缺氧誘導(dǎo)因子-1靶基因參與生酮飲食提高大腦中動(dòng)脈閉塞模型小鼠腦缺血耐受作用

國 敏，崔 梅，董 強(qiáng)

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缺氧誘導(dǎo)因子-1靶基因參與生酮飲食提高大腦中動(dòng)脈閉塞模型小鼠腦缺血耐受作用

國 敏，崔 梅，董 強(qiáng)

[摘要]目的 探究生酮飲食對(duì)大腦中動(dòng)脈閉塞(middle cerebral artery occlusion，MCAO)模型小鼠的作用及缺氧誘導(dǎo)因子-1靶基因參與機(jī)制。方法 小鼠隨機(jī)分為正常對(duì)照組及標(biāo)準(zhǔn)飲食組、高碳水化合物飲食組、生酮飲食組，建模前通過3周飲食干預(yù)后，飲食干預(yù)的3組小鼠建造MCAO模型，正常對(duì)照組給予標(biāo)準(zhǔn)飲食但不進(jìn)行MCAO造模。2，3，5-三苯基氯化四氮唑染色觀察腦梗死體積，Longa評(píng)分法對(duì)模型鼠進(jìn)行神經(jīng)功能評(píng)分，聚合酶鏈反應(yīng)檢測缺血區(qū)腦組織缺氧誘導(dǎo)因子-1下游靶基因紅細(xì)胞生成素、血管內(nèi)皮生長因子、葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)體1、單羧酸轉(zhuǎn)運(yùn)體4的mRNA表達(dá)量。結(jié)果 生酮飲食組小鼠腦組織梗死體積更小，神經(jīng)功能評(píng)分更低，缺血區(qū)腦組織中紅細(xì)胞生成素、血管內(nèi)皮生長因子、葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)體1、單羧酸轉(zhuǎn)運(yùn)體4的mRNA表達(dá)顯著增加。結(jié)論 生酮飲食可能是通過增加缺血區(qū)缺氧誘導(dǎo)因子-1靶基因表達(dá)，從而提高M(jìn)CAO小鼠腦組織對(duì)缺血的耐受性。

[關(guān)鍵詞]生酮飲食；大腦中動(dòng)脈閉塞；缺氧誘導(dǎo)因子-1靶基因；卒中

[作者單位]200040上海，復(fù)旦大學(xué)附屬華山醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科(國敏，崔 梅，董 強(qiáng))

缺血性卒中通常由局部腦組織血流量降低引起，是目前世界范圍內(nèi)引起死亡和終身殘疾的主要原因之一[1]。腦組織對(duì)缺血、缺氧損傷敏感，但是研究發(fā)現(xiàn)預(yù)先給予非致死性缺血、缺氧刺激腦組織能夠產(chǎn)生內(nèi)源性保護(hù)機(jī)制，稱為耐受[2]。缺氧預(yù)適應(yīng)是目前研究較多的誘導(dǎo)局部或全腦缺血后缺血耐受的方法。將動(dòng)物暴露于輕度低氧環(huán)境，觀察到腦缺氧預(yù)適應(yīng)能減輕缺血性卒中動(dòng)物模型腦梗死體積[3-4]。缺氧誘導(dǎo)因子-1(hypoxia inducible factor-1，HIF-1)是缺氧預(yù)適應(yīng)時(shí)激活的關(guān)鍵因子[5-6]，HIF-1作為轉(zhuǎn)錄因子可調(diào)節(jié)下游靶基因，如紅細(xì)胞生成素(erythropoietin，EPO)、血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)、葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)體1(glucose transporter 1，GLUT1)、單羧酸轉(zhuǎn)運(yùn)體4(monocarboxylate transporter 4，MCT4)的表達(dá)，通過促進(jìn)代謝、血管生成、葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)等作用參與損傷修復(fù)，提高腦缺氧耐受[7-8]。盡管缺氧預(yù)適應(yīng)在實(shí)驗(yàn)中有效，但臨床上卒中對(duì)象為人，卒中發(fā)生時(shí)間也無法準(zhǔn)確預(yù)知，其應(yīng)用于臨床難以實(shí)施，亟待尋找臨床可行的其他干預(yù)方法。

生酮飲食為高脂肪、低碳水化合物飲食，供給機(jī)體代謝所需的碳水化合物較少，因此脂肪成為主要能量來源。生酮飲食最初作為癲癇的非藥物療法取得較好的臨床效果[9]，后來研究發(fā)現(xiàn)其對(duì)阿爾茨海默病和癡呆均有臨床療效[10]，但生酮飲食對(duì)缺血性卒中的作用仍有待闡明。有研究報(bào)道[11]，生酮飲食可增加缺血腦組織HIF-1含量，但HIF-1下游靶基因在生酮飲食中作用機(jī)制仍需探究。為進(jìn)一步闡明生酮飲食對(duì)缺血性卒中HIF-1靶基因的影響，本研究擬采用大腦中動(dòng)脈閉塞(middle cerebral artery occlusion，MCAO)小鼠模型，探究生酮飲食對(duì)HIF-1下游靶基因的表達(dá)及腦缺血損傷的影響。

1　材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組及處理 正常健康8～10周齡雌性C57BL/6小鼠24只[上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司，SCXK-(滬)-2012-0002)]，體質(zhì)量18～25 g，清潔級(jí)。小鼠隨機(jī)分為正常對(duì)照(normal control，NC)組、標(biāo)準(zhǔn)飲食(standard diet，SD)組、高碳水化合物飲食(high carbohydrate，HC)組、生酮飲食(ketogenic diet，KD)組4組(每組6只)。NC組給予標(biāo)準(zhǔn)飲食但不進(jìn)行MCAO造模，其他3組動(dòng)物飲食配比情況見表1。各組在進(jìn)行不同飲食干預(yù)前，所有小鼠饑餓處理18 h以平衡個(gè)體間血糖水平后，分別接受不同飲食干預(yù)3周[11]。

表1　小鼠飲食配比表

1.2方法

1.2.1MCAO模型 飲食處理3周后，SD組、HC組及KD組小鼠腹腔注射氯胺酮(65 mg/kg)和甲苯噻嗪(6mg/kg)進(jìn)行麻醉，頭部置于立體定位儀(KOPF，美國，Stoelting公司)，四肢放置在加熱墊上，使體溫保持在37℃。將激光多普勒探頭置于顱骨前囟旁開5 mm、后開2 mm處，石蠟包被的尼龍線栓從頸外動(dòng)脈置入至大腦中動(dòng)脈，同時(shí)用激光多普勒血流儀觀察局部腦血流量降至基線水平的25%以下。45 min后取出尼龍線栓并頸外動(dòng)脈進(jìn)行永久性結(jié)扎，頸總動(dòng)脈暫時(shí)結(jié)扎后恢復(fù)灌注。只有缺血期血流降至基線水平的25%以下、灌注期血流恢復(fù)80%以上的小鼠納入后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2.2小鼠神經(jīng)功能評(píng)定 MCAO模型72 h后，用Longa評(píng)分法對(duì)模型小鼠神經(jīng)功能進(jìn)行評(píng)定。評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn):0級(jí)，無缺陷；1級(jí)，不能伸展對(duì)側(cè)前肢；2級(jí)，對(duì)側(cè)前肢屈曲；3級(jí)，輕度向?qū)?cè)轉(zhuǎn)圈；4級(jí)，嚴(yán)重的轉(zhuǎn)圈；5級(jí)，對(duì)側(cè)癱瘓。神經(jīng)功能3～4級(jí)小鼠為成功模型。

1.2.3腦梗死體積測量 MCAO模型小鼠腦梗死72 h后處死，將腦組織在-20℃冰凍20 min，用切片機(jī)切成5～6片、厚度2 mm。37℃下腦片置于2，3，5-三苯基氯化四氮唑(2，3，5-triphenyl tetrazolium chloride，TTC)染色測量腦梗死體積，TTC染液避光染色1 h，期間翻轉(zhuǎn)腦片數(shù)次使著色均勻。對(duì)每個(gè)腦片進(jìn)行拍照，Image J軟件計(jì)算梗死體積。

1.2.4HIF-1下游靶基因 MCAO模型小鼠腦梗死72 h后處死，斷頭取腦組織，取大腦中動(dòng)脈供血區(qū)腦皮質(zhì)，組織勻漿，用RNA提取試劑盒(美國，Qiagen公司)提取總RNA，用SuperScriptⅢ試劑盒(美國，Invitrogen公司)合成互補(bǔ)DNA，聚合酶鏈反應(yīng)(polymease chain reaction，PCR)檢測HIF-1下游靶基因。PCR反應(yīng)采用SYBR GreenⅠMaster Mix試劑盒(美國，Biored公司)，反應(yīng)體系含上、下游引物各1μL，各基因所用引物見表2，操作均按照說明書進(jìn)行。所有的樣品均設(shè)置副孔，并作標(biāo)準(zhǔn)曲線以計(jì)算各樣本基因表達(dá)量，結(jié)果以目的基因mRNA與β-actin mRNA表達(dá)量的比值(%)表示。

表2　目的基因引物序列

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 應(yīng)用SPSS 20.0軟件，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示，多組計(jì)量資料比較采用單因素方差分析(ANOVA)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2　結(jié)果

2.1腦梗死體積及神經(jīng)功能評(píng)分 MCAO模型建立72 h后不同飲食組小鼠的腦梗死體積測量(圖1)，SD組梗死體積平均為47 mm3，HC組梗死體積平均為48 mm3，神經(jīng)功能評(píng)分均為3分(圖2)。與SD組和HC組相比，KD組腦梗死體積減小(P＜0.05)，平均為28mm3；KD組神經(jīng)功能評(píng)分降低(P＜0.05)，為2分。

圖1　MCAO模型腦梗死體積

圖2　MCAO模型神經(jīng)功能評(píng)分

2.2HIF-1下游靶基因mRNA表達(dá) 大腦中動(dòng)脈供血區(qū)腦皮質(zhì)HIF-1靶基因mRNA，與NC組相比，3個(gè)飲食組缺血腦組織中VEGF、EPO、GLUT1、MCT4 的mRNA表達(dá)均增加，但是KD組mRNA表達(dá)量更高(P＜0.01)分別增至正常對(duì)照組的3.4倍、14倍、3倍和3.7倍；與SD組、HC組相比，KD組表達(dá)量的增加也有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05，圖3)。

圖3　HIF-1下游靶基因mRNA表達(dá)量

3　討論

生酮飲食是一種高脂肪、低碳水化合物飲食，脂肪代謝產(chǎn)生大量酮體包括β羥基丁酸、乙酰乙酸和丙酮，可經(jīng)單羧酸轉(zhuǎn)運(yùn)體轉(zhuǎn)運(yùn)入細(xì)胞，在葡萄糖缺乏時(shí)可作為腦組織的能量來源[10-12]。在MCAO小鼠模型股靜脈注射β羥基丁酸能通過提高缺血期腦組織能量代謝效率而減輕腦組織水腫，減輕梗死程度[11]。實(shí)驗(yàn)觀察到3周生酮飲食可減小MCAO小鼠腦梗死體積，神經(jīng)功能評(píng)分好轉(zhuǎn)，說明生酮飲食可提高腦缺血耐受性。

HIF-1由HIF-1α亞基和HIF-1β亞基組成，HIF-1β亞基恒定表達(dá)，而HIF-1α亞基在細(xì)胞缺氧時(shí)增加，從轉(zhuǎn)錄水平調(diào)節(jié)促細(xì)胞存活信號(hào)通路[7]。正常狀態(tài)下，HIF-1α表達(dá)后脯氨酸殘基被羥基化，通過泛素連接酶介導(dǎo)蛋白酶體迅速降解，細(xì)胞內(nèi)無HIF-1α亞基累積[13]。生酮飲食干預(yù)時(shí)，酮體代謝使得細(xì)胞內(nèi)琥珀酸鹽含量增加[11]，從而抑制脯氨酸羥化酶，未被羥基化的HIF-1α亞基逃脫蛋白酶體的降解，HIF-1α含量增加并與HIF-1β亞基結(jié)合為二聚體，形成有活性的HIF復(fù)合體。HIF-1作為轉(zhuǎn)錄因子可調(diào)節(jié)一系列下游基因，包括VEGF、EPO、GLUT1和MCT4。

VEGF可促進(jìn)血管生成，腦缺血、缺氧時(shí)VEGF在神經(jīng)元和星形膠質(zhì)細(xì)胞表達(dá)快速增加[14]。本研究也觀察到MCAO處理后，3組小鼠缺血腦組織中VEGFmRNA表達(dá)量均有增加。有研究報(bào)道，VEGF可減少低氧狀態(tài)培養(yǎng)的海馬神經(jīng)元死亡[15]，局部補(bǔ)充VEGF減小梗死體積、減輕局部腦水腫[16]，腦缺血損傷后48 h靜脈注射VEGF提高神經(jīng)功能預(yù)后[17]。生酮飲食干預(yù)也觀察到MCAO小鼠腦梗死體積下降、神經(jīng)功能評(píng)分好轉(zhuǎn)，VEGF mRNA表達(dá)量較SD組和HC組更高，提示VEGF參與生酮飲食提高腦缺血耐受作用。

EPO表達(dá)也受HIF-1調(diào)節(jié)，其作為紅細(xì)胞生長因子在缺血、缺氧損傷動(dòng)物模型中也具有增強(qiáng)血管生成的作用，且研究發(fā)現(xiàn)EPO及EPO受體在中樞均有表達(dá)[18-19]。免疫熒光雙染色顯示缺血損傷8 h 后EPO主要在神經(jīng)元表達(dá)，1周后主要在星形膠質(zhì)細(xì)胞表達(dá)[20]，星形膠質(zhì)細(xì)胞表達(dá)的EPO可作為旁分泌因子作用于神經(jīng)元。MCAO模型小鼠建模72 h前缺氧預(yù)適應(yīng)3 h，可使缺血1 h后腦EPO轉(zhuǎn)錄水平增加7倍[11]，在體、離體實(shí)驗(yàn)均支持給予EPO干預(yù)對(duì)神經(jīng)元的缺氧損傷具有保護(hù)作用[3，21]。本研究觀察到MCAO缺血處理后，SD組及HC組小鼠EPO mRNA水平升高，而KD組升高約14倍，說明EPO在生酮飲食提高腦缺血耐受中也發(fā)揮作用。

GLUT1在內(nèi)皮細(xì)胞廣泛分布，是跨血腦屏障轉(zhuǎn)運(yùn)葡萄糖的主要轉(zhuǎn)運(yùn)體[22]。細(xì)胞外葡萄糖濃度很高時(shí)，腦內(nèi)皮細(xì)胞GLUT1表達(dá)減少，跨血腦屏障葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)減少[23]。MCT4屬于單羧酸轉(zhuǎn)運(yùn)體家族，可以跨細(xì)胞膜雙向轉(zhuǎn)運(yùn)乳酸，可攝取細(xì)胞外乳酸儲(chǔ)存作為能量，細(xì)胞內(nèi)乳酸增多時(shí)MCT4也可將其轉(zhuǎn)運(yùn)出細(xì)胞外，防止酸中毒。MCT4主要分布在星形膠質(zhì)細(xì)胞[24]，缺氧時(shí)MCT4可經(jīng)HIF-1誘導(dǎo)表達(dá)增加[25]，星形膠質(zhì)細(xì)胞通過糖酵解釋出乳酸被神經(jīng)元攝取作為能量來源，此過程依賴MCT4[26]。葡萄糖和氧氣剝奪條件下觀察到神經(jīng)元死亡，而神經(jīng)元和膠質(zhì)細(xì)胞共培養(yǎng)體系中神經(jīng)元存活[27]。所以，GLUT1、MCT4是腦缺血時(shí)增加神經(jīng)元能量供應(yīng)的重要分子。本實(shí)驗(yàn)觀察到缺血時(shí)GLUT1、MCT4的mRNA表達(dá)增加，KD組表達(dá)量更高，與其提高腦缺血耐受作用一致，說明GLUT1和MCT4可能通過增加神經(jīng)元供能而發(fā)揮保護(hù)作用。

綜上，本研究證實(shí)了生酮飲食能提高M(jìn)CAO大鼠腦缺血耐受性，其作用可能是通過上調(diào)HIF-1靶基因水平實(shí)現(xiàn)，生酮飲食能否用于缺血性卒中患者仍需進(jìn)一步臨床研究。

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Ketogenic dietmay im prove ischem ic tolerance ofm idd le cerebral artery occlusion m ice through up-regulation of hypoxia inducible factor-1 target genes

GUO Min，CUIMei，DONGQiang
(Department of Neurology，Huashan Hospital，F(xiàn)udan University，Shanghai200040，China)

[Abstract]Objective To explore the effects of ketogenic diet on middle cerebral artery occlusion(MCAO)mice and the role of hypoxia inducible factor-1(HIF-1)target genes in this process.M ethods C57BL/6 mice were random ly allocated into four groups:standard diet group，high carbohydrate diet group，ketogenic diet group and control group.Mice of the 3 intervention groups were fed with corresponding diets for 3 weeks and were afterwards made into MCAO mice models.Control group was fed with standard diet for 3 weeks without MCAO treatment.Stroke volume wasmeasured by 2，3，5-triphenyl tetrazolium chloride(TTC)staining.Neurological function was accessed by Longa scoringmethod.Polymerase chain reaction(PCR)was used to detectmRNA expression quantity of HIF-1 downstream target genes including erythropoietin(EPO)，vascular endothelial growth factor(VEGF)，glucose transport 1(GLUT1)and monocarboxylic transporter 4 (MCT4)in the ischemic region.Results Compared with the other 3 groups，ketogenic diet group showed smaller stroke volume，better neurological score and higher mRNA expression quantity of HIT-1 downstream target genes.Conclusion Ketogenic dietmay improve brain ischemic tolerance of MCAOmice through up-regulation of HIF-1 target genes.

[Key words]Ketogenic diet；Middle cerebral artery occlusion(MCAO)；Hypoxia inducible factor-1(HIF-1)target genes；Stroke

(收稿日期:2015-12-18 本文編輯:徐海琴)

[通訊作者]董 強(qiáng)，E-mail:dong_qiang@fudan.edu.cn

[基金項(xiàng)目]國家自然科學(xué)基金(81271295)

doi:10.3969/j.issn.2095-3097.2016.01.002

[中圖分類號(hào)]R743.33-332

[文獻(xiàn)標(biāo)志碼]A

[文章編號(hào)]2095-3097(2016)01-0005-05