黃芩對急性重癥胰腺炎大鼠肝損傷的預(yù)防及治療作用研究*

金琦，蔡天蕊，黃朔，何其勇，孫玉鴻（佳木斯大學(xué)附屬第一醫(yī)院，黑龍江佳木斯154002）

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黃芩對急性重癥胰腺炎大鼠肝損傷的預(yù)防及治療作用研究*

金琦，蔡天蕊，黃朔，何其勇，孫玉鴻
（佳木斯大學(xué)附屬第一醫(yī)院，黑龍江佳木斯154002）

摘要：目的研究黃芩（Bai）對急性重癥胰腺炎（ASP）大鼠肝損傷的預(yù)防及治療作用。方法選取Sprague Dawley大鼠36只，隨機(jī)分為正常組、ASP組、制模前應(yīng)用黃芩ASP組（Bai前ASP組）、制模后應(yīng)用黃芩ASP組（Bai后ASP組）、制模前后均應(yīng)用ASP組（Bai前后ASP組）、頭孢哌酮ASP組（抗生素ASP組）。制模給藥24和48h后進(jìn)行血淀粉酶（AMY）、谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT）、白細(xì)胞介素-6（IL-6）和核轉(zhuǎn)錄因子-κB（NF-κB）活性檢測，分析肝組織病理學(xué)改變。通過上述指標(biāo)的改變分析黃芩對ASP大鼠疾病進(jìn)程的影響。結(jié)果ASP組AMY、ALT、IL-6和NF-κB活性明顯高于其他組，肝細(xì)胞變性，肝小葉中央靜脈出血明顯。Bai前后ASP組上述指標(biāo)僅高于正常組，肝臟組織病變程度最輕。Bai前ASP組與抗生素組的治療效果和病情發(fā)展變化程度相近；24 h時，Bai前ASP組和抗生素組的治療效果和病情發(fā)展優(yōu)于Bai后ASP組，但發(fā)病48 h時不及Bai后ASP組。結(jié)論黃芩對ASP大鼠肝損傷有預(yù)防和治療作用，可以有效減輕肝、胰組織損傷程度。本研究所用劑量（ASP前預(yù)防性給3 g黃芩/100g體重；ASP后給予5 g黃芩/100 g體重）對ASP大鼠肝損傷有治療作用。

關(guān)鍵詞：急性重癥胰腺炎；黃芩；預(yù)防及治療作用

[

急性重癥胰腺炎（acute severe pancreatitis，ASP）指急性胰腺炎的嚴(yán)重狀態(tài)，伴胰腺外的一個或多個器官功能衰竭，病死率可達(dá)50％[1]。目前，世界各國對急性重癥胰腺炎的診療標(biāo)準(zhǔn)不一致，且單純西醫(yī)治療效果不理想。近幾十年來，根據(jù)中國傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)衍生的中西醫(yī)結(jié)合療法取得可喜成績，并形成一定規(guī)范[2]。大柴胡湯、大陷胸湯、清胰湯、大承氣湯等療效明確。黃芩（Baicaline，Bai）是大柴胡湯和清胰湯中的主要成分，對急性重癥胰腺炎的病情進(jìn)展有重要影響。有研究表明，黃芩的主要成分之一黃芩苷可以下調(diào)ASP大鼠胰腺血管內(nèi)皮生長因子、核轉(zhuǎn)錄因子-κB（nuclear transcription factor-κB，NF-κB）以及炎癥細(xì)胞因子，對胰腺和肝臟組織有保護(hù)作用[3-4]。本研究采用中藥黃芩對ASP大鼠進(jìn)行預(yù)防及實(shí)驗(yàn)性治療，根據(jù)血淀粉酶（Amylase，AMY）、谷丙轉(zhuǎn)氨酶(alanine transaminase，ALT）、白細(xì)胞介素-6 （Interleukin-6，IL-6）和NF-кB指標(biāo)的變化，以及肝組織病理表現(xiàn)，分析黃芩對大鼠ASP的預(yù)防及治療作用。

1　材料與方法

1.1一般資料

清潔級Sprague Dawley大鼠36只，10周齡，體重（247.67±0.67）g，選自佳木斯大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心。實(shí)驗(yàn)前進(jìn)行適應(yīng)性喂養(yǎng)2周，給予標(biāo)準(zhǔn)鼠糧（長春億斯實(shí)驗(yàn)動物技術(shù)有限責(zé)任公司）、淡水、少量堅果和水果。

1.2儀器與試劑

AMY、ALT及IL-6試劑盒（上海依科賽生物公司），乙二醇乙醚溶液、10％福爾馬林溶液、1％戊巴比妥鈉注射液、5％牛磺膽酸鈉購自上海埃比化學(xué)試劑有限公司，NF-κB、β-肌動蛋白引物購自北京化工廠，黃芩配方顆粒（華潤三九醫(yī)藥股份有限公司，批號：140902W），注射液頭孢哌酮（上海新先鋒藥業(yè)有限公司，批號：H31020687）。使用時將黃芩配方顆粒和注射液頭孢哌酮溶于蒸餾水制成溶液。

1.3動物模型

選擇Sprague Dawley大鼠進(jìn)行體重測量并記錄其舌苔、毛色。高脂飲食飼養(yǎng)2周后制作ASP模型。大鼠經(jīng)乙醚吸入性麻醉，固定于實(shí)驗(yàn)臺，注射1％戊巴比妥鈉（0.2～0.3 ml/100 g）腹腔麻醉，3～5 min后清潔腹部，沿腹正中線開腹，觀察大網(wǎng)膜有無出血或損傷，觀察肝臟和胰腺組織顏色，尋找膽總管。分組如下：①正常組6只：輕緩翻動胰腺組織，生理鹽水沖洗，關(guān)腹；②急性重癥胰腺炎組（ASP組）6只：逆行經(jīng)胰膽管注射5％牛磺膽酸鈉0.10～0.15 ml/100 g，無菌紗布覆蓋，約2 min后觀察胰腺是否有充血、出血或壞死，成功后關(guān)腹；治療組：③制模前給黃芩組（Bai前ASP組）6只：制模前1周喂養(yǎng)時給予大鼠黃芩溶液3 g/100 g體重，制模過程同ASP組；④制模后給黃芩組（Bai后ASP組）6只：制模后2 h給予ASP大鼠黃芩溶液5 g/100 g體重；⑤制模前后均給予黃芩組（Bai前后ASP組）6只：前后黃芩量同Bai前和后ASP組。⑥抗生素組（抗生素ASP組）：制模2 h后給予ASP大鼠頭孢哌酮0.4 g/100 g體重。

1.4檢測方法

1.4.1血AMY、ALT及IL-6測定每組大鼠隨機(jī)分成兩組，分別在術(shù)后24和48 h采門靜脈血，用生化分析儀檢測血AMY和ALT，并選肝左葉組織制成勻漿，應(yīng)用酶聯(lián)免疫吸附法（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）檢測IL-6。

1.4.2肝組織病理和NF-κB活性測定術(shù)后24 和48 h采血，每只ASP大鼠取肝組織3～4塊（左葉、右葉及肝中部血運(yùn)較豐富處），放入10％福爾馬林溶液中固定≥6 h，組織塊修剪，放入組織包埋盒，固定、石蠟包埋后切片。切片后各組隨機(jī)選1片進(jìn)行蘇木精-伊紅染色法（hematoxylin-eosin staining，HE）染色，100倍視野光鏡下觀察組織的損傷。其余切片浸入0.1 mol/L磷酸鹽緩沖溶液（phosphate buffer saline，PBS）（pH=7.4）浸泡、修復(fù)抗原。先后行一抗（兔抗大鼠）和二抗（山羊抗兔IgG）處理，滴加鏈素抗生物素-過氧化物酶溶液和鏈霉親和素-生物素復(fù)合物（strept avidin-biotin complex，SABC）溶液，二氨基苯胺顯色，輕度復(fù)染后脫水、透明化、封片。以細(xì)胞核或細(xì)胞漿出現(xiàn)褐黃色細(xì)顆粒狀著色為陽性細(xì)胞。400倍顯微鏡下，每張切片隨機(jī)選10個視野，計算陽性顆粒表達(dá)率。

1.5統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計量資料用（±s）表示，各組數(shù)據(jù)經(jīng)方差齊性檢驗(yàn)后，進(jìn)行q檢驗(yàn)，P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2　結(jié)果

2.1一般情況

正常組、ASP組和各治療組在實(shí)驗(yàn)過程中無意外死亡。實(shí)驗(yàn)結(jié)束時，正常組大鼠對外界刺激反應(yīng)較強(qiáng)烈，毛色光澤度較好，可飲水、進(jìn)食。ASP組大鼠精神狀態(tài)差、反應(yīng)遲鈍、多嗜睡、毛色光澤度差，制模后到實(shí)驗(yàn)結(jié)束未見飲水及進(jìn)食。各治療組大鼠對外界刺激有反應(yīng)，飲水及進(jìn)食情況一般，個別大鼠有嗜睡及未飲水和進(jìn)食現(xiàn)象。

2.2各組大鼠血AMY、ALT、IL-6和NF-κB活性比較

24 h時血AMY、IL-6、ALT和NF-κB活性的比較結(jié)果如下：ASP組>Bai后ASP組>Bai前ASP組和抗生素ASP組>Bai前后ASP>正常組。Bai前ASP組與抗生素ASP組各指標(biāo)比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）。見表1。

表1　各組術(shù)后24和48 h的血AMY、ALT、IL-6和NF-κB活性比較（±s）

表1　各組術(shù)后24和48 h的血AMY、ALT、IL-6和NF-κB活性比較（±s）

組別　　術(shù)后24 h術(shù)后48 h AMY/（u/L）　IL-6/（pg/ml）　ALT/（u/L）　AMY/（u/L）　IL-6/（pg/ml）　ALT/（u/L）　NF-κB/活性正常組　532.17±2.32　293.43±2.84　63.50±3.83　19.50±1.38　534.50±2.88　285.67±2.66　66.33±2.66　20.33±1.63 ASP組　1017.50±4.18　463.33±4.72　187.17±6.24　40.83±1.94　1118.33±4.55　505.83±5.27　266.67±3.27　52.83±1.72 Bai前ASP組　881.67±2.42　387.83±2.32　149.67±3.32　31.17±1.72　933.17±2.71　402.67±3.93　222.50±3.45　36.33±2.16 Bai后ASP組　940.17±4.54　426.33±5.28　175.00±5.62　36.67±1.03　848.17±2.32　370.50±6.53　187.67±1.37　34.50±2.35 Bai前后ASP組　710.50±5.54　318.00±2.83　107.67±2.94　24.50±1.05　704.50±1.87　313.00±2.83　111.50±6.09　26.83±1.17抗生素ASP組　878.50±4.97　387.00±4.04　150.17±4.22　31.83±2.04　934.50±2.07　404.33±3.50　225.50±3.94　37.17±1.94 NF-κB活性

48 h時血AMY、IL-6和ALT的比較結(jié)果為：ASP組>Bai前ASP組和抗生素ASP組>Bai后ASP組>Bai前后ASP組>正常組。Bai前ASP組與抗生素ASP組各指標(biāo)比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P> 0.05）。

48 h時NF-κB活性的比較結(jié)果如下：ASP組> Bai前、后ASP組和抗生素ASP組>Bai前后ASP 組>正常組。Bai前ASP組、抗生素ASP組與Bai后ASP組各指標(biāo)比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）。

由此可見，24和48 h時Bai前后ASP組各指標(biāo)都僅高于正常組，而低于其他治療組，說明前后均給予黃芩的治療效果最好。預(yù)先應(yīng)用黃芩的Bai前ASP組與抗生素ASP組在各時段比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義，說明預(yù)先給予黃芩治療與疾病發(fā)生后應(yīng)用抗生素的治療效果相近。24 h時Bai后ASP組的血AMY、IL-6和ALT高于Bai前ASP組和抗生素ASP組，48 h時又低于上述2組，說明應(yīng)用黃芩治療后肝、胰組織損傷明顯減輕，隨著時間延續(xù)，其效果將優(yōu)于該兩組。48h時Bai前、后組和抗生素組的NF-κB活性比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義，說明在此階段，黃芩對NF-κB活性的調(diào)控幅度小于對IL-6、AMY和ALT的影響，可能與多因素參與病情進(jìn)展，導(dǎo)致黃芩的治療受多方面的影響有關(guān)。見表1。

表2　各組24 h與48 h檢測指標(biāo)比較的P值

2.324和48 h各組檢測指標(biāo)比較

ASP組、Bai前ASP組及抗生素ASP組檢測指標(biāo)隨時間延長呈上升趨勢，Bai后ASP組呈下降趨勢，說明預(yù)先應(yīng)用黃芩治療與急性重癥胰腺炎發(fā)生后立即應(yīng)用抗生素效果一致，相比ASP組，可以減輕組織損傷，但不能有效緩解病情進(jìn)展。而發(fā)病后立即應(yīng)用黃芩，本組檢測指標(biāo)呈下降趨勢，但24 h時Bai 后ASP組各檢測指標(biāo)僅低于ASP組而高于其他組（見表1），說明該組早期的肝臟和胰腺組織損傷較重。應(yīng)用黃芩后指標(biāo)下降，說明黃芩治療急性重癥胰腺炎效果顯著。24 h進(jìn)展到48 h時，Bai前后ASP組與正常組各檢測指標(biāo)趨向一致，且前后數(shù)值比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義，說明疾病發(fā)生前后應(yīng)用黃芩治療，可以使急性重癥胰腺炎的病情進(jìn)展減緩，且波動不大，有效減輕肝、胰組織損傷。其機(jī)制可能與早期抑制NF-κB活性和IL-6表達(dá)有關(guān)。見表2。

圖1　24 h各組肝組織病理表現(xiàn)（HE×100）

圖2　48 h各組肝組織病理表現(xiàn)（HE×100）

2.4各組不同時間肝組織病理表現(xiàn)

肝組織病理切片顯示，正常組肝小葉結(jié)構(gòu)規(guī)則，肝細(xì)胞呈條索狀分布。24和48 h時ASP組變性、壞死、出血明顯。24 h時Bai前、后組和抗生素組的肝組織變性細(xì)胞較多，可見出血，Bai前ASP組略輕，但3組出血壞死程度較ASP組輕，比Bai前后ASP組嚴(yán)重。Bai前后ASP組較正常組出血嚴(yán)重，正常組48h時病理表現(xiàn)與24 h類似，但Bai前后ASP組出血表現(xiàn)有所緩解。Bai前后ASP組病理切片顯示，肝組織損傷最低，提示ASP造模前后均給予黃芩的治療效果優(yōu)于其他組。見圖1、2。

3　討論

ASP是常見內(nèi)科急重癥，ASP合并的肝、腎損傷可以使死亡率由30～40％迅速上升為90％[5-7]。該病合并或伴隨肝損傷的治療效果對ASP患者的病情恢復(fù)有重要意義，包括免疫調(diào)節(jié)療法、抗分泌、抗炎、蛋白抑制等藥物療法仍是目前臨床主要的治療方法，但關(guān)于針對細(xì)胞因子的免疫性因素的治療方法尚在探討[8]。

本研究發(fā)現(xiàn)，應(yīng)用黃芩可以下調(diào)ASP患者的NF-κB活性和IL-6的水平，并使血AMY和ALT下降，促使病情改善。24和48 h時Bai前后ASP組的血AMY、IL-6、ALT和NF-κB活性僅高于正常組，而低于其他各組，病理表現(xiàn)肝組織損傷也較輕，提示在ASP發(fā)生前后應(yīng)用黃芩的效果最佳。ASP在祖國傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)中屬濕熱癥范疇，本研究中ASP大鼠處于結(jié)胸里實(shí)期，治療方案以通里攻下、活血化瘀、順氣解郁等為主，大柴胡湯合大陷胸湯療效肯定[2，9]。黃芩是大柴胡湯中的主要成分，性味苦寒，入心肺膽大腸經(jīng)，屬清熱藥，可以清熱去濕、瀉火解毒、涼血止血功能。已有研究證實(shí)，黃芩可以對抗內(nèi)毒素的活性，減輕組織損傷[10]。黃芩的主要有效成分黃芩素可以降低模型小鼠肝臟指數(shù)及血清ALT、谷草轉(zhuǎn)氨酶的活性，提高小鼠超氧化物歧化酶、谷胱甘肽過氧化物酶和過氧化氫酶的活性，起到一定程度的保護(hù)作用[11]。本研究提示，在ASP發(fā)生前后都應(yīng)用黃芩可以減輕肝、胰組織損傷。其機(jī)制可能是通過抑制NF-κB活性，降低炎癥細(xì)胞因子IL-6的含量，從而進(jìn)一步降低血AMY和ALT的濃度，起保護(hù)胰腺和肝臟功能的作用。本研究中所應(yīng)用的治療劑量（ASP前預(yù)防性給3 g黃芩/100 g體重；ASP后給予5 g黃芩/100 g體重）較為適宜。建議考慮對高血脂、高脂肪飲食、高蛋白飲食、肥胖、嗜酒等危險人群給予預(yù)防性應(yīng)用黃芩治療，但其應(yīng)用劑量要因人而異。

24和48h時，各治療組的檢測指標(biāo)低于ASP組，說明無論是預(yù)先應(yīng)用黃芩，還是ASP發(fā)生后應(yīng)用黃芩或抗生素都有一定程度的治療或者保護(hù)作用，對肝、胰組織損傷有一定的緩解。但以下3組檢測指標(biāo)的變化又有所不同：①Bai前ASP組（3 g黃芩/100 g體重）與抗生素組治療效果類似，24 h時治療效果好于Bai后ASP組（5 g黃芩/100 g體重）；②48 h時Bai前ASP組和抗生素組的血AMY、ALT和IL-6高于Bai后ASP組，肝胰損傷較Bai后ASP組嚴(yán)重，說明隨著時間推移，Bai后ASP組的治療效果逐漸提高；③48 h時Bai前、后組與抗生素ASP組的NF-κB活性比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義，說明該階段黃芩對NF-κB活性的抑制作用低于對IL-6、AMY 及ALT的影響。筆者分析認(rèn)為，給藥時間及劑量的不同導(dǎo)致黃芩對NF-κB活性、IL-6的調(diào)控不同，繼而影響AMY和ALT。因黃芩還可能通過抑制胰腺聚二磷酸-核糖聚合酶活性[12]，下調(diào)胰腺組織血管內(nèi)皮生長因子的表達(dá)[13]保護(hù)胰腺組織，降低AMY；又可以通過抗氧化[11]、預(yù)防內(nèi)毒素血癥[14]、降低肝組織線粒體SDH活性減少三磷酸腺苷生成，抑制能量代謝亢進(jìn)[15]，起到保護(hù)肝臟組織、降低ALT的作用，所以黃芩其實(shí)是在多層面、多角度參與ASP肝損傷的預(yù)防和治療作用。

綜上所述，黃芩對ASP肝損傷具有預(yù)防和治療作用。本研究就應(yīng)用劑量進(jìn)行探討并得出明確結(jié)論。由于實(shí)驗(yàn)動物比較標(biāo)準(zhǔn)化、生長環(huán)境單一、外界影響因素較小，而臨床患者地域、習(xí)俗、性別、年齡、職業(yè)等不同，ASP患者的臨床表現(xiàn)和病情也千差萬別，在臨床進(jìn)行推廣時要充分考慮患者的個體差異。

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（申海菊編輯）

Protective and treatment effects of Scutellaria baicalensis on injured hepatic tissue of rats with acute severe pancreatitis*

Qi Jin, Tian-rui Cai, Shuo Huang, Qi-yong He, Yu-hong Sun
(The First Affiliated Hospital, Jiamusi University, Jiamusi, Heilongjiang 154002, P.R.China)

Abstract:Objective To study the preventive and treatment effectsof Scutellaria baicalensis on injured hepatic tissue of rats with acute severe pancreatitis (ASP).Methods Thirty-six Sprague Dawley rats were randomly divided into normal group (normal), ASP group, Bai-pre-ASP group (using Scutellaria baicalensis before acute severe pancreatitis model), Bai-post-ASP(using Scutellaria baicalensis after acute severe pancreatitis model), Bai-pre post-ASP group (using Scutellaria baicalensis before and after acute severe pancreatitis model), and Cef-ASP group (using Cefoperazone after acute severe pancreatitis model).The blood AMY, ALT, IL-6 and nuclear factor (NF)-кB were detected 24 and 48 h after the drugs were given to the rats.The hepatic tissues were also analyzed.The effects of Scutellaria baicalensis on the procedure of acute severe pancreatitis in rats were investigated.Results The activity of AMY, ALT, IL-6 and NF-кB in the ASP group was obviously higher than other groups.Degeneration of hepatic cells, hemorrhage of central veins of hepatic lobules were apparent.The above indexes of the Bai-pre post-ASP group were higher than those of the normal group, but lower than those of other treatment groups.The treatment effect in the Bai-pre-ASP group was similar to that of the Cef-ASP group, and they were better than that of the Bai-post-ASP group in 24 h.However, they were worse than those of the Bai-post-ASP group in 48 h.Conclusions Scutellaria baicalensis has the effects of prevention and treatment on the liver injure of the rats with acute severe pancreatitis.Our research showedbook=19,ebook=24that the usage of Scutellaria baicalensis 3 g per 100 g weight before ASP and 5 g per 100 g weight after ASP is appropriate for treatment of liver injury in ASP rats.

Keywords:acute severe pancreatitis; Scutellaria baicalensis; prevention and treatment

通信作者]黃朔，E-mail：695112039@qq.com

*基金項目：黑龍江省教育廳面上項目（No：12531676）

收稿日期：2015-07-27

文章編號：1005-8982（2016）01-0018-06

中圖分類號：R657.51；R285.5

文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A