電休克影響抑郁模型大鼠認(rèn)知功能的機(jī)制研究*

劉萬(wàn)富，陳國(guó)忠，劉鴻章，劉超（.南京軍區(qū)福州總醫(yī)院麻醉科，福建福州5005；.河北大學(xué)附屬醫(yī)院胃腸外科，河北保定07000；.天津市胸科醫(yī)院麻醉科，天津00）

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電休克影響抑郁模型大鼠認(rèn)知功能的機(jī)制研究*

劉萬(wàn)富1，陳國(guó)忠1，劉鴻章2，劉超3
（1.南京軍區(qū)福州總醫(yī)院麻醉科，福建福州350025；2.河北大學(xué)附屬醫(yī)院胃腸外科，河北保定071000；3.天津市胸科醫(yī)院麻醉科，天津300222）

摘要：目的觀察不同電量和不同時(shí)程電休克（ECT）對(duì)嗅球切除抑郁模型大鼠海馬谷氨酸（Glu）濃度和Tau蛋白過(guò)度磷酸化的影響以及ECT后學(xué)習(xí)記憶能力的變化。方法建立大鼠嗅球切除抑郁模型，采用隨機(jī)單位組3×3析因設(shè)計(jì)：將每只大鼠視為1個(gè)單位，對(duì)每個(gè)單位2個(gè)處理因素，即電流因子（3水平：25、50和75mA）和時(shí)程因子（3水平：3、6和9次ECT）的所有組合（共9組，n=8）。全部ECT結(jié)束24 h內(nèi)開(kāi)始Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)，檢測(cè)實(shí)驗(yàn)大鼠海馬區(qū)的長(zhǎng)時(shí)程增強(qiáng)作用，留取海馬組織。高效液相色譜法測(cè)海馬中Glu的含量，免疫印跡法檢測(cè)p-AT8Ser202、GSK-3β1H8在海馬中的表達(dá)。結(jié)果ECT引發(fā)海馬Glu濃度升高及Tau蛋白磷酸化加劇，同時(shí)學(xué)習(xí)記憶能力相應(yīng)下降，ECT的電流和時(shí)程均可影響該過(guò)程，兩者的作用是相加的；GSK-3β是該過(guò)程信號(hào)通路的關(guān)鍵蛋白。結(jié)論ECT導(dǎo)致海馬中Glu濃度升高，從而加劇海馬Tau蛋白的磷酸化程度，導(dǎo)致學(xué)習(xí)記憶障礙。

關(guān)鍵詞：電休克；抑郁癥；微管相關(guān)蛋白；過(guò)度磷酸化；學(xué)習(xí)記憶能力

電休克（electmconrulsive therapy，ECT）后可出現(xiàn)谷氨酸（glutamic acid，Glu）信號(hào)系統(tǒng)功能異常[1]，可引起氧化應(yīng)激，導(dǎo)致海馬長(zhǎng)時(shí)程增強(qiáng)作用（longterm potentiation，LTP）飽和狀態(tài)和突觸可塑性障礙。研究發(fā)現(xiàn)，興奮性神經(jīng)傳遞系統(tǒng)的激活在應(yīng)激誘導(dǎo)的海馬Tau蛋白的磷酸化中發(fā)揮作用[2]。本研究擬通過(guò)觀察不同電量和不同時(shí)程ECT干預(yù)對(duì)嗅球切除抑郁模型大鼠認(rèn)知功能，以及海馬中Glu濃度和Tau蛋白過(guò)度磷酸化的影響，分析其分子生物學(xué)機(jī)制，以期為臨床抑郁癥治療中，減少ECT后認(rèn)知功能障礙提供理論依據(jù)和研究思路。

1　材料與方法

1.1材料

1.1.1主要試劑及儀器色譜級(jí)L-谷氨酸（L-glutamic acid，美國(guó)Sigma公司），兔抗人p-AT8Ser202單克隆抗體（美國(guó)Gene Tex公司），小鼠抗人GSK-3β1H8單克隆抗體（美國(guó)Santa Cruz Biotechnology公司），二氨基聯(lián)苯胺（Diaminobenzidine，DAB）顯色試劑盒（上海碧云天生物技術(shù)有限公司），二喹啉甲酸（bicinchoninic acid，BCA）蛋白濃度測(cè)定試劑盒（上海碧云天生物技術(shù)有限公司），HPD-25D型無(wú)油隔膜真空泵（上海魯碩實(shí)業(yè)有限公司），YDJZ-Ⅱ型醫(yī)用微型電動(dòng)磨鉆（上?；鄱麽t(yī)療器械有限公司），Harvard嚙齒類(lèi)動(dòng)物ECT儀（美國(guó)自然基因有限公司），Morris水迷宮視頻分析系統(tǒng)（北京軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院），高效液相色譜法（high performance liquid chromatography，HPLC）系統(tǒng)（美國(guó)Waters公司），蛋白電泳系統(tǒng)（美國(guó)Bio-rad公司），金盤(pán)多媒體圖像處理系統(tǒng)（成都金盤(pán)電子科大多媒體技術(shù)有限公司），光學(xué)顯微照相系統(tǒng)（Olympus-45，日本Olympus公司）。1.1.2實(shí)驗(yàn)動(dòng)物24周健康雄性SD（Sprague Dawley）大鼠，體重250～300 g，由天津醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物科學(xué)部提供。將大鼠置通風(fēng)良好、12 h明暗交替、自由飲水?dāng)z食環(huán)境，每日觸摸2 min，使其適應(yīng)實(shí)驗(yàn)室環(huán)境。適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后，建立大鼠嗅球切除抑郁模型[3]：2.75％戊巴比妥鈉（55 mg/kg）腹腔注射麻醉，在兩耳聯(lián)線(xiàn)中點(diǎn)切開(kāi)皮膚，暴露顱骨，距前囟前7～8 mm與正中縫兩側(cè)旁開(kāi)2 mm的交點(diǎn)處，用電動(dòng)磨鉆將顱骨鉆2個(gè)直徑2 mm小孔，探針攪動(dòng)破壞嗅球后，用真空泵吸出全部被破壞的嗅球組織，吸收性明膠海綿填入止血。青霉素溶液（20萬(wàn)u/ml）沖洗切口，縫合皮膚，肌內(nèi)注射青霉素鈉4萬(wàn)u/只，連續(xù)給藥3 d。術(shù)后每天撫摸大鼠并稱(chēng)重，恢復(fù)2周后進(jìn)行Open field測(cè)試，測(cè)試于上午9∶00開(kāi)始，選取72只總分為30～120的大鼠。

1.2方法

1.2.1動(dòng)物實(shí)驗(yàn)原則經(jīng)重慶醫(yī)科大學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)后進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，按美國(guó)醫(yī)學(xué)研究協(xié)會(huì)《實(shí)驗(yàn)動(dòng)物處理原則》、美國(guó)科學(xué)學(xué)會(huì)和國(guó)家衛(wèi)生研究院《實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用和處理指南》進(jìn)行，遵循雙盲原則，大鼠孤籠飼養(yǎng)。

1.2.2實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組采用隨機(jī)單位組3×3析因設(shè)計(jì)：將每只大鼠視為1個(gè)單位，每個(gè)單位設(shè)計(jì)2個(gè)處理因素，即電流因子（3水平：25、50和75 mA）和時(shí)程因子（3水平：3、6和9次ECT）的所有組合（共9組，n=8）。

1.2.3實(shí)驗(yàn)動(dòng)物干預(yù)措施通過(guò)隨機(jī)數(shù)字發(fā)生器將72只嗅球切除抑郁模型大鼠隨機(jī)分為9個(gè)實(shí)驗(yàn)組（n =8）：Ⅰ組（25 mA，3次ECT）；Ⅱ組（25 mA，6次ECT）；Ⅲ組（25 mA，9次ECT）；Ⅳ組（50 mA，3次ECT）；Ⅴ組（50 mA，6次ECT）；Ⅵ組（50 mA，9次ECT）；Ⅶ組（75 mA，3次ECT）；Ⅷ組（75 mA，6次ECT）；Ⅸ組（75 mA，9次ECT）。

1.2.4電休克處理于大鼠雙顳側(cè)安放電極，用Harvard嚙齒類(lèi)動(dòng)物ECT儀行ECT處理：方波（單個(gè)正弦半波20 ms），相應(yīng)電流（25、50和75 mA），頻率50 Hz，持續(xù)1 s電刺激，引起強(qiáng)直陣攣發(fā)作視為治療成功[4]，隔天1次，共次數(shù)（3、6和9次），于上午9∶00開(kāi)始。

1.2.5Morris水迷宮視頻分析系統(tǒng)檢測(cè)實(shí)驗(yàn)大鼠的學(xué)習(xí)記憶能力全部大鼠電休克結(jié)束24 h內(nèi)開(kāi)始Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)。Morris水迷宮被均分為Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ4個(gè)象限。訓(xùn)練前，水迷宮內(nèi)盛自來(lái)水，加墨汁使水渾濁，檢測(cè)前將平臺(tái)置Ⅰ象限水面下2 cm。實(shí)驗(yàn)在上午9∶00～下午3∶00進(jìn)行，保持室內(nèi)安靜，物品放置及燈光狀態(tài)一致，水溫（24±1）℃。Morris 1.0軟件跟蹤并記錄分析相關(guān)數(shù)據(jù)。第1～6天進(jìn)行定位航行實(shí)驗(yàn)：按逆時(shí)針?lè)较蚍謩e從Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ4個(gè)象限將大鼠面向池壁放入水中，計(jì)時(shí)120 s，檢測(cè)前將平臺(tái)置Ⅰ象限正中水面下2 cm。攝像系統(tǒng)記錄大鼠尋找并爬上平臺(tái)的時(shí)間為逃避潛伏期（escape latency，EL），若120 s內(nèi)還未找到平臺(tái)，則引導(dǎo)其至平臺(tái)，停留30 s，逃避潛伏期記120 s。檢測(cè)結(jié)束后以第1～6天逃避潛伏期的平均值作為學(xué)習(xí)成績(jī)，逃避潛伏期越短則學(xué)習(xí)能力越好。第7天進(jìn)行空間探索實(shí)驗(yàn)：撤除平臺(tái)，將大鼠從距原平臺(tái)最遠(yuǎn)的Ⅲ象限面向池壁放入水中，攝像系統(tǒng)記錄大鼠60 s內(nèi)在各象限的游泳時(shí)間，以在原平臺(tái)象限Ⅰ象限游泳時(shí)間即空間探索時(shí)間（space exploration time，SET）作為記憶成績(jī)，空間探索時(shí)間越長(zhǎng)則記憶能力越好。

1.2.6檢測(cè)實(shí)驗(yàn)大鼠海馬區(qū)的長(zhǎng)時(shí)程增強(qiáng)作用長(zhǎng)時(shí)程增強(qiáng)作用，又稱(chēng)長(zhǎng)期增益效應(yīng)，是發(fā)生在2個(gè)神經(jīng)元信號(hào)傳輸中的一種持久的增強(qiáng)現(xiàn)象，能夠同步刺激2個(gè)神經(jīng)元，與突觸可塑性能力相關(guān)，LTP是構(gòu)成學(xué)習(xí)與記憶基礎(chǔ)的主要分子機(jī)制。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用10％烏拉坦溶液腹腔麻醉（18 ml/kg），將麻醉后的大鼠頭部固定于江灣Ⅰ型立體定位儀上，暴露頭骨。刺激電機(jī)為雙極電極，由2根彼此接近但又相互絕緣的鋼絲構(gòu)成（尖端直徑約100μm、尖端相距0.3μm），插入位點(diǎn)為海馬穿通纖維角狀束（其顱骨立體定位坐標(biāo)：以人字縫為零點(diǎn)，向后7.8 mm，中線(xiàn)偏右4.4 mm，深度2.8～3.0 mm）。記錄電極為2 mol/L NaCl灌制的玻璃微電極，尖端為3～5μm，阻抗1～3 MΩ，記錄細(xì)胞外場(chǎng)電位反應(yīng)，插入位點(diǎn)是海馬齒狀回顆粒細(xì)胞層（其顱骨立體定位坐標(biāo)：人字縫向后3.8mm，中線(xiàn)偏右2.0～2.2 mm，深度2～4 mm）。記錄實(shí)驗(yàn)大鼠海馬區(qū)的LTP：選擇能產(chǎn)生最大反應(yīng)的40％幅度的刺激強(qiáng)度，觀察強(qiáng)直刺激后產(chǎn)生的增強(qiáng)效應(yīng)（產(chǎn)生LTP的刺激參數(shù)：主間隔1 s，即每隔1 s給予一串刺激，250Hz×10，波寬0.2 ms，共給予11串刺激）。

1.2.7取材海馬是與學(xué)習(xí)記憶功能密切相關(guān)，也是應(yīng)激易累及損傷的主要靶區(qū)，故將海馬作為研究區(qū)域。在Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)結(jié)束后12 h內(nèi)取大鼠海馬，取材前禁食不禁水，腹腔注射1.5 g/kg 20％氨基甲酸乙酯麻醉，快速斷頭開(kāi)顱取腦；在去焦碳酸二乙酯（diethypyrocarbonate，DEPC）冰面上吸除血跡，分離雙側(cè)海馬。左側(cè)海馬用錫箔紙標(biāo)記包裹后置于液氮過(guò)夜，置于-80℃冰箱超低溫保存，備做Western blot檢測(cè)；右側(cè)海馬稱(chēng)重，加1 ml甲醇-水離心液，低溫勻漿，取勻漿液4℃、10 000×g離心15 min，取上清液，濾膜過(guò)濾后置于-80℃冷凍保存，待測(cè)Glu含量（μg/g）。

1.2.8高效液相色譜法檢測(cè)神經(jīng)遞質(zhì)Glu在大鼠海馬組織中的含量檢測(cè)樣品：處理好的右側(cè)海馬。試劑：Glu標(biāo)準(zhǔn)品；OPA（分析純，上海碧云天生物技術(shù)有限公司），β-巰基乙醇（美國(guó)Amresco公司），甲醇（色譜級(jí)，上海碧云天生物技術(shù)有限公司）。Glu標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的建立：配制濃度分別為0.150、0.300、0.735、1.470、2.940、3.675和5.880 mg/L的Glu標(biāo)準(zhǔn)溶液，衍生化處理后測(cè)定。應(yīng)用外標(biāo)法進(jìn)行定量分析，以其峰面積（Y）對(duì)其濃度（X）進(jìn)行直線(xiàn)回歸，得到線(xiàn)性方程。海馬中Glu含量的測(cè)定：對(duì)海馬勻漿上清解凍，置入勻漿器，加入冷凍的甲酸（1 mol/L，2 ml），冰浴下手動(dòng)勻漿后，于4℃、7 000 r/min離心30 min。取上清液置于-20℃。每1 ml勻漿上清液加0.75 ml 4％碳酸氫鈉溶液混勻，44℃、3 000 r/min離心5 min，取上清液0.45μm濾膜過(guò)濾后，取24μl在進(jìn)樣瓶中加入衍生試劑12μl、四硼酸鈉緩沖液（pH=9.18）960μl，混勻，20℃靜置3 min后進(jìn)樣，梯度洗脫，測(cè)定Glu含量。

1.2.9免疫印跡法（Western blot，WB）檢測(cè)p-AT8Ser202、GSK-3β1H8在海馬中的表達(dá)在過(guò)度磷酸化位點(diǎn)中，p-AT8Ser202位點(diǎn)定位于微管結(jié)合區(qū)，其磷酸化參與調(diào)節(jié)Tau蛋白與微管的結(jié)合活性[5]，且該位點(diǎn)磷酸化程度與ECT應(yīng)激關(guān)系緊密，故以p-AT8Ser202的表達(dá)作為T(mén)au蛋白磷酸化程度標(biāo)志。取左側(cè)海馬勻漿0.2 g，提取蛋白，用BCA測(cè)定蛋白濃度，調(diào)節(jié)蛋白濃度一致。取等量樣品，用5×十二烷基硫酸鈉（sodiumdodecyl sulfate-polyacrylamidegelelec trophoresis，SDS）加樣緩沖液按1∶1（V/V）稀釋?zhuān)?00℃煮沸5min；1×SDS加樣緩沖液溶解預(yù)染蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn)混合物，100℃煮沸3 min。取待測(cè)標(biāo)本15μl上樣，[甘油醛-3-磷酸脫氫酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GRPDH）作蛋白質(zhì)上樣量標(biāo)定]，經(jīng)十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺（sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gelelectrophoresis，SDS-PAGE）電泳至預(yù)染蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn)所示目的分子量出現(xiàn)為止，濕法轉(zhuǎn)膜，50 g/L脫脂奶粉封閉3h，加入相應(yīng)抗體[兔抗人p-AT8Ser202單克隆抗體或小鼠抗人GSK-3β1H8單克隆抗體（1∶200）] 4℃孵育過(guò)夜，用相應(yīng)辣根酶標(biāo)記IgG（1∶200）37℃孵育2 h，DAB顯色，金盤(pán)多媒體圖像處理系統(tǒng)測(cè)定陽(yáng)性條帶的積分光密度值。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，對(duì)各組樣本進(jìn)行方差齊性檢驗(yàn)，經(jīng)檢驗(yàn)方差齊。各組樣本進(jìn)行析因設(shè)計(jì)，單因素方差分析各處理因素主效應(yīng)和交互效應(yīng)；單因素方差分析各處理因素單獨(dú)效應(yīng)，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2　結(jié)果

2.1ECT對(duì)大鼠Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)逃避潛伏期和空間探索時(shí)間的作用

隨著ECT電流加大，大鼠認(rèn)知障礙程度增加，即逃避潛伏期（F=544.073，P=0.000）延長(zhǎng)，空間探索時(shí)間（F=355.141，P=0.000）縮短；隨ECT干預(yù)時(shí)程延長(zhǎng)，大鼠學(xué)習(xí)記憶障礙程度增加，即逃避潛伏期（F= 73.769，P=0.000）延長(zhǎng)，空間探索時(shí)間縮短（F=42.750，P=0.000）。兩者呈相加效應(yīng)（逃避潛伏期，F(xiàn)=2.907，P =0.028；空間探索時(shí)間，F(xiàn) =5.455，P =0.001）。見(jiàn)表1、2。

表1　ECT對(duì)大鼠Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)逃避潛伏期的作用（n=8，±s）

表1　ECT對(duì)大鼠Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)逃避潛伏期的作用（n=8，±s）

注：1）主效應(yīng)的F統(tǒng)計(jì)量和P值；2）交互效應(yīng)的F統(tǒng)計(jì)量和P值

組別　3次ECT 6次ECT 9次ECT　　均值　F值　P值25 mA　21.3±4.0 28.7±4.1 35.2±4.5 28.4±7.1 21.683　0.000 50 mA　37.5±6.2 49.1±8.3 65.3±5.9 50.6±13.4 33.026　0.000 75 mA　75.3±8.5 89.0±7.3 100.5±6.6 88.3±12.7 22.629　0.000均值　44.7±23.9 55.6±26.4 67.0±27.8 55.8±27.3 73.7691）0.0001）F值　146.393　162.783　259.063　544.0731）　2.9072）P值　0.000　0.000　0.000　0.0001）　0.0282）

表2　ECT對(duì)大鼠Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)空間探索時(shí)間的作用（n=8，±s）

表2　ECT對(duì)大鼠Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)空間探索時(shí)間的作用（n=8，±s）

注：1）主效應(yīng)的F統(tǒng)計(jì)量和P值；2）交互效應(yīng)的F統(tǒng)計(jì)量和P值

組別　3次ECT 6次ECT 9次ECT　　均值　F值　P值25 mA　36.2±4.6 34.4±3.6 27.4±2.7 32.7±5.3 12.740　0.000 50 mA　24.5±2.0 18.2±3.2 13.8±3.1 18.9±5.2 29.084　0.000 75 mA　13.0±1.7 11.1±1.3 10.0±1.2 11.3±1.8　8.753　0.002均值　24.6±10.1 21.2±10.4 17.1±8.0 21.0±9.9 42.7501）0.0001）F值　116.911　138.056　108.031　355.1411）5.4552）P值　0.000　0.000　0.000　0.0001）　0.0012）

2.2ECT對(duì)抑郁模型大鼠海馬區(qū)LTP的作用

隨著ECT電流加大，大鼠認(rèn)知障礙程度增加，即LTP縮短（F=123.001，P=0.000）；隨ECT干預(yù)時(shí)程延長(zhǎng)，大鼠學(xué)習(xí)記憶障礙程度增加，即LTP縮短（F = 22.535，P=0.000）。兩者呈相加效應(yīng)（F=8.201，P= 0.001）。見(jiàn)表3。

表3　ECT對(duì)抑郁模型大鼠海馬區(qū)LTP的作用（n=8，±s）

表3　ECT對(duì)抑郁模型大鼠海馬區(qū)LTP的作用（n=8，±s）

注：1）主效應(yīng)的F統(tǒng)計(jì)量和P值；2）交互效應(yīng)的F統(tǒng)計(jì)量和P值

組別　3次ECT　6次ECT 9次ECT　　均值　F值　P值25 mA 140.6±15.6 133.6±12.2 106.4±9.2 127.0±17.9 7.392 0.000 50 mA 95.2±6.8 70.7±10.9 53.6±10.5 73.4±17.6 18.502 0.000 75 mA 60.8.0±8.5 53.7±5.9　48.8±5.1 54.5±5.6　5.443 0.001均值　98.9±33.2 88.7±30.1 69.4±28.7 89.6±29.3 22.5351）0.0001）F值　39.818　65.442　55.108　123.0011）8.2012）P值　0.000　0.000　0.000　0.0001）　0.0012）

2.3ECT對(duì)大鼠海馬組織神經(jīng)元中Glu含量的作用

隨著ECT電流加大，海馬中Glu濃度增高（F= 225.394，P=0.000）；隨ECT干預(yù)時(shí)程延長(zhǎng)，海馬中Glu濃度亦增高（F=27.446，P=0.000）。兩者呈相加效應(yīng)（F=3.088，P=0.022）。見(jiàn)表4。

2.4ECT對(duì)大鼠海馬組織神經(jīng)元中p-AT8Ser202和GSK-3β1H8蛋白的作用

隨著ECT電流加大，可增加海馬中目標(biāo)蛋白表達(dá)（p-AT8Ser202：F=211.800，P=0.000；GSK-3β1H8：F= 416.122，P=0.000）；隨ECT干預(yù)時(shí)程延長(zhǎng)，可增強(qiáng)海馬中目標(biāo)蛋白的表達(dá)（p-AT8Ser202：F=29.520，P= 0.000；GSK-3β1H8：F=41.723，P=0.000）；兩者呈相加效果，（p-AT8Ser202：F =3.728，P =0.009；GSK-3β1H8：F=2.623，P=0.043）。見(jiàn)附圖和表5、6。

表4　ECT對(duì)大鼠海馬組織神經(jīng)元中Glu含量的影響（n=8，μmol/g，±s）

表4　ECT對(duì)大鼠海馬組織神經(jīng)元中Glu含量的影響（n=8，μmol/g，±s）

注：1）主效應(yīng)的F統(tǒng)計(jì)量和P值；2）交互效應(yīng)的F統(tǒng)計(jì)量和P值

組別　3次ECT　6次ECT　9次ECT　　均值　F值　P值25 mA　50.20±7.67　54.67±7.52　65.40±7.61　56.76±9.75　8.448　0.002 50 mA　69.17±12.08　90.53±18.95　121.84±22.62　93.85±28.24　16.562　0.000 75 mA　137.81±29.78　170.93±18.77　184.39±20.86　164.38±30.15　8.240　0.002均值　85.73±42.54　105.38±51.96　123.88±52.64　104.99±51.03　27.4461）　0.0001）F值　46.699　110.803　84.633　225.3941）　3.0882）P值　0.000　0.000　0.000　0.0001）0.0222）

表5　ECT對(duì)大鼠海馬組織神經(jīng)元中p-AT8Ser202蛋白含量的影響（n=8，±s）

表5　ECT對(duì)大鼠海馬組織神經(jīng)元中p-AT8Ser202蛋白含量的影響（n=8，±s）

注：1）主效應(yīng)的F統(tǒng)計(jì)量和P值；2）交互效應(yīng)的F統(tǒng)計(jì)量和P值

組別　3次ECT　6次ECT　9次ECT　　均值　F值　P值25 mA　419.88±72.60　463.25±61.80　543.25±63.93　475.46±82.07　7.134　0.004 50 mA　663.63±120.33　801.75±130.89　1002.75±233.34　856.04±247.52　14.061　0.000 75 mA　1201.75±149.84　1475.38±254.55　1771.50±278.26　1482.88±326.50　11.834　0.000均值　761.75±352.40　913.46±459.09　1139.17±551.76　938.125±481.15　29.5201）　0.0001）F值　91.026　74.300　66.751　211.8001）　3.7282）P值　0.000　0.000　0.000　0.0001）0.0092）

表6　ECT對(duì)大鼠海馬組織神經(jīng)元中GSK-3β1H8蛋白含量的影響（n=8，±s）

表6　ECT對(duì)大鼠海馬組織神經(jīng)元中GSK-3β1H8蛋白含量的影響（n=8，±s）

注：1）主效應(yīng)的F統(tǒng)計(jì)量和P值；2）交互效應(yīng)的F統(tǒng)計(jì)量和P值

組別　3次ECT　6次ECT　9次ECT　　均值　F值　P值25 mA　452.25±61.92　561.38±47.16　706.38±86.72　573.33±124.25　28.725　0.000 50 mA　833.88±75.71　983.63±127.03　1308.75±137.51　1042.08±231.11　34.691　0.000 75 mA　1475.63±179.64　1657.88±177.98　1747.13±162.23　1626.88±201.97　5.091　0.016均值　920.58±445.86　1067.63±477.50　1254.08±453.86　1307.68±395.60　41.7231）　0.0001）F值　153.428　146.710　124.234　416.1221）　2.6232）P值　0.000　0.000　0.000　0.0001）0.0432）

附圖　ECT對(duì)大鼠海馬組織神經(jīng)元中p-AT8Ser202和GSK-3β1H8蛋白的影響

3　討論

3.1ECT與Glu及學(xué)習(xí)記憶障礙

Glu在人腦中的含量為8.4μmol/g，大約40％的突觸以谷氨酸為遞質(zhì)。Glu對(duì)神經(jīng)元的影響具有雙向作用，其適當(dāng)激動(dòng)N-甲基-D-天冬氨酸受體（N-methyl-D-aspartic acid receptor，NMDA）是保持神經(jīng)元正常傳遞信息所必需的[6]，但如果腦內(nèi)Glu釋放過(guò)多則可激活磷酸肌醇環(huán)路，破壞細(xì)胞的超微結(jié)構(gòu)，使神經(jīng)元變性或死亡，造成學(xué)習(xí)記憶障礙。應(yīng)激使海馬Glu水平明顯升高，促進(jìn)GluR過(guò)度激活，引發(fā)興奮性神經(jīng)毒性，致神經(jīng)元損傷，形成學(xué)習(xí)記憶障礙。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)ECT后海馬Glu濃度上調(diào)、海馬區(qū)LTP下降、實(shí)驗(yàn)大鼠學(xué)習(xí)和記憶功能障礙，與以往實(shí)驗(yàn)結(jié)果相同；本實(shí)驗(yàn)還發(fā)現(xiàn)，該過(guò)程與ECT的電流和時(shí)程呈正比，從而進(jìn)一步完善該推論。

3.2ECT、Glu與Tau蛋白過(guò)磷酸化

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，ECT導(dǎo)致的Glu濃度升高與Tau過(guò)度磷酸化有關(guān)，與ECT后學(xué)習(xí)記憶能力下降相關(guān)。Tau蛋白促進(jìn)軸突微管穩(wěn)定，保持微管間距離，影響軸突運(yùn)輸。其過(guò)度磷酸化可降低軸突轉(zhuǎn)運(yùn)和神經(jīng)信號(hào)傳遞障礙及突觸退化，使神經(jīng)元凋亡[7]。此外，Tau蛋白作為一種可溶性的DNA分子伴侶，發(fā)生變性或錯(cuò)誤折疊時(shí)，失去該能力。本實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，ECT后Glu在神經(jīng)元中濃度升高，該過(guò)程與ECT的電流和時(shí)程呈正比。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，ECT造成學(xué)習(xí)記憶障礙的機(jī)制很可能是通過(guò)提高Glu濃度，進(jìn)而上調(diào)Tau蛋白磷酸化程度形成。即過(guò)度磷酸化的Tau蛋白一方面降低軸突的轉(zhuǎn)運(yùn)效率，使Glu在腦內(nèi)進(jìn)一步堆積，形成惡性循環(huán)；另一方面，干擾其作為分子伴侶的作用，造成神經(jīng)元功能紊亂。

3.3Tau蛋白過(guò)磷酸化的信號(hào)傳導(dǎo)機(jī)制

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，學(xué)習(xí)記憶能力與Tau過(guò)度磷酸化有關(guān)，即Tau蛋白磷酸化程度愈高者，學(xué)習(xí)記憶能力越差。Tau蛋白過(guò)度磷酸化的外源性機(jī)制是指蛋白激酶和蛋白磷酸酶的平衡失調(diào)引起的Tau蛋白過(guò)度磷酸化。GSK-3β是一種多功能的絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，是Tau蛋白激酶，催化多個(gè)位點(diǎn)磷酸化[8-9]。Glu抑制包括蛋白激酶B（proteinkinase B，PKB）等多種蛋白激酶的活性[10]，PKB為GSK-3β的上游調(diào)節(jié)分子。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，ECT后GSK-3β1H8表達(dá)增強(qiáng)，同時(shí)磷酸化Tau蛋白p-AT8Ser202表達(dá)增強(qiáng)。故推測(cè)ECT后學(xué)習(xí)記憶障礙的分子生物學(xué)信號(hào)傳導(dǎo)途徑如下：ECT應(yīng)激導(dǎo)致Glu濃度升高→PKB活性抑制→GSK-3β表達(dá)增加、活性增強(qiáng)→Tau蛋白磷酸化程度增加。

綜上所述，推測(cè)ECT作為強(qiáng)應(yīng)激導(dǎo)致海馬Glu濃度升高，而Glu激動(dòng)離子型受體GluR，從而使PKB的活性下降，PKB對(duì)GSK-3β的抑制減弱，GSK-3β表達(dá)增加、活性增強(qiáng)，進(jìn)而強(qiáng)化海馬Tau蛋白的磷酸化程度，影響Tau外顯子10的可變剪接，降低軸突轉(zhuǎn)運(yùn)的效率，導(dǎo)致神經(jīng)信號(hào)傳遞障礙、突觸退化以及LTP抑制，甚至產(chǎn)生學(xué)習(xí)記憶障礙。此外，海馬Tau蛋白過(guò)磷酸化之后致神經(jīng)遞質(zhì)運(yùn)輸障礙，可進(jìn)一步推動(dòng)Glu在受損神經(jīng)元的積聚，形成惡性循環(huán)，加重神經(jīng)元損傷。

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（申海菊編輯）

Effect of electric shock on cognitive function in depression model rats and its mechanism*

Wan-fu Liu1, Guo-zhong Chen1, Hong-zhang Liu2, Chao Liu3
(1.Department of Anesthesiology, Fuzhou General Hospital of Nanjing Military Region, Fozhou, Fujian 350025, China; 2.Department of Gastrointestinal Surgery, the Affiliated Hospital of Hebei University, Baoding, Hebei 071000, China; 3.Departerment of Anesthesiology, Tianjin Chest Hospital, Tianjin 300222, China)

Abstract:Objective To explore the effect of the electroconvulsive shock (ECT) of different electric current and different duration on the hyperphosphorylation of tau protein and the change of the learning-memory ability in depressed rats.Methods The depression rat model was established by removing olfactory bulbs.As the analysis of variance of factorial design, two intervention factors were set up which were the electric current groups (three levels: 25, 50 and 75 mA) and the duration groups (three levels: 3, 3 and 9 times electroconvulsive shock).Fifty-four adult depression model rats were randomly divided into 9 experimental groups (6 in each group).The morris water maze test started within 1 day after the course of electroconvulsive shock in order to evaluate learning-memory.The long-term potentiation was detected in the hippocampus of rats.The hippocampus was removed from rats within 1 day after the morris water maze test was finished.The content of glutamate in the hippocampus of rats was detected by the high performance liquid chromatography and the content of tau protein including p-AT8Ser202and GSK-3β1H8in the hippocampus of rats was determined by Western blot.Results The electroconvulsive shock of different electric current and of different duration significantly up-regulated the content of glutamate and accelerated the hyperphosphorylation of tau protein and im－book=6,ebook=11paired learning-memory in depressed rats, with the performance of extending the evasive latency time and shortening the space exploration time in the depression model rats.The changes were correlated with the electric current and the duration of time of the electroconvulsive shock.GSK-3β was the key protein in this signaling pathway.Conclusions The results indicate that the electroconvulsive shock induces the impairment of learning-memory ability and the hyperphosphorylation of tau protein in depressed rats through up-regulated content of glutamate.

Keywords:electroconvulsive therapy; depression; tau protein; hyperphosphorylation; learning-memory ability

[通信作者]劉鴻章，E-mail：18931200299@189.com；Tel：18931200299

*基金項(xiàng)目：中國(guó)博士后科學(xué)基金（No：2013M530880）

收稿日期：2015-02-10

文章編號(hào)：1005-8982（2016）01-0005-06

中圖分類(lèi)號(hào)：R749.054；R614.24

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A