春季野菜中維生素C和氨基酸含量的測定

趙志強 徐英嵐 方 杰 鄭曉冬北京農(nóng)業(yè)職業(yè)學院 北京 102442

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春季野菜中維生素C和氨基酸含量的測定

趙志強 徐英嵐 方 杰 鄭曉冬
北京農(nóng)業(yè)職業(yè)學院 北京 102442

摘 要：對春季在田野中生長的野菜的維生素C及氨基酸含量進行測定。方法：2、4－二硝基苯肼比色法；高效液相色譜法。結(jié)果：維生素C的測定方法操作簡單、準確、精密度高，適用于蔬菜、水果中維生素C含量的測定；氨基酸含量的測定方法樣品處理簡單、準確、精密度高，適用于蔬菜、飼料中游離氨基酸的測定。

關(guān)鍵詞：野菜；維生素C；氨基酸；2，4－二硝基苯肼比色法；高效液相色譜法

野菜中含有豐富的蛋白質(zhì)、糖、維生素、無機鹽及食用纖維等營養(yǎng)物質(zhì)，且污染較少，食用價值很高。維生素C即抗壞血酸，一種能防治壞血病的水溶性維生素，在新鮮的水果蔬菜中含量豐富，人體自身不能合成。氨基酸為蛋白質(zhì)的基本組成單位，蛋白水解后的氨基酸常見的為20余種，其中8種為必需氨基酸，他們在人體內(nèi)不能合成，必須由膳食供給。筆者選擇苦荬菜、苦苣菜、桔梗等數(shù)種野菜，采用2，4－二硝基苯肼法測定這些野菜中維生素C的含量；采用高效液相色譜法測定野菜中氨基酸的含量。

1 2，4－二硝基苯肼法測定維生素C的含量

1.1 原理

總抗壞血酸包括還原型、脫氫型和二酮古樂糖酸。樣品中還原型抗壞血酸經(jīng)活性炭氧化為脫氫抗壞血酸，再與2，4－二硝基苯肼作用生成紅色脎，脎的含量與總抗壞血酸含量成正比，進行比色測定。

1.2 儀器

恒溫箱：37±0.5℃，可見-紫外分光光度計，勻漿機，離心機：3000 r／min。

1.3 樣品與試劑

維生素C純品購自SIGMA公司，各種野菜樣品均采自校園田野，所用各種試劑均為分析純，用水均為去離子水。

1.4 實驗方法與結(jié)果

1.4.1 樣品溶液的制備

野菜樣品經(jīng)勻漿機打碎后，取10 g～30 g，用草酸溶液定容在100 ml容量瓶中。離心，取上清液，過濾，濾液中加入活性炭，氧化脫色，再過濾，棄取初濾液。濾液置于比色管中，加入2，4－二硝基苯肼溶液，于恒溫箱中（37±0.5℃）恒溫3小時，然后加入85%濃硫酸，于室溫放置30分鐘顯色，待上機測定。

1.4.2 檢測波長的選擇

以草酸溶解維生素C純品，在400 nm～600 nm波長范圍掃描測定，結(jié)果在508 nm處有最大吸收，選定508 nm為檢測波長，如圖1所示。

圖1 維生素C純品的吸收光譜

1.4.3 線性關(guān)系

精密稱取抗壞血酸純品,加草酸溶解得20 μg/ml純品溶液。稱取純品溶液5，10，20，30，40，50，60 ml，分別置于100 ml容量瓶中，用1%硫脲溶液稀釋至刻度，使最后稀釋液中抗壞血酸的濃度分別為1，2，4，6，8，10，12 μg/ml。在505 nm波長處測定吸光度。以純品濃度(μg/ml)為自變量，求得回歸方程：

y=0.021x+0.0053 r = 0.9998

在1 μg/ml～12 μg/ml線性關(guān)系良好。

1.4.4 精密度實驗

取各種野菜樣品，按4.1步驟操作，每種樣品取三組，平行測定，計算相對偏差，相對偏差均小于5%，符合測定要求。

1.4.5 樣品含量測定

取各種野菜樣品，按4.1步驟操作，測定各種野菜中維生素C的含量，結(jié)果見表1。

表1 樣品測定結(jié)果(n=3)

1.5 結(jié)果討論

(1)大多數(shù)植物組織內(nèi)含有一種能破壞抗壞血酸的氧化酶，因此，抗壞血酸的測定應(yīng)采用新鮮樣品并盡快用草酸提取液將樣品制成勻漿以保存維生素C。

(2)活性炭可將抗壞血酸氧化為脫氫抗壞血酸，但它也有吸附抗壞血酸的作用，故活性炭用量應(yīng)適當與準確，所以，應(yīng)用天平稱量。實驗結(jié)果證明，用2 g活性炭能使測定樣品中還原型抗壞血酸完全氧化為脫氫型，其吸附影響不明顯。

(3)若溶液中含有糖，硫酸加得太快，溶解熱會使溶液變黑。

(4)該方法操作簡單、準確、精密度高，適用于蔬菜、水果中維生素C含量的測定。

2 高效液相色譜法測定野菜中氨基酸的含量

2.1 原理

野菜經(jīng)超聲波提取后，溶解在弱酸中，離心過濾后，加入衍生試劑衍生化用高效液相色譜儀測定，紫外檢測器檢測。

2.2 儀器與試劑

2.2.1 儀器

Waters 1525 高效液相色譜儀，2487紫外吸收檢測器，超聲波清洗機，低速離心機。

2.2.2 試劑

氨基酸標準品購自Waters公司，含有17種常見氨基酸，依次為天冬氨酸、絲氨酸、谷氨酸、甘氨酸、組氨酸、精氨酸、蘇氨酸、丙氨酸、脯氨酸、胱氨酸、酪氨酸、纈氨酸、蛋氨酸、賴氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸。

乙腈為色譜純，水為超純水。

2.3 色譜條件色譜柱：Waters Accq·Tag氨基酸分析專用柱，

4 μm，3.9 mm×150 mm;流動相：A為磷酸緩沖液；

B為乙腈－水（60:40）；流速：1 mL·min-1;檢測波長248 nm;柱溫：37℃；梯度淋洗表見表2。

表2 梯度淋洗表

2.4 實驗方法與結(jié)果

2.4.1 標準曲線實驗

氨基酸標準品的濃度為2.5 μmol/mL,加水稀釋十倍后，濃度為0.25 μmol/mL,加入衍生試劑衍生化反應(yīng)后，分別進樣5 μL，10 μL，15 μL，20 μL，記錄峰面積，以峰面積對濃度（μmol/mL）進行線性回歸，得氨基酸各回歸方程，各相關(guān)系數(shù)r 均在0.996～0.999之間，以天冬氨酸和精氨酸的回歸方程為例：

天冬氨酸 Y=33.6X-3.73 r=0.997

精氨酸 Y=4.68X-1.30 r=0.998

2.4.2 精密度實驗

分別取苦荬菜、桔梗、苦苣菜等幾種野菜2 g～3 g,精密稱定，置三角瓶中，再加0.1 mol/L Hcl約30 mL，于超聲波清洗器中提取15分鐘，離心，取上清液，定容于100 mL容量瓶中，加衍生化試劑反應(yīng)后，分別取10 μL各種樣品上機測定，每種樣品平行測定三次，計算精密度，見表3。

表3 樣品精密度實驗結(jié)果

2.4.3 樣品測定

按照精密度實驗的方法處理樣品，分別取10 μL各種樣品上機測定，計算野菜中各種氨基酸的含量，結(jié)果見表4。

表4 樣品中氨基酸含量測定結(jié)果

( *代表該氨基酸在此種野菜中未檢出)

2.4.4 色譜圖

氨基酸標準品的色譜圖如圖2所示，野菜樣品的色譜圖如圖3所示。

圖2 氨基酸標準品的色譜圖

圖3 苦苣菜的氨基酸色譜圖

2.5 討論

(1)該方法處理簡單、準確、精密度高，適用于蔬菜、飼料中游離氨基酸的測定。

(2)樣品中的氨基酸只有加入衍生試劑衍生化后，才能被紫外吸收檢測器檢測出來。該衍生試劑為Waters公司專利衍生試劑，衍生化過程操作簡單，衍生后樣品穩(wěn)定時間長，達一周以上。

(3)由表4可知，幾種野菜中氨基酸的分布和含量差別很大，費菜中含有的氨基酸最廣泛，丙氨酸（Ala）在幾種野菜中都被檢測出，桔梗中的丙氨酸（Ala）含量和苦苣菜中的絲氨酸（Ser）含量達到了2.0 nmol以上。

參考文獻

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職業(yè)技能大賽提升教學質(zhì)量專題

The Determination of Vitamin C and Amino Acids Content in Spring Potherb

Zhao Zhiqiang, Xu Yinglan, Fang Jie, Zheng Xiaodong
Beijing Vocational College of Agriculture, Beijing, 102442, China

Abstract:In spring, for the potherb growing in field, we determinate the vitamin C and amino acids content. The methods are 2, 4-dinitrophenylhydrazine colorimetry and high efficiency liquid chromatography, and we obtain that the method on determinating vitamin C is easy operation, accurate and high precision, and it is applicable in determinating vitamin C in vegetables and fruits. Further, the method on determinating amino acids content is easy to handle sample, accurate, high precision, and it is applicable in determining dissociate amino acids in vegetables and fodder.

Keywords:potherb; vitamin C; amino acids; 2, 4-dinitrophenylhydrazine colorimetry; high efficiency liquid chromatography

作者簡介：趙志強，本科，實驗師。

收稿日期：2015-10-31