丙戊酸鈉與順鉑聯(lián)合應(yīng)用對人骨肉瘤細胞株U-2 OS增殖、凋亡的影響及其作用機制

閆抗，夏斯龍，王業(yè)華

(1徐州醫(yī)學(xué)院研究生學(xué)院，江蘇徐州 221000；2徐州醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院)

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丙戊酸鈉與順鉑聯(lián)合應(yīng)用對人骨肉瘤細胞株U-2 OS增殖、凋亡的影響及其作用機制

閆抗1，夏斯龍1，王業(yè)華2

(1徐州醫(yī)學(xué)院研究生學(xué)院，江蘇徐州 221000；2徐州醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院)

摘要：目的觀察丙戊酸鈉(VPA)與順鉑(DDP)聯(lián)合應(yīng)用對人骨肉瘤細胞株U-2 OS增殖、凋亡的影響，并探討其可能機制。方法 培養(yǎng)U-2 OS細胞，分為A、B、C、D組，A組加入35 mmol/L VPA+20 mg/L DDP，B組加入35 mmol/L VPA，C組加入20 mg/L DDP，D組未加任何藥物。CCK-8法檢測細胞增殖，流式細胞儀檢測細胞周期及凋亡，RT-PCR法檢測細胞凋亡相關(guān)基因(Caspase-3、Fas)。結(jié)果與D組比較，A、B、C組細胞存活率降低，G0/G1期細胞增加，凋亡率及Fas、Caspase-3相對表達量升高；與C組比較，A組細胞存活率降低，G0/G1期細胞增加，凋亡率及Fas、Caspase-3相對表達量升高；P均<0.05。結(jié)論 VPA聯(lián)合DDP可抑制U-2 OS細胞增殖，促進其凋亡，且較單用VPA或DDP作用更為明顯；其機制可能與Fas、Caspase-3表達上調(diào)有關(guān)。

關(guān)鍵詞：骨肉瘤；丙戊酸鈉；順鉑

骨肉瘤是青少年常見的惡性骨腫瘤，在小兒骨惡性腫瘤中最多見[1]。順鉑(DDP)是臨床常用的化療藥物，但由于耐藥性及不良反應(yīng)等因素限制其療效的進一步發(fā)揮。丙戊酸鈉(VPA)屬于短鏈脂肪酸家族，是臨床廣泛應(yīng)用的廣譜抗癲癇藥，屬于組蛋白去乙?；敢种苿?HDACi)[2]，具有抑制組蛋白去乙?；钚缘淖饔?。研究[3]表明，VPA在體內(nèi)外均可通過誘導(dǎo)細胞周期停滯，以促進細胞凋亡和分化，進而抑制多種腫瘤細胞的生長和增殖，其潛在的抗腫瘤作用越來越受到關(guān)注。2014年6月～2015年6月，我們觀察了VPA與DDP聯(lián)合應(yīng)用對人骨肉瘤細胞U-2 OS增殖、凋亡的影響，并探討其可能機制，旨在為骨肉瘤的治療藥物選擇提供新的思路。

1材料與方法

1.1細胞株和試劑細胞株：人骨肉瘤細胞株U-2 OS(上海中科學(xué)院細胞庫)，用含有10%胎牛血清的1640培養(yǎng)液在37 ℃、5%CO2條件下培養(yǎng)。主要試劑：VPA，DDP，胎牛血清，改良型1640培養(yǎng)基，細胞周期檢測試劑盒，Annexin V-FITC/PI細胞凋亡檢測試劑盒，TRIzol試劑盒，F(xiàn)as，Caspase-3，內(nèi)參β-actin。

1.2VPA藥物濃度篩選及U-2OS細胞分組、干預(yù) ①VPA藥物濃度篩選實驗：分別用5、10、20、40 mmol/L共4個濃度分別處理細胞24、48 h，計算24 h的藥物半數(shù)抑制濃度IC50[4]，并以此濃度作為下述聯(lián)合用藥實驗中VPA濃度。②VPA、DDP聯(lián)合用藥實驗：設(shè)A、B、C、D組，其中VPA濃度為VPA藥物半數(shù)抑制濃度IC50，即35 mmol/L，DDP濃度為20 mg/L。

1.3U-2 OS細胞增殖檢測取對數(shù)生長期U-2 OS細胞，常規(guī)消化，計數(shù)，調(diào)整細胞密度按5 000/孔，接種于96孔培養(yǎng)板，待細胞生長約70%后加藥。A組加入35 mmol/L VPA+20 mg/L DDP，B組加入35 mmol/L VPA，C組加入20 mg/L DDP，A、B、C組為實驗組；D組未加任何藥物(對照組)。每個濃度設(shè)5個平行復(fù)孔，處理結(jié)束后加入CCK-8，輕搖，37 ℃孵育2 h，采用酶聯(lián)免疫檢測儀測定培養(yǎng)24、48 h每孔在450 nm波長處的吸光度(OD)。取5孔OD值的平均值，計算各組細胞的存活率，細胞存活率(%)=(A實驗組/A對照組)×100%。

1.4U-2 OS細胞周期、凋亡檢測取對數(shù)生長期U-2 OS細胞常規(guī)消化后計數(shù)，調(diào)整細胞密度按3×105/孔，接種于6孔培養(yǎng)板，待細胞生長約70%后加藥。各組藥物干預(yù)同上，藥物作用細胞24 h后用不含EDTA的胰酶消化收集，用PBS洗滌細胞2次。①細胞周期測定：PBS洗滌后，調(diào)整細胞濃度為1×106/mL，取1 mL單細胞懸液，離心，去除上清，在細胞中加入體積分數(shù)為70%冷乙醇500 μL固定，4 ℃保存，過夜后用PBS洗去固定液；加入100 μL RNase A，37 ℃水浴30 min，再加入400 μL的PI染色混勻，4 ℃避光30 min，上機檢測記錄激發(fā)波長488 nm處紅色熒光，記錄G0/G1期細胞數(shù)。②細胞凋亡率測定：PBS洗滌后，加入500 μL的Binding Buffer懸浮細胞，加入5 μL的Annexin V-FITC混勻，后加入5 μL的Propidium Iodide，混勻；室溫、避光、反應(yīng)5～15 min；流式細胞儀檢測細胞凋亡率。

1.5U-2 OS細胞形態(tài)學(xué)觀察倒置相差顯微鏡觀察各組細胞經(jīng)藥物處理24 h后細胞形態(tài)學(xué)變化。

1.6U-2 OS細胞Fas、Caspase-3檢測細胞處理及分組與“1.4”方法相同，藥物作用24 h后用TRIzol、氯仿、異丙醇等試劑提取各組細胞總RNA，按照TIANScript RT Kit(cDNA第一鏈合成試劑盒)說明書逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，然后按2×Taq Master Mix說明書進行PCR擴增，擴增后的DNA用2%瓊脂糖凝膠進行電泳。采用凝膠成像系統(tǒng)對條帶進行照相，Image J進行灰度值分析。

2結(jié)果

2.1各組細胞存活率、G0/G1期細胞、細胞凋亡率比較細胞存活率、G0/G1期細胞、細胞凋亡率比較見表1。

表1　各組細胞存活率、G0/G1期細胞、細胞凋亡率比較

注：與D組比較，*P<0.05；與C組比較，△P<0.05。

2.2各組細胞形態(tài)學(xué)變化D組U-2 OS細胞增殖良好；B、C組細胞數(shù)量減少，部分細胞由梭形變小、變圓，細胞質(zhì)內(nèi)顆粒增粗、增多，少量細胞脫落、裂解，可見少量凋亡小體，呈典型凋亡形態(tài)改變；A組細胞密度更低，凋亡現(xiàn)象更加明顯。

2.3各組細胞Fas、Caspase-3相對表達量比較細胞Fas、Caspase-3相對表達量比較見表2。

表2　各組細胞Fas、Caspase-3相對表達量比較

注：與D組比較，*P<0.05；與C組比較，△P<0.05。

3討論

骨肉瘤患者預(yù)后差，單純手術(shù)治愈率僅15%～20%，約50%的患者術(shù)后復(fù)發(fā)。隨著新輔助化療技術(shù)的應(yīng)用，骨肉瘤患者的5年生存率有所提高[5]，但在臨床治療過程中發(fā)現(xiàn)其對臨床常用抗腫瘤藥物如鉑類、多柔比星、甲氨蝶呤等逐漸產(chǎn)生耐藥性[6]，甚至是多重耐藥，這對骨肉瘤的治療效果造成極大的影響。

DDP是癌癥化療方案中的重要組分[7]，但細胞耐藥性及不良反應(yīng)限制其應(yīng)用，因此設(shè)計與DDP的聯(lián)合用藥以增強DDP的化療效果成為臨床關(guān)注的熱點[8]。有研究表明，HDACi能有效抑制腫瘤細胞增殖，其與多種化療藥物聯(lián)用可有效增加抑癌效果。VPA是一種八碳支鏈的脂肪酸鈉鹽，屬于HDACi，作為傳統(tǒng)的抗癲癇藥物，其不良反應(yīng)輕，患者可長期使用，在抗癲癇治療時表現(xiàn)出很強的組蛋白去乙酰化酶抑制劑活性。已有研究[9～11]表明，VPA對肺癌、淋巴瘤、肝癌等多種腫瘤細胞有抑制作用。然而，VPA聯(lián)合DDP是否具有協(xié)同抗骨肉瘤作用鮮有報道。本研究顯示，與D組比較，A、B、C組細胞存活率降低，凋亡率升高；與C組比較，A組細胞存活率降低，凋亡率升高。提示VPA聯(lián)合DDP可抑制U-2 OS細胞存活，促進其凋亡，VPA聯(lián)合DDP具有較強的協(xié)同抑癌活性，且較單用VPA或DDP作用更明顯。

細胞凋亡是多種基因調(diào)控的結(jié)果，F(xiàn)as基因作為重要的凋亡基因[12]，其表達的蛋白是誘導(dǎo)細胞程序性死亡的信號分子，在正常細胞內(nèi)可通過信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑逐級放大死亡信號，通過相應(yīng)的受體傳導(dǎo)至細胞核內(nèi)部，引起核內(nèi)轉(zhuǎn)錄基因的改變，從而啟動凋亡程序。近年研究[13]表明，F(xiàn)as在骨肉瘤中的表達與肺轉(zhuǎn)移的發(fā)生呈負相關(guān)，提示通過改變Fas表達可以調(diào)整骨肉瘤細胞的侵襲能力。Caspase是由Caspase基因家族轉(zhuǎn)錄表達的一類具有酶切作用的蛋白質(zhì)，目前發(fā)現(xiàn)有14種，Caspase-3為主要的凋亡執(zhí)行蛋白[14]，被上游分子激活后能分解細胞的骨架蛋白、細胞器等結(jié)構(gòu)，參與細胞凋亡的具體執(zhí)行過程。本研究顯示，A、B、C組Fas和Caspase-3相對表達量較D組升高，A組Fas和Caspase-3相對表達量較C組升高，表明VPA聯(lián)合DDP可促進Fas、Caspase-3表達，且較單用VPA或DDP作用更為明顯。

總之，VPA聯(lián)合DDP可抑制U-2 OS細胞存活，促進其凋亡，且較單用VPA或DDP作用更為明顯；其作用機制可能與Fas、Caspase-3表達上調(diào)有關(guān)。

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Effect and mechanism of sodium valproate combined with cisplatin on proliferation and apoptosis of human osteosarcoma cell line U-2 OS

YANKang1,XIASilong,WANGYehua

(1GraduateSchoolofXuzhouMedicalCollege,Xuzhou221000,China)

Abstract:ObjectiveTo investigate the effect and mechanism of the sodium valproate (VPA) combined with cisplatin (DDP) on proliferation and apoptosis of human osteosarcoma cell line U-2 OS. MethodsThe osteosarcoma U-2 OS cells were cultured in vitro and were divided into groups A, B, C and D. The groups A, B and C were separately treated with 35 mmol/L VPA+20 mg/L DDP, 35 mmol/L VPA and 20 mg/L DDP, and the group D was not treated. The proliferation was assayed by CCK-8. The cell cycle and apoptosis were analyzed by flow cytometry (FCM). The gene expression of Fas and Caspase-3 was detected by RT-PCR. ResultsCompared with group D, the cell viabilities of groups A, B and C were decreased, the cells in the G0/G1phase were increased, the apoptosis rate and the expression levels of Fas and Caspase-3 genes were increased; compared with group C, the cell viability of the group A decreased, the cells in the G0/G1phase were increased, the apoptosis rate and the expression levels of Fas and Caspase-3 genes increased. The difference was statistically significant (all P<0.05).Conclusions VPA combined with DDP could inhibit the cell proliferation and induce to apoptosis of human osteosarcoma U-2 OS, and the effect is more obvious than that of using only one of them. The mechanism may be closely related to the up-regulated expression of Fas and Caspase-3.

Key words:osteosarcoma; sodium valproate; cisplatin

(收稿日期:2015-09-23)

作者簡介：第一閆抗(1990-)，男，碩士在讀，主要研究方向為創(chuàng)傷外科。E-mail: xzmcyankang@163.com

中圖分類號：R738.1

文獻標志碼：A

文章編號：1002-266X(2016)03-0011-03

doi：10.3969/j.issn.1002-266X.2016.03.004

通信作者簡介：王業(yè)華(1966-)，男，博士，主任醫(yī)師，主要研究方向為創(chuàng)傷外科。E-mail: 736283162@qq.com