薯蕷皂苷對大鼠心肌收縮力影響的研究

韓　鈺，楊　帆，叢恬駪，孫　凱，李　燕，康　毅，尹永強(qiáng)，婁建石

(天津醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院藥理學(xué)教研室，天津　300070)

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薯蕷皂苷對大鼠心肌收縮力影響的研究

韓鈺，楊帆，叢恬駪，孫凱，李燕，康毅，尹永強(qiáng)，婁建石

(天津醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院藥理學(xué)教研室，天津300070)

中國圖書分類號：R-332；R284.1；R322.11；R331.31

摘要：目的觀察薯蕷皂苷(dioscin，Dio)對大鼠心肌收縮力的影響。方法采用 Langendorff 逆行主動(dòng)脈灌流法對大鼠離體心臟進(jìn)行灌流，利用壓力感受器插管法測定左心室相關(guān)心功能參數(shù)，記錄低、中和高3個(gè)濃度Dio對左心室收縮壓(LVSP)、左心室舒張末期壓(LVEDP)、左心室內(nèi)壓最大上升/下降速率(±dp/dtmax)的影響。利用激光共聚焦顯微鏡觀察Dio對H9c2細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度的影響，并利用多功能酶標(biāo)儀觀察藥物對細(xì)胞線粒體膜電位的影響。結(jié)果0.1、1 μmol·L-1Dio可明顯增加LVSP，由(11.55±0.52)、(10.53±0.28) kPa分別增加至(13.08±0.72)、(12.53±0.64) kPa(P<0.01)；增加+dp/dtmax由(0.38±0.10)、(0.40±0.07) kPa·ms-1分別增加至(0.42±0.11)、(0.43±0.02) kPa·ms-1(P<0.05)。10 μmol·L-1Dio則使LVSP由(12.13±0.33) kPa減至(9.46±0.77) kPa(P<0.01)，使+dp/dtmax由(0.42±0.04) kPa·ms-1降為(0.24±0.04) kPa·ms-1(P<0.01)。0.1、1、10 μmol·L-1的Dio可使H9c2細(xì)胞中Ca2+相對熒光強(qiáng)度由(16.62±0.89)分別增加至(21.48±0.80)、(25.68±0.69)和(19.84±0.66)(P<0.01)。0.1、1 μmol·L-1Dio對H9c2細(xì)胞線粒體膜電位無明顯影響，而10 μmol·L-1Dio會使JC-1單體與聚合物的比值由(1.14±0.03)增加為(1.35±0.06)(P<0.01)，即引起線粒體膜電位下降。結(jié)論低、中濃度Dio可增加LVSP和+dp/dtmax，表現(xiàn)正性肌力作用，機(jī)制為增加細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度。并且，其在增加細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度的同時(shí)并不會引起鈣超載，僅高濃度出現(xiàn)。

關(guān)鍵詞：薯蕷皂苷；Ca2+濃度；正性肌力作用；離子通道；鈉鈣交換體；左心室收縮壓

心力衰竭在臨床上可分為急性心力衰竭和慢性心力衰竭[1]，嚴(yán)重時(shí)可導(dǎo)致意識模糊甚至昏迷，并最終產(chǎn)生心源性休克。同時(shí)，心衰所致的電生理重構(gòu)往往造成心肌動(dòng)作電位時(shí)程延長[2-4]，繼而延長QT間期，這又會增加惡性心律失常發(fā)生的風(fēng)險(xiǎn)而誘發(fā)猝死等。故隨著人們對其危害性的普遍認(rèn)知，心衰的防治策略越來越受矚目。目前，臨床上心衰的治療主要是應(yīng)用地高辛、洋地黃毒苷等具有正性肌力作用的強(qiáng)心苷類藥物[5]，但是其在增加心肌收縮力的同時(shí)易引起室早、室速等心律失常，且增加心臟的負(fù)擔(dān)，而未能改善心衰患者的預(yù)后并降低其死亡率[6]。因此，探索更加安全有效的抗心衰藥物仍是今后研究的難點(diǎn)與熱點(diǎn)。

我們發(fā)現(xiàn)不少研究[7-10]證實(shí)，天然甾體皂苷薯蕷皂苷(dioscin，Dio)具有抗炎、抗腫瘤和抗骨質(zhì)疏松等多種藥理作用。本室前期實(shí)驗(yàn)研究亦發(fā)現(xiàn)Dio對乳鼠心肌細(xì)胞缺氧/復(fù)氧損傷具有保護(hù)效應(yīng)[11]，而且其在細(xì)胞水平可通過調(diào)節(jié)心肌鈉、鈣等離子通道而發(fā)揮抗缺氧/復(fù)氧誘導(dǎo)的心律失常作用。更為重要的是，我們前期研究還發(fā)現(xiàn)其具備一定的強(qiáng)心作用，且尚未見文獻(xiàn)報(bào)道。因此，我們設(shè)想與強(qiáng)心苷類同屬于甾體苷類的Dio產(chǎn)生的正性肌力作用是否與其相同？是否比其更低毒更安全？本實(shí)驗(yàn)將進(jìn)行初步探索，以期揭示Dio作用特點(diǎn)和機(jī)制。

1材料與方法

1.1 材料

1.1.1實(shí)驗(yàn)對象健康、成年Wistar 大鼠，♂，體質(zhì)量250~300 g，合格證號SCXK(京)2012-0004，由北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司提供；大鼠心肌細(xì)胞 H9c2 細(xì)胞株，購自中國協(xié)和醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所細(xì)胞中心。

1.1.2藥品與試劑Dio購自國家天然藥物研究中心；JC-1和Fluo3-AM 鈣離子熒光探針購自碧云天生物技術(shù)研究所。

1.1.3儀器GL-2 Langendorff 灌流裝置、BL420-F生物機(jī)能實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)，成都泰盟軟件有限公司，中國；PHS-3C酸度計(jì)，上海精密科學(xué)儀器有限公司，中國；Millipore純水系統(tǒng)，美國；OLYMPUS全電動(dòng)倒置熒光顯微鏡，日本；Gemini XPS熒光讀板機(jī)，美國。

1.1.4液體的配制K-H灌流液(mmol·L-1)：NaCl 118.06、KCl 4.69、MgSO41.18、CaCl22.5、NaHCO325、KH2PO41.18、Glucose 11.11,預(yù)充混合氧(95% O2+5% CO2)后調(diào)節(jié)pH至7.4。

1.2方法

1.2.1離體心臟Langendorff灌流法用25%烏拉坦麻醉大鼠，仰位固定于鼠臺上，迅速剪開胸腔，暴露心臟，從主動(dòng)脈根部離斷取心臟，放入4℃生理鹽水中去除脂肪及結(jié)締組織。將主動(dòng)脈逆行插管，以恒溫(37℃)、充氧(95% O2+5% CO2)的K-H液8 mL·min-1灌流，灌注壓為8~9 kPa左右。待心臟逐漸恢復(fù)跳動(dòng)且殘血排盡后，剪掉左心耳，將球囊壓力感受器探頭經(jīng)左心房插入左心室。壓力感受器經(jīng)壓力換能器與 BL420生物機(jī)能實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)相連以記錄左心室收縮曲線，采樣頻率為800點(diǎn)·s-1。心臟灌流穩(wěn)定30 min，給藥前5 min作為空白對照，然后給予藥物干預(yù)。給藥后20 min觀察記錄左心室各項(xiàng)心功能指標(biāo)。

1.2.2細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度的測定以8×107·L-1的密度將細(xì)胞接種于共聚焦培養(yǎng)皿中，于孵箱中培養(yǎng)24 h后，與藥液共孵育20 min。后加入Fluo3-AM工作液負(fù)載30 min，后用臺氏液洗滌細(xì)胞3遍，向各組加入1 mL臺氏液，避光孵育20~30 min。共聚焦顯微鏡下記錄熒光信號，利用Image J軟件計(jì)算胞內(nèi)平均熒光強(qiáng)度。

1.2.3線粒體膜電位的測定以 4~5×107·L-1的密度將細(xì)胞接種于24孔板，接種48 h后用PBS沖洗2遍,給予相應(yīng)含藥培養(yǎng)基孵育20 min。后用PBS沖洗1遍，換上終濃度1.5 mg·L-1JC-1孵育20 min；孵育完成后，用PBS沖洗2遍，加入DMEM，放入酶標(biāo)儀檢測熒光值。

1.2.4實(shí)驗(yàn)分組① 正常對照組；② 低濃度0.1 μmol·L-1Dio組；③ 中濃度1 μmol·L-1Dio組；④ 高濃度10 μmol·L-1Dio組。

2結(jié)果

2.1Dio對大鼠離體心臟左心室各心功能指標(biāo)的影響以給藥前5 min作為正常對照，采用配對t檢驗(yàn)比較各組給藥前后各心功能指標(biāo)差異。由BL-420系統(tǒng)記錄到的左心室壓力圖像(Fig 1)。0.1 μmol·L-1和1 μmol·L-1Dio使LVSP明顯增加近13%和18%(P<0.01)；+dp/dtmax增加約11%和9%(P<0.05)，同時(shí)HR減慢；10 μmol·L-1Dio則使LVEDP 明顯增加(P<0.01)，而LVSP等其他指標(biāo)均明顯降低(P<0.01)，且實(shí)驗(yàn)過程中偶見心律失常。各濃度Dio下參數(shù)具體變化見Fig 2中給藥后各參數(shù)與正常對照的比值。

2.2Dio對大鼠心肌細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度的影響Dio作用后Ca2+熒光強(qiáng)度變化如Fig 3和Fig 4所示。與正常對照組相比，0.1、1和10 μmol·L-1Dio均能使熒光強(qiáng)度增強(qiáng)(P<0.01)，其中1 μmol·L-1Dio效應(yīng)最明顯，使熒光強(qiáng)度增加約56.25%。

2.3Dio對大鼠心肌細(xì)胞線粒體膜電位的影響Dio作用后熒光比值變化如Fig 5所示。與正常對照組相比，0.1、1μmo1·Ｌ－１Dio孵育均未引起熒光比值明顯變化（p＞ 0.05）。但10μｍｏ1·Ｌ－１Dio使該比值增加約18.42%（p＜0.01），顯示該組線粒體膜電位降低。

Fig 1　Effects of dioscin on LVSP in isolated Langendorff-perfused rat heart(1 mmHg=0.133 kPa)

Fig 2　Effects of dioscin on cardiac functions in isolated

**P<0.05,**P<0.01vscontrol group.

Fig 3　Effects of dioscin on fluorescence intensity of

A:Control； B:0.1 μmol·L-1Dio；C:1 μmol·L-1Dio；D:10 μmol·L-1Dio

Fig 4　Effects of dioscin on fluorescence intensity of

***P<0.01vscontrol group

Fig 5　Effects of dioscin on mitochondrial membrane

***P<0.01vscontrol group

3討論

本實(shí)驗(yàn)分別探索了Dio對心肌收縮力和細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度的作用，低、中濃度Dio可使LVSP和+dp/dtmax明顯增加，體現(xiàn)正性肌力作用。研究證實(shí)，舒張性心力衰竭患者，左室射血分?jǐn)?shù)正常而-dp/dtmax明顯降低。Dio可增加-dp/dtmax，在一定程度上改善左心室舒張功能，相較于傳統(tǒng)的正性肌力藥更有優(yōu)勢。

然而，高濃度Dio對心肌收縮力的作用卻與低、中濃度相反，使LVSP和±dp/dtmax均減小，僅增加LVEDP。在實(shí)驗(yàn)過程中，在剛剛給予高濃度Dio時(shí)(5 min內(nèi))，可觀察到LVSP有所增加，但隨著灌流時(shí)間的延長，LVSP開始降低，甚至出現(xiàn)心律失常，這可能與高濃度Dio過分增加LVEDP，使得容量負(fù)荷過度有關(guān)。

心肌收縮功能與細(xì)胞內(nèi)Ca2+水平密切相關(guān)[12-13]。我們由當(dāng)前研究發(fā)現(xiàn)Dio的急性作用可使Ca2+熒光強(qiáng)度增強(qiáng)，這表明Dio與洋地黃強(qiáng)心苷類藥物作用方式相似，即通過增加心肌細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度而發(fā)揮正性肌力作用。這引發(fā)了我們對于Dio在提升細(xì)胞內(nèi)Ca2+水平的同時(shí)是否會導(dǎo)致鈣超載，以及其誘導(dǎo)Ca2+濃度增加的機(jī)制產(chǎn)生了思考。

首先，線粒體膜電位的測定結(jié)果顯示，低、中濃度Dio對熒光比值無明顯改變，即不由此引發(fā)細(xì)胞損傷。同時(shí)，其僅在10倍于中濃度的高濃度下才使該比值有一定升高，這與離體水平上高濃度的不良效果較為一致。但是與洋地黃毒苷類強(qiáng)心藥易引發(fā)心律失常，增加心臟負(fù)荷相比，Dio似乎仍顯示出更優(yōu)的安全性，因?yàn)樵? μmol·L-1濃度時(shí)，Dio增加細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度和心肌收縮力在本實(shí)驗(yàn)中最明顯，而此時(shí)并未見心律失常以及鈣超載所致的線粒體膜電位下降，顯示出Dio在發(fā)揮正性肌力作用上可能具備一定優(yōu)勢。

其次，細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度的增加表明Dio并非如左西孟坦等鈣增敏劑，通過增加心肌收縮蛋白對Ca2+的敏感性來發(fā)揮強(qiáng)心作用[14]。另外，我們前期實(shí)驗(yàn)又證實(shí)Dio可減少L-型Ca2+通道介導(dǎo)的內(nèi)向鈣電流[15]，這表明L-型Ca2+通道不是Dio增加Ca2+濃度的途徑。因此，其機(jī)制有待于進(jìn)一步研究。再有，我們前期結(jié)果還顯示Dio能夠增加內(nèi)向鈉電流[16]。聯(lián)想到臨床上使用的洋地黃類藥物通過抑制心肌Na+-K+-ATP酶活性，使細(xì)胞內(nèi)Na+增多，從而通過鈉鈣交換體(sodium-calcium exchanger，NCX)使細(xì)胞Ca2+內(nèi)流增加，產(chǎn)生正性肌力作用[17]。Flesch等[18]也認(rèn)為，鈉通道激活劑產(chǎn)生正性肌力作用的機(jī)制與鈉鈣交換活動(dòng)增強(qiáng)有關(guān)。另外，進(jìn)入細(xì)胞的Ca2+也可觸發(fā)肌漿網(wǎng)釋放Ca2+[19]。我們據(jù)此推測，Dio增強(qiáng)心肌收縮力的作用可能與影響鈉鈣交換體相關(guān)。因此，下一步我們將觀察Dio是否通過上述機(jī)制增加胞內(nèi)Ca2+濃度以證明我們的設(shè)想。

總之，我們證實(shí)Dio通過增加胞內(nèi)Ca2+濃度產(chǎn)生正性肌力作用，還能改善舒張功能，僅高濃度時(shí)才產(chǎn)生一定的鈣超載，基本符合理想正性肌力藥的要求[20]。當(dāng)然，本實(shí)驗(yàn)?zāi)壳皟H初步發(fā)現(xiàn)Dio的正性肌力作用，還尚未對其作用原理進(jìn)行深入探究，故今后我們將從多途徑，如NCX電流以及進(jìn)出肌漿網(wǎng)的Ca2+濃度變化等進(jìn)行觀察以闡明其機(jī)制。同時(shí)，Dio對病理情況下心肌收縮力的作用也亟待探索。

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Effects of dioscin on rat myocardial contractility

HAN Yu, YANG Fan, CONG Tian-shen, SUN Kai, LI Yan, KANG Yi, YIN Yong-qiang, LOU Jian-shi

(DeptofPharmacology,BasicMedicalCollege,TianjinMedicalUniversity,Tianjin300070,China)

Abstract:AimTo investigate the effects of dioscin (Dio) on rat myocardial contractility. MethodsLeft ventricular contractile function was measured using the Langendorff non-recirculating mode of isolated rat heart perfusion. Effects of low, middle and high concentration of Dio were investigated by measuring left ventricular systolic pressure (LVSP) and left ventricular end diastolic pressure (LVEDP). Also, peak rates of rise/fall of left ventricular pressure (±dp/dtmax) of isolated rat heart were calculated. Effects of Dio on intracellular free calcium concentration in rat H9c2 cells were measured by using the confocal microscopy. Mitochondrial membrane potential was detected with multifunctional microplate reader. ResultsWith 0.1, 1 μmol·L-1Dio, LVSP were significantly enhanced from (11.55±0.52), (10.53±0.28) kPa to (13.08±0.72), (12.53±0.64) kPa(P<0.01); +dp/dtmaxwere dramatically increased from (0.38±0.10), (0.40±0.07) kPa·ms-1to (0.42±0.11), (0.43±0.02) kPa·ms-1(P<0.05). With the 10 μmol·L-1Dio, LVSP and +dp/dtmaxwere both decreased from (12.13±0.33) kPa and (0.42±0.04) kPa·ms-1to (9.46±0.77) kPa and (0.24±0.04) kPa·ms-1(P<0.01). With 0.1, 1, 10 μmol·L-1Dio, the relative fluorescence intensity of intracellular free calcium concentrations was increased significantly from (16.62±0.89) to (21.48±0.80), (25.68±0.69) and (19.84±0.66)(P<0.01)respectively. 0.1, 1 μmol·L-1Dio showed no significant effects on the mitochondrial membrane potential of rat H9c2 cells, while with effects of 10 μmol·L-1Dio, the ratio of JC-1 monomer and J-aggregates was changed from (1.14±0.03) to (1.35±0.06)(P<0.01), indicating a decrease in the mitochondrial membrane potential. ConclusionLow and middle concentrations of Dio show a positive inotropic effect on isolated rat heart, as the LVSP and +dp/dtmaxare enhanced, which may concern with the increase of the intracellular concentration of Ca2+. It will not cause the calcium overload while the intracellular concentration of Ca2+is increased by low and middle concentration of Dio in the myocytes except high concentration of Dio.

Key words:dioscin; concentration of Ca2+; positive inotropic effect; ion channel; sodium-calcium exchanger; left ventricular systolic pressure

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號：1001-1978(2016)02-0258-05

doi:10.3969/j.issn.1001-1978.2016.02.021

作者簡介：韓鈺(1990-)，男，碩士生，研究方向：心血管藥理學(xué)，E-mail:18622272148@163.com;尹永強(qiáng)(1980-)，男，博士，講師，研究方向：心肌細(xì)胞離子通道，通訊作者，Tel:022-83336835，E-mail:13820043633@126.com；婁建石(1954-)，男，碩士，教授，博士生導(dǎo)師，研究方向：心血管藥理學(xué)，通訊作者，Tel: 022-83336860，E-mail:jianshilou@163.com

基金項(xiàng)目：天津應(yīng)用基礎(chǔ)及前沿技術(shù)研究計(jì)劃青年項(xiàng)目(No 14JCQNJC13700)

收稿日期：2015-10-26，修回日期：2015-12-02

網(wǎng)絡(luò)出版時(shí)間：http://www.cnki.net/kcms/detail/34.1086.R.20160125.1557.042.html網(wǎng)絡(luò)出版地址：2016-1-25 15:57