川芎嗪對重癥急性胰腺炎大鼠的治療作用及其機制

史玉，郭永澤，王建華,李校天

(1河北工程大學醫(yī)學院，河北邯鄲056029；2河北工程大學附屬醫(yī)院)

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川芎嗪對重癥急性胰腺炎大鼠的治療作用及其機制

史玉1，郭永澤2，王建華2,李校天2

(1河北工程大學醫(yī)學院，河北邯鄲056029；2河北工程大學附屬醫(yī)院)

摘要：目的 探討川芎嗪(TMP)對重癥急性胰腺炎(SAP)大鼠的治療作用及其機制。方法 采用5%?；悄懰徕c溶液胰膽管注射誘發(fā)SAP大鼠模型。32只大鼠隨機分為4組，A組(假手術組)、B組(SAP模型組)、C組、D組，每組8只。C組關腹30 min后腹腔內注射脂多糖(LPS,2 mg/kg體質量)，A、B組在關腹30 min后腹腔內注射與C組相同容積生理鹽水，D組關腹30 min后腹腔內注射TMP(10 mg/ 100 g體質量)。干預后6 h，采用鱟試驗檢測血漿LPS；免疫組織化學法檢測胰腺組織內Toll樣受體4(TLR4)；熒光分光光度計檢測胰腺腺泡細胞內鈣離子濃度。結果血LPS水平、胰腺組織TLR4水平、胰腺腺泡細胞鈣離子濃度B組均高于A組(P均<0.05)，C組均高于A組及B組(P均<0.05)；與B組相比，D組血LPS水平、胰腺組織TLR4水平、胰腺腺泡細胞內鈣離子濃度明顯下降(P均<0.05)。結論 TMP可通過干預LPS-TLR4通路緩解SAP大鼠胰腺腺泡細胞內鈣超載，從而發(fā)揮其治療作用。

關鍵詞：重癥急性胰腺炎；川芎嗪;鈣超載；Toll樣受體4

重癥急性胰腺炎(SAP)病情兇險，病死率30%~40%[1]。目前認為胰腺腺泡細胞損傷促使多種炎性因子的瀑布樣釋放，引起炎癥級聯(lián)反應[2]，進而加重胰腺損傷。細胞內鈣超載是胰腺腺泡細胞損傷的核心事件，調節(jié)胰腺細胞內鈣離子的動態(tài)平衡,防止鈣超載是治療SAP的關鍵[3，4]。動物和臨床試驗研究表明，川芎嗪(TMP)可以緩解胰腺腺泡細胞鈣超載，對SAP有一定治療作用。以此為基礎，2014年5~12月，我們從細胞和組織水平上，通過對SAP大鼠及胰腺腺泡細胞的研究，探討TMP延緩腺泡細胞內鈣超載的機制。

1材料與方法

1.1材料實驗動物:成年健康雄性Sprague Dawley(SD)大鼠，體質量250～300 g，清潔級，由河北醫(yī)科大學實驗動物中心提供，許可證號：SCXK(冀)2008-1-003。實驗過程符合中華人民共和國的《實驗動物管理條例》及倫理要求。實驗藥品及主要試劑：?；悄懰徕c、LPS購自Sigma 公司；TMP購自中國藥品生物制品檢定所；內毒素試劑盒購自上海市醫(yī)學化驗所；兔抗TLR4多克隆抗體購自Santa Cruz公司；顯色法免疫檢測試劑盒購自Invitrogen公司。

1.2動物模型制備及分組采用5%?；悄懰徕c溶液胰膽管注射誘發(fā)SAP大鼠模型。具體操作如下：動物用氯胺酮100 mg/ kg體質量腹腔注射麻醉后開腹,暴露胰膽管，在胰膽管出肝門端及腸端用絲線及動脈夾暫阻斷, 從近肝門端向胰膽管內加壓注射5%?；悄懰徕c溶液(0.1 ml/ 100 g體質量),10 min后去除結扎線及動脈夾。注射后約10 min見胰腺出現(xiàn)腫脹及點狀出血壞死，標志造模成功，關腹。假手術組鼠僅做剖腹并輕翻動胰腺。32只模型大鼠隨機分為四組：A組(假手術組)、B組(SAP模型組)、C組、D組，每組8只。C組關腹30 min后腹腔內注射脂多糖(LPS，2 mg/kg體質量)，A組、B組在關腹30 min后腹腔內注射與C組相同容積生理鹽水，D組關腹30 min后腹腔內注射TMP(10 mg/ 100 g體質量)。干預后6 h，所有動物同批麻醉后，心臟采血備用。取新鮮胰腺組織分離胰腺腺泡細胞。

1.3血漿LPS的檢測采用鱟試驗動態(tài)濁度法。按說明書操作。各組取0.1 mL血漿加入0.9 mL樣品處理液中，70 ℃孵育10 min，然后冷卻5 min。取上述樣品0.2 mL加入酶反應液中混勻，取0.1 mL混懸液加入微孔平板儀，再加0.1 mL鱟試劑混勻，上檢測儀器檢測。

1.4胰腺組織內TLR4的檢測采用免疫組織化學SP法。胰腺組織石蠟切片5 mm，經脫蠟至水、微波抗原修復，加兔抗TLR4多克隆抗體(1∶80)，二抗，DAB顯色，蘇木素復染。用PBS代替一抗進行上述染色作為空白對照。切片統(tǒng)一由專門病理醫(yī)師在光鏡下觀察，應用圖象分析軟件計算陽性面積。

1.5胰腺腺泡細胞內鈣離子濃度([Ca2+]i)的檢測采用熒光分光光度計檢測。按膠原酶法分離提純大鼠原代胰腺腺泡細胞, 制成密度為105~106/L的細胞懸液(經臺盼藍染色測定細胞存活率達90%以上)，在37 ℃的水浴中預溫5 min，加入熒光探針Fura-2/AM 37 ℃避光孵育1 h,每隔10分鐘振蕩1次。染色結束后，用D-Hanks液洗細胞3次，以充分洗去細胞外未負載的殘余熒光染料，用熒光分光光度計檢測熒光強度，以340、380 nm雙波長激發(fā)樣品, 發(fā)射波長510 nm。[Ca2+]i計算公式:[Ca2+]i=Kd[(R-Rmin)/(Rmax-R)](Fmin/Fmax)。

2結果

各組血漿LPS、胰腺TLR4陽性面積及腺泡細胞[Ca2+]i比較見表1。

表1　各組血漿LPS、胰腺TLR4陽性面積

注 與A組比較，*P<0.05; 與B組比較,#P<0.05；與C組比較，@P<0.01。

3討論

臨床試驗和動物實驗研究證實，SAP患者和動物模型的血液中LPS 水平明顯升高[5,6]，后者可激活LPS-TLR4 通路，使SAP加重，對胰腺組織造成“二次打擊”。目前關于LPS-TLR4 參與SAP發(fā)生機制的研究主要集中在其下游細胞因子的炎性作用。其是否還通過其他途徑引起胰腺損傷尚未見報道。越來越多的實驗結果證實,胰腺腺泡細胞內Ca2+超載是SAP發(fā)生發(fā)展的“扳機點”。兩者之間是否相關、相關性如何目前尚不清楚。本實驗結果顯示,誘導SAP后,大鼠血漿LPS水平明顯升高，胰腺組織TLR4蛋白表達水平明顯增加，同時胰腺腺泡細胞[Ca2+]i升高。在此基礎上,給SAP大鼠腹腔內注射LPS,可見胰腺組織TLR4蛋白表達水平及腺泡細胞[Ca2+]i升高更明顯。說明在SAP發(fā)生時, 隨著LPS-TLR4 通路的活化，胰腺腺泡細胞[Ca2+]i明顯增加,并由此加重了胰腺損傷。

TMP是從中藥川穹中分離提純的生物堿單體，又稱四甲基吡嗪。 研究[7，8]發(fā)現(xiàn)TMP對SAP大鼠有一定的治療作用，其可能機制之一是抑制胰腺細胞鈣超載[9]。但是其抑制鈣超載的相關信號通路未見報道。研究[10]發(fā)現(xiàn)TMP具有一定的抗LPS藥理作用,對LPS誘導的急性肺損傷大鼠有保護作用[11]。據此,我們推測其可能對LPS-TLR4通路有影響。本試驗結果顯示，TMP可以降低SAP大鼠血漿LPS含量及胰腺組織TLR4水平，進而緩解腺泡細胞鈣超載，這說明TMP可以減輕LPS-TLR4通路誘導的腺泡細胞鈣超載。

綜上所述，TMP可以通過干預LPS-TLR4通路緩解鈣超載，從而發(fā)揮其治療作用，為臨床采用TMP治療SAP提供理論指導。至于LPS-TLR4通路具體通過何種信號分子影響了腺泡細胞內鈣信號，需要進一步研究。

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(收稿日期：2015-09-07)

中圖分類號：R576

文獻標志碼：A

文章編號：1002-266X(2016)01-0033-03

doi：10.3969/j.issn.1002-266X.2016.01.011

通信作者：郭永澤(E-mail:guoyongze69@126.com)

基金項目：河北省科學技術廳資助項目(10276105D-49); 邯鄲市科學技術技局資助項目(0823108067-2)。