基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時(shí)間質(zhì)譜在真菌快速鑒定中的應(yīng)用

王　歡，曲　芬

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·導(dǎo)向與述評(píng)·

基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時(shí)間質(zhì)譜在真菌快速鑒定中的應(yīng)用

王歡，曲芬

［摘要］真菌是廣泛分布于自然界的真核生物，對(duì)人類具有致病性的約300種。不同種真菌的生長(zhǎng)特性、臨床特點(diǎn)及耐藥性不同。真菌生長(zhǎng)緩慢，傳統(tǒng)的培養(yǎng)鑒定方法所需時(shí)間較長(zhǎng)，且日益多樣化的真菌，使鑒定難度不斷增加，這些均限制了臨床的早期診斷和針對(duì)性治療?；|(zhì)輔助激光解吸電離飛行時(shí)間質(zhì)譜（matrix-assisted laser desorption ionization-time of flight mass spectrometry， MALDI-TOF MS）是一種新興的診斷技術(shù)，可以通過直接檢測(cè)生物標(biāo)志物（蛋白）來鑒定病毒、細(xì)菌、分枝桿菌等，具有操作簡(jiǎn)便、快速、準(zhǔn)確率高、成本低的特點(diǎn)。本文對(duì)MALDI-TOF MS在真菌鑒定中的應(yīng)用進(jìn)行綜述，發(fā)現(xiàn)其對(duì)酵母樣真菌的正確鑒定率可達(dá)到94％以上，絲狀真菌正確鑒定率也可達(dá)到89％，可滿足臨床實(shí)驗(yàn)室鑒定真菌的需求。

［關(guān)鍵詞］光譜法，質(zhì)量，基質(zhì)輔助激光解吸電離；真菌；感染

DOI∶ 10.3969/j.issn.1007-8134.2016.03.002

近年來，隨著廣譜抗菌藥物的廣泛應(yīng)用，器官移植和導(dǎo)管技術(shù)的開展，以及腫瘤患者和接受免疫抑制藥物治療的患者逐年增多，真菌（如假絲酵母菌屬、隱球菌屬和曲霉菌屬等）感染成為危及這類患者生命的主要因素。全球每年約有7280萬假絲酵母菌感染病例，在美國(guó)假絲酵母菌屬是引起醫(yī)源性血流感染的第4大常見病原菌；其中白假絲酵母菌成為最重要的致病真菌［1］。目前，已知有100余種酵母樣真菌確定為人類病原體，并在幾乎所有的人身體部位被分離出來。真菌的特點(diǎn)是培養(yǎng)生長(zhǎng)緩慢，實(shí)驗(yàn)室常規(guī)鑒定和藥物敏感性（藥敏）實(shí)驗(yàn)時(shí)間長(zhǎng)，對(duì)臨床的早期診斷和治療造成困難，導(dǎo)致真菌感染的病死率升高［2］。早期、快速、準(zhǔn)確地診斷真菌感染是臨床及時(shí)救治真菌感染的關(guān)鍵［3］。然而，日益多樣化的真菌使鑒定真菌病原體難度不斷增加，常規(guī)鑒定方法的鑒定能力已顯不足，尤其對(duì)不常見的真菌，結(jié)果有時(shí)還不確定［1］。

基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時(shí)間質(zhì)譜（matrix-assisted laser desorption ionization-time of flight mass spectrometry， MALDI-TOF MS）是近年快速發(fā)展起來的一種新型軟電離生物質(zhì)譜，具有強(qiáng)大的鑒定能力。自2009年開始用于真菌的鑒定［1］，具有操作簡(jiǎn)便、鑒定迅速、準(zhǔn)確率高和成本低的特點(diǎn)，可替代微生物實(shí)驗(yàn)室對(duì)真菌的常規(guī)檢測(cè)方法［4-8］。本文就MALDI-TOF MS在真菌鑒定和真菌藥敏檢測(cè)方面的應(yīng)用進(jìn)行綜述。

1　MALDI-TOF MS的檢測(cè)原理

MALDI-TOF MS主要由2部分組成——基質(zhì)輔助激光解吸電離離子源（matrix-assisted laser desorption ionization， MALDI）和飛行時(shí)間質(zhì)量分析器（time of flight， TOF）。MALDI的原理是用激光照射樣品與基質(zhì)形成的共結(jié)晶薄膜，基質(zhì)從激光中吸收能量傳遞給生物分子，而電離過程中將質(zhì)子轉(zhuǎn)移到生物分子或從生物分子得到質(zhì)子，使生物分子電離的過程。因此，它是一種軟電離技術(shù)，適用于混合物及生物大分子的測(cè)定。TOF的原理是離子在電場(chǎng)作用下加速飛過飛行管道，根據(jù)到達(dá)檢測(cè)器的飛行時(shí)間不同，測(cè)定離子的質(zhì)荷比（M/Z）。不同菌的蛋白表達(dá)不同，通過MALDI-TOF MS得到的蛋白質(zhì)圖譜也不同，將待測(cè)菌的蛋白質(zhì)圖譜與數(shù)據(jù)庫中的進(jìn)行比對(duì)，根據(jù)圖譜的匹配度，得出鑒定結(jié)果和相應(yīng)的鑒定分值，分值越高，匹配度越好，結(jié)果越可信。

2　MALDI-TOF MS在真菌鑒定中的應(yīng)用

2.1MALDI-TOF MS在酵母樣真菌鑒定中的應(yīng)用對(duì)酵母樣真菌臨床上常用的鑒定方法有科瑪嘉顯色培養(yǎng)法以及VITEK 2和API ID 32C鑒定法。這些方法對(duì)常見真菌（白假絲酵母菌、克柔假絲酵母菌、光滑假絲酵母菌和熱帶假絲酵母菌）的鑒定正確率可以達(dá)到92％～96％［9］，但鑒定種類有限，耗時(shí)達(dá)24～72 h，成本高，對(duì)某些酵母菌鑒定準(zhǔn)確度差。例如，這些方法不能將近平滑假絲酵母菌與擬平滑假絲酵母菌和似平滑假絲酵母菌區(qū)分開，同樣不能把光滑假絲酵母菌與Candida bracarensis和Candida nivariensis區(qū)分開［10］。國(guó)外的快速膠乳凝集測(cè)定，雖然快速、精確，但也只能鑒定若干種，而且步驟復(fù)雜、價(jià)格昂貴［11］。分子生物學(xué)測(cè)序是鑒定的“金標(biāo)準(zhǔn)”［9，12-13］，但實(shí)驗(yàn)對(duì)人員、環(huán)境和設(shè)備要求高，鑒定周期長(zhǎng)，價(jià)格高，并且存在環(huán)境污染的高風(fēng)險(xiǎn)，不能用作實(shí)驗(yàn)室的常規(guī)檢測(cè)［13］。

2009年Marklein等［1］第1次用MALDI-TOF MS對(duì)250株假絲酵母菌進(jìn)行了鑒定研究。采用Microflex質(zhì)譜儀（Bruker Daltonics 公司，德國(guó)）和FlexControl 3.0軟件，單株菌的鑒定只需10 min，3 h可以完成96株菌的檢測(cè)。分別采用MALDI Biotyper軟件的1.1和2.0版本同時(shí)進(jìn)行分析，得到了96％的鑒定正確率，共正確鑒定14種酵母菌（白假絲酵母菌、光滑假絲酵母菌、熱帶假絲酵母菌、克柔假絲酵母菌、近平滑假絲酵母菌、乳酒假絲酵母菌、葡萄牙假絲酵母菌、挪威假絲酵母菌、皺褶假絲酵母菌、都柏林假絲酵母菌、解脂假絲酵母菌、西弗假絲酵母菌、菌膜假絲酵母菌和季也蒙假絲酵母菌）。由于數(shù)據(jù)庫中沒有挪威假絲酵母菌、皺褶假絲酵母菌、都柏林假絲酵母菌和西弗假絲酵母菌相應(yīng)的圖譜，這幾種菌沒有被正確鑒定。2010年Stevenson等［14］報(bào)道MALDI Biotyper軟件的2.0.4版本對(duì)所研究的194株假絲酵母菌鑒定正確率達(dá)99％，且這些菌種圖譜都囊括在數(shù)據(jù)庫中。

2011年Seyfarth等［15］將采用MALDI-TOF MS 和API ID 32C對(duì)酵母樣真菌鑒定的結(jié)果進(jìn)行比對(duì)，并用分子生物學(xué)測(cè)序方法進(jìn)行驗(yàn)證，結(jié)果顯示MALDI-TOF MS的鑒定正確率為94.0％，API ID 32C的鑒定正確率為84.3％。采用MALDI-TOF MS鑒定克柔假絲酵母菌全部正確，而API ID 32C則把克柔假絲酵母菌鑒定為挪威假絲酵母菌、熱帶假絲酵母菌等其他假絲酵母菌。Marklein等［1］也曾對(duì)250余株酵母樣真菌做了同樣的比對(duì)實(shí)驗(yàn)，結(jié)果顯示API ID 32C的鑒定正確率為93.6％，MALDITOF MS的鑒定正確率達(dá)到98.0％，與Seyfarth等［15］的結(jié)果略有差異。Yaman等［16］采用MALDI-TOF MS和VITEK 2對(duì)281株從血培養(yǎng)中分離出的酵母樣真菌進(jìn)行鑒定，經(jīng)比對(duì)二者94％的結(jié)果一致，對(duì)不一致的結(jié)果進(jìn)行了分子生物學(xué)鑒定，其結(jié)果與MALDI-TOF MS鑒定結(jié)果相同，MALDI-TOF MS對(duì)菌屬的鑒定正確率達(dá)到了100％。國(guó)內(nèi)也有類似的研究，靳穎等［17］采用同樣的比對(duì)方法對(duì)150株酵母樣真菌進(jìn)行鑒定，MALDI-TOF MS鑒定正確率在屬水平上為100％，種水平上為94％，與國(guó)外報(bào)道一致。

Westblade等［18］采取直接將菌株點(diǎn)靶，在上面覆蓋甲酸的方法，對(duì)852株菌共31個(gè)種進(jìn)行評(píng)價(jià)，其中包括20種626株假絲酵母菌，35株新型隱球菌和191株其他酵母樣真菌，比對(duì)“金標(biāo)準(zhǔn)”采用26S rRNA序列分析。結(jié)果顯示823株（96.6％）在屬的水平鑒定正確，819株（96.1％）在種的水平鑒定正確。24株（2.8％）沒有查明，5株（0.6％）被錯(cuò)誤鑒定。其中1株白假絲酵母菌被錯(cuò)誤鑒定為都柏林假絲酵母菌，1株近平滑假絲酵母菌被錯(cuò)誤鑒定為菌膜假絲酵母。研究者還對(duì)不同種的假絲酵母菌的鑒定正確率進(jìn)行了統(tǒng)計(jì)，白假絲酵母菌為98.3％，都柏林假絲酵母菌為100％，無名假絲酵母菌為96.6％，光滑假絲酵母菌為100％，季也蒙假絲酵母菌為97.2％，希木龍假絲酵母菌為100％，平常假絲酵母菌為100％，中間假絲酵母菌為100％，乳酒假絲酵母菌為100％，克柔假絲酵母菌為100％，郎比可假絲酵母菌為100％，解脂假絲酵母菌為100％，葡萄牙假絲酵母菌為87.9％，挪威假絲酵母菌為96.7％，近平滑假絲酵母菌為98.6％，菌膜假絲酵母菌為100％，皺褶假絲酵母菌為100％，熱帶假絲酵母菌為90.7％，產(chǎn)朊假絲酵母菌為100％，誕沫假絲酵母菌為100％。其他酵母樣真菌鑒定正確率分別為新型隱球菌100％，奧默柯達(dá)菌90.9％，糠秕馬拉色菌85.7％，粘質(zhì)紅酵母菌100％，阿氏絲孢酵母菌93.8％，粘性絲孢酵母菌88.9％。

近年來研究發(fā)現(xiàn)近平滑假絲酵母菌通過基因分型可以分為近平滑假絲酵母菌、似平滑假絲酵母菌和擬平滑假絲酵母菌3個(gè)組，3者之間對(duì)藥物的敏感性存在差異，特別是對(duì)棘白菌素類抗真菌藥［19-20］。這表明物種鑒定可能對(duì)治療產(chǎn)生影響。Quiles-Melero等［21］對(duì)77株臨床分離的近平滑假絲酵母菌復(fù)合群進(jìn)行了MALDI-TOF MS分型，并用分子生物學(xué)方法進(jìn)行驗(yàn)證，符合率為100％。這表明通過MALDI-TOF MS可以對(duì)近平滑假絲酵母菌復(fù)合群進(jìn)行準(zhǔn)確的種內(nèi)分型，更好地指導(dǎo)臨床用藥。

2.2MALDI-TOF MS在絲狀真菌鑒定中的應(yīng)用絲狀真菌感染常侵犯免疫功能低下的患者，特別是進(jìn)行化療、激素治療或造血干細(xì)胞移植中性粒細(xì)胞減少的患者，其他有感染風(fēng)險(xiǎn)的是糖尿病、惡性血液病、人器官移植或大面積燒傷的患者以及HIV感染者［22-23］。臨床實(shí)驗(yàn)室對(duì)絲狀真菌一直是依靠培養(yǎng)后鏡下觀察其形態(tài)特點(diǎn)和產(chǎn)孢方式，并結(jié)合菌落生長(zhǎng)的形態(tài)和顏色等鑒定，這需要檢驗(yàn)人員有豐富的絲狀真菌鑒定經(jīng)驗(yàn)。絲狀真菌培養(yǎng)通常需要72 h以上才能呈現(xiàn)較明顯的菌落特點(diǎn)，如果鏡下不能確定，再經(jīng)過測(cè)序鑒定，往往要耗費(fèi)7 d左右的時(shí)間，患者往往已經(jīng)錯(cuò)過了最佳治療時(shí)間。

國(guó)外有實(shí)驗(yàn)室嘗試用MALDI-TOF MS對(duì)絲狀真菌進(jìn)行鑒定。Ranque等［9］選取了58種共625株絲狀真菌，應(yīng)用傳統(tǒng)的方法和MALDI-TOF MS同時(shí)鑒定，并用測(cè)序方法進(jìn)行確認(rèn)，鑒定正確率分別為80％和89％。對(duì)非曲霉菌類的絲狀真菌，MALDI-TOF MS的鑒定能力較傳統(tǒng)方法提高了31％～61％。研究表明，MALDI-TOF MS對(duì)曲霉菌、青霉菌、毛癬菌、鐮刀菌、木霉和毛霉目這幾種絲狀真菌鑒定效果較好。也有文獻(xiàn)報(bào)道，MALDI-TOF MS對(duì)曲霉菌的鑒定正確率可以達(dá)到98.4％［24］。

Hettick等［25-26］分別選取了12種曲霉菌和12種青霉菌進(jìn)行研究，屬的鑒定正確率均達(dá)到了100％，種的鑒定正確率為95％。也有研究者使用MALDI-TOF MS成功識(shí)別了6種青霉屬菌株［27］。

國(guó)內(nèi)鮮有應(yīng)用MALDI-TOF MS對(duì)絲狀真菌鑒定的報(bào)道。絲狀真菌因其蛋白提取困難，目前沒有規(guī)范的提取操作規(guī)程，且MALDI-TOF MS的數(shù)據(jù)庫中相關(guān)圖譜有限，所以其對(duì)絲狀真菌的鑒定能力與對(duì)酵母樣真菌的鑒定相比稍顯遜色，還須不斷擴(kuò)充新的圖譜數(shù)據(jù)庫，優(yōu)化統(tǒng)一操作，以增強(qiáng)鑒定絲狀真菌的能力。

2.3MALDI-TOF MS對(duì)真菌藥敏檢測(cè)的研究真菌感染的增加使其耐藥性呈現(xiàn)上升趨勢(shì)，尤其是酵母樣真菌對(duì)治療中常用到的氟康唑的耐藥率達(dá)到19.66％［28］。Marinach等［29］用MALDI-TOF MS檢測(cè)白假絲酵母菌對(duì)氟康唑的敏感性。將氟康唑的藥物濃度連續(xù)稀釋，從128 mg/ml到0.125 mg/ml，并將不同濃度的氟康唑和白假絲酵母菌進(jìn)行15 h的混合培養(yǎng)，經(jīng)過處理萃取后，通過MALDI-TOF MS分析上清液得到圖譜，圖譜發(fā)生改變的最低藥物濃度稱為最小剖面變化濃度。將最小剖面變化濃度與臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化協(xié)會(huì)的最小抑菌濃度值進(jìn)行比對(duì)，發(fā)現(xiàn)1個(gè)稀釋度內(nèi)的結(jié)果一致率為94％。MALDI-TOF MS對(duì)真菌藥敏檢測(cè)的研究還在起步階段，將來有可能替代現(xiàn)有的藥敏檢測(cè)方法，得到快速準(zhǔn)確的藥敏結(jié)果。

3　MALDI-TOF MS在真菌鑒定中的應(yīng)用前景

MALDI-TOF MS檢測(cè)真菌穩(wěn)定性較強(qiáng)、重復(fù)性好、操作簡(jiǎn)便快速、成本低、鑒定種類多且結(jié)果準(zhǔn)確，是臨床實(shí)驗(yàn)室鑒定真菌的一種快速、可靠的方法［16］，大大縮短了臨床微生物實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)真菌的報(bào)告時(shí)間。對(duì)于絲狀真菌的蛋白提取方法，目前尚無統(tǒng)一的操作規(guī)范，所以MALDI-TOF MS對(duì)絲狀真菌的鑒定能力還有待進(jìn)一步研究。應(yīng)用中發(fā)現(xiàn)，MALDI-TOF MS的絲狀真菌數(shù)據(jù)庫中，還有很多菌種的圖譜沒有包含，這也為實(shí)驗(yàn)室提供了更大的拓展空間，實(shí)驗(yàn)室可以根據(jù)自身的特點(diǎn)，建立個(gè)性化的數(shù)據(jù)庫，提高檢測(cè)效率和準(zhǔn)確性［30］。MALDITOF MS以其諸多的優(yōu)點(diǎn)，逐漸替代微生物實(shí)驗(yàn)室鑒定真菌的傳統(tǒng)方法。MALDI-TOF MS檢測(cè)真菌藥敏的研究，將為準(zhǔn)確、合理地應(yīng)用抗真菌藥物治療臨床真菌感染提供快速、有力的依據(jù)［31］。

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（2015-11-04收稿 2016-01-21修回）

（責(zé)任編委 李 軍 本文編輯 王 姝）

［文獻(xiàn)標(biāo)志碼］［中國(guó)圖書資料分類號(hào)］ R379 A

［文章編號(hào)］1007-8134（2016）03-0129-04

*Corresponding author， E-mail： qf302@163.com

［基金項(xiàng)目］首都衛(wèi)生發(fā)展科研專項(xiàng)基金（2011-4001-09）

［作者單位］100039 北京，解放軍第三〇二醫(yī)院臨床檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)中心（王歡、曲芬）

［通訊作者］曲芬，E-mail∶ qf302@163.com

Matrix-assisted laser desorption ionization-time of flight mass spectrometry for rapid identification of fungi

WANG Huan， QU Fen*
Clinical Laboratory Center， 302 Military Hospital of China， Beijing 100039， China

［Abstract］Fungi are widely distributed in nature， and about 300 species of fungi are pathogenic to humans with different growth characteristics， clinical features and drug resistance. As fungi are slowly growing microorganisms， the culture and identification of fungi by conventional methods are time-consuming. In addition， the increasing diversity of fungal pathogens makes the identification more difficult. All these restrict the early diagnosis and targeted therapies. Matrix-assisted laser desorption ionization-time of flight mass spectrometry （MALDI-TOF MS） is an emerging diagnostic technique in recent years， which can identify viruses， bacteria， mycobacteria and so on through direct detection of biomarkers （proteins）. It is a simple and fast diagnostic method with high accuracy and low cost. This review focuses on the identification of fungi by MALDI-TOF MS. Studies have shown that correct identification by MALDI-TOF MS is observed in more than 94％ of yeast-like fungi， and 89％ of filamentous fungi. Therefore， MALDI-TOF MS proves to meet the demand for the identification of fungi in clinical laboratory.

［Key words］spectrometry， mass， matrix-assisted laser desorption-ionization； fungi； infection