí)攜帶Bcl-2 195 bp和IL-21 138 bp易感等位基因的個(gè)體較單獨(dú)攜帶Bcl-2 195 bp或IL-21 138 bp易感等位基因的個(gè)體患病的風(fēng)險(xiǎn)性更高。

綜上所述，Bcl-2基因多態(tài)性、IL-21單核苷酸多態(tài)性與系統(tǒng)性紅斑狼瘡發(fā)病密切相關(guān)，致病原因可能為兩者直接參與系統(tǒng)性紅斑狼瘡發(fā)病部位或附近某個(gè)易感位點(diǎn)存在連鎖不平衡。Bcl-2基因多態(tài)性與IL-21單核苷酸多態(tài)性易感等位基因分布在決定系統(tǒng)性紅斑狼瘡易感性中存在協(xié)同作用。由于本研究選取的患者處在不同的疾病階段、部分患者仍在使用治療風(fēng)濕病的藥物，所以對(duì)本研究的研究結(jié)果產(chǎn)生了一定的影響作用。此外，本研究選取的樣本數(shù)量較少，研究結(jié)果可能不具有廣泛的代表性，更廣泛、更深刻的與系統(tǒng)性紅斑狼瘡易感性的研究將在以后得以開展。

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Correlation analysis of Bcl-2 gene polymorphism, IL-21 single nucleotide polymorphism and susceptibility of systemic lupus erythematosus

LI Shengdong CHEN Aqiong
Department of Rheumatism and Immunology, Lihuili Hospital of Ningbo Medical Treatment Center, Ningbo 315003, China

[Abstract]Objective To investigate the correlation of Bcl-2 gene polymorphism, IL-21 single nucleotide polymorphism and susceptibility of systemic lupus erythematosus. Methods Randomly selected 200 patients with systemic lupus erythematosus who received treatment in our hospital from May 2012 to May 2015 were randomly selected and divided into the experimental group, then 200 healthy subjects were selected and divided into the control group. The relationship between Bcl -2 major genotypes distribution, allele distribution, IL -21 single nucleotide polymorphism rs2243188 locus and its genotypes distribution and clinical symptoms of systemic lupus erythematosus were observed, the relationship between which and synergistic effect between Bcl-2 and IL-21 was analyzed. Results There were significant differences in the distribution of major genes of Bcl-2 in the two groups of study subjects, and the differences of partial gene types were statistically significant（P＜0.05）. There were significant differences in the distribution of common alleles between the groups of research subjects, and the differences of partial gene types were statistically significant（P＜0.05）. The allele gene of IL-21 single nucleotide polymorphism rs2243188 locus and its genotype distribution were closely related to the clinical symptoms of systemic lupus erythematosus. The risk of disease of people who carried with 195 bp Bcl-2 and 138 bp IL-21 susceptible allele genes was higher than those who carried 195 bp Bcl-2 or 138 bp IL-21 allele gene alone. Conclusion Bcl-2 gene polymorphism, IL-21 single nucleotide polymorphism are closely related to systemic lupus erythematosus, and the cause of the disease may be that both the two directly involved in the pathogenesis of systemic lupus erythematosus or there is a linkage disequilibrium in the vicinity of some susceptible locus.

[Key words]Bcl-2 gene polymorphism; IL-21 single nucleotide polymorphism; Susceptibility of systemic lupus erythematosus; Correlation

收稿日期：（2015-09-16）

[基金項(xiàng)目]浙江省寧波市第二批科技項(xiàng)目（2015A610179）

[中圖分類號(hào)]R593

[文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼]A

[文章編號(hào)]1673-9701（2016）02-0001-04