DMPP增強碳酸氫銨防控辣椒疫病的效果與機制*

曹 云王光飛郭德杰馬 艷**羅德旭孫玉東汪國蓮

(1.江蘇省農(nóng)業(yè)科學院農(nóng)業(yè)資源與環(huán)境研究所 南京 210014;2.淮安市農(nóng)業(yè)科學院 淮安 223001)

DMPP增強碳酸氫銨防控辣椒疫病的效果與機制*

曹 云1王光飛1郭德杰1馬 艷1**羅德旭2孫玉東2汪國蓮2

(1.江蘇省農(nóng)業(yè)科學院農(nóng)業(yè)資源與環(huán)境研究所 南京 210014;2.淮安市農(nóng)業(yè)科學院 淮安 223001)

為增強氨殺滅土壤病原微生物、防控作物土傳病害的效果,采用室內(nèi)培養(yǎng)和盆栽試驗的方法,研究了硝化抑制劑DMPP和(或)碳酸氫銨預處理潮土15 d,對土壤理化性質(zhì)和土壤細菌、真菌、氨氧化菌、辣椒疫霉菌數(shù)量的影響以及對辣椒疫病的防效,并對辣椒疫病的發(fā)病率與土壤理化及微生物學性狀進行相關(guān)性分析,為開發(fā)新的防控辣椒疫病的技術(shù)提供依據(jù)。結(jié)果表明,施加DMPP的土壤銨態(tài)氮含量顯著高于對照,而土壤pH、硝態(tài)氮和亞硝態(tài)氮含量顯著低于對照。碳酸氫銨和DMPP配合施用處理土壤15 d,土壤細菌amoA基因拷貝數(shù)和辣椒疫霉菌ITS基因拷貝數(shù)分別降低34.9%(P>0.05)和93.8%(P<0.05);土壤16S rRNA基因拷貝數(shù)比未添加DMPP處理高出54.7%(P<0.05);DMPP對土壤氨氧化古菌amoA基因拷貝數(shù)無顯著影響。栽植辣椒28 d 后,DMPP和碳酸氫銨配合施用處理的辣椒疫霉菌ITS基因拷貝數(shù)最低(2.1×105copies·g-1),其次為DMPP (15.4×105copies·g-1);對照辣椒根際疫霉數(shù)量最高(37.1×105copies·g-1),分別比碳酸氫銨處理、DMPP處理和DMPP和碳酸氫銨配合施用處理高0.4倍、1.4倍和16.8倍。碳酸氫銨或DMPP處理過的土壤栽植辣椒28 d 后,對照辣椒疫病發(fā)病率最高(95.00%),僅施用碳酸氫銨處理發(fā)病率次之(85.00%),DMPP和碳酸氫銨配合施用處理的發(fā)病率最低(32.20%),其防治效果達66.11%。辣椒疫病的發(fā)生率與土壤電導率、硝態(tài)氮含量、疫霉菌數(shù)量正相關(guān),與土壤pH、銨態(tài)氮含量、細菌及真菌數(shù)量負相關(guān)。綜上,碳酸氫銨和DMPP配合施用降低潮土氨氧化細菌的數(shù)量,從而增加銨態(tài)氮而降低硝態(tài)氮含量,提高了土壤pH,進而降低土壤疫霉菌數(shù)量,因而能有效防控辣椒疫病。

硝化抑制劑 3,4-二甲基吡唑磷酸 碳酸氫銨 辣椒 疫病 氨氧化菌

辣椒疫病是由辣椒疫霉(Phytophthora capsici)引起的毀滅性土傳病害,在世界范圍內(nèi)普遍發(fā)生。辣椒疫病在中國辣椒主產(chǎn)區(qū)發(fā)病面積占栽培面積的20%～30%,死苗率達15.1%,發(fā)生嚴重的可減產(chǎn)七成,甚至絕收[1]。目前,該病主要以抗病育種、化學防治、農(nóng)業(yè)防治和生物防治為主[2],但這些方法的防治效果仍然具有一定的局限性,不能有效控制該病害的蔓延。因此,預防與控制該病害的發(fā)生已經(jīng)成為設施辣椒(Capsicum annuum)生產(chǎn)亟待解決的重大難題。

氨在土壤中大量累積是高氮有機物料殺滅土壤病原微生物、防控作物土傳病害的重要機制之一[3],其作用效果與土壤中銨態(tài)氮的濃度與土壤pH有關(guān)。孫莉等[4]研究認為,當培養(yǎng)基pH介于6.5～7.5的范圍內(nèi),銨對尖孢鐮刀菌(Fusarium oxysporum)的抑制效果隨著pH的增加而增強。沈宗專等[5]利用碳酸氫銨產(chǎn)氨類物質(zhì)特性,采用土壤熏蒸的方式有效降低了香蕉(Musa nana)園土壤中尖孢鐮刀菌的數(shù)量,從而降低下茬香蕉枯萎病的發(fā)生。前期研究表明,當溶液中銨濃度增加到500～1 500 mg·L-1時,對辣椒疫霉菌游動孢子萌發(fā)的抑制率可達77.6%～95.4%[6]。與之相反,土壤硝態(tài)氮的濃度與辣椒疫霉菌數(shù)量在一定程度上呈正比[7]?？梢?在一定pH下,增加土壤中銨態(tài)氮濃度,降低硝態(tài)氮濃度可以有效抑制辣椒疫霉菌的生長,從而抑制辣椒疫病的發(fā)生。

在通氣良好的條件下,施入土壤中的銨態(tài)氮,除了部分發(fā)生氨揮發(fā)、生物吸收和土壤吸附等作用被消耗和滯留外,絕大部分在硝化微生物的作用下轉(zhuǎn)化為硝態(tài)氮。研究證明,新型硝化抑制劑3,5-二甲基吡唑(DMPP)具有比目前國內(nèi)外研究應用較為廣泛的硝化抑制劑雙氰胺(DCD)更為顯著的硝化抑制效果[8-9]。DMPP能有效抑制土壤的硝化作用,延長NH-N在土壤中的保留時間,降低土壤淋出物中NO的濃度,而土壤NO含量與辣椒疫病的發(fā)生率呈正相關(guān)。將碳酸氫銨和DMPP配合施用,對土壤中辣椒疫霉菌的殺滅效果如何,以及土壤中除辣椒疫霉菌外的其他微生物對DMPP的響應如何目前尚不十分清楚。本研究通過在潮土中添加碳酸氫銨和(或)DMPP進行15 d的室內(nèi)培養(yǎng)試驗,并用培養(yǎng)后的土壤進行盆栽防效試驗,評價不同處理對辣椒疫病的防控效果及其與土壤理化性狀變化的相關(guān)性,為開發(fā)防控保護地辣椒疫病新技術(shù)提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試材料

供試辣椒品種為‘蘇椒5號’。供試土樣采自江蘇省淮安市青浦區(qū)蔬菜種植大棚0～20 cm耕層土壤,為潮土。土樣經(jīng)風干,剔除雜質(zhì)并磨細后過2 mm篩備用。供試土壤的基本理化性質(zhì)為:pH 8.54、有機質(zhì)19.90 g·kg-1,全氮0.94 g·kg-1,硝態(tài)氮133.12 mg·kg-1,銨態(tài)氮5.06 mg·kg-1,速效磷144.83 mg·kg-1,速效鉀141.12 mg·kg-1

供試碳酸氫銨和硝化抑制劑3,4-二甲基吡唑磷酸(DMPP)均為分析純試劑。供試菌株辣椒疫霉菌(Phytophthora capsici L.)由江蘇省農(nóng)業(yè)科學院農(nóng)業(yè)資源與環(huán)境研究所提供。

1.2 試驗設計

在風干過篩后的土壤中接種辣椒疫霉游動孢子液,使土壤中辣椒疫霉菌接種濃度為500 CFU·g-1。設4個處理:1)土壤中不添加碳酸氫銨,也不添加DMPP,對照(CK);2)土壤中加入DMPP(DMPP); 3)土壤中加入碳酸氫銨(AB);4)土壤中加入碳酸氫銨和DMPP(AB+DMPP)。DMPP和碳酸氫銨溶于水后均勻噴灑在土壤上,碳酸氫銨的加入量為100 mg(N)·kg-1(土),DMPP的加入量為施入總氮量的1%。分別稱取14 kg充分混勻的土壤裝于塑料桶(底徑×口徑×高=25 cm×34 cm×30 cm)中,調(diào)節(jié)土壤含水量為田間最大持水量(WHC)的60%,風干土含水量按3%計。每個處理2個重復(桶)。將土樣放于25℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)15 d,封口,扎孔保證通氣。培養(yǎng)期間,每隔2 d通過稱量法補足培養(yǎng)過程中損失的水分。培養(yǎng)結(jié)束后將桶中土壤倒出并充分混合均勻后,分裝在10個盆缽中。每個盆缽種植6葉期辣椒苗1株,移栽28 d(即共培養(yǎng)43 d)后統(tǒng)計辣椒發(fā)病率和病情指數(shù)。培養(yǎng)0 d、2 d、4 d、8 d、15 d后從桶中隨機采取3個土樣,移栽后28 d(培養(yǎng)的43 d)采集辣椒根際土壤,測定土壤pH、電導率、含水量、硝態(tài)氮、亞硝態(tài)氮和銨態(tài)氮的含量,培養(yǎng)的15 d和43 d的土樣同時測定細菌、真菌和辣椒疫霉菌、氨氧化細菌(AOB)、氨氧化古菌(AOA)的數(shù)量。

1.3 病情調(diào)查方法

辣椒幼苗移栽后,每天觀察辣椒生長情況。移苗9 d后發(fā)現(xiàn)病原菌對照處理開始萎蔫發(fā)病,之后每天調(diào)查記錄各處理辣椒疫病發(fā)病情況,至試驗結(jié)束時,計算發(fā)病率和病情指數(shù)。辣椒疫病病情分級標準參照易圖永等[10]的方法,稍作調(diào)整,如下:0級,健康;1級,莖基變黑,但植株不萎焉;2級,莖基變黑1～2 cm,1/3以下葉片萎焉偶脫落;3級,莖基變黑2 cm以上,2/3以上葉片明顯萎焉;4級,植株全部枯死。

1.4 土壤總DNA的提取與熒光定量PCR分析

將采集晾干的土樣研碎并過篩(1 mm),裝入聚乙烯袋保存在-70℃冰箱中用于 DNA提取。土壤DNA 的提取采用 FastDNA?Spin soil kit(MP Biomedicals,Solon,OH)試劑盒,提取方法參照試劑盒說明書。

土壤中細菌16S rDNA上游引物EUB338f(5′-GCTGCCTCCCGTAGGAGT-3′)、下游引物907r(5′-CCGTCAATTCMTTTRAGTT-3′);真菌18S rDNA上游引物EUK309f(A 5′-CCGGAGAGGGAGCCTG-3′)、下游引物EUK516r(5′-ACCAGACTTGCCCTCC-3′)。土壤中氨氧化細菌amoA基因上游引物amoA1F(5′-GGGGTTTCTACTGGTGGT-3′)、下游引物amoA2R (5′-CCCCTCKGSAAAGCCTTCTTC-3′);氨氧化古菌amoA基因上游引物為amoAF(5′-STAATGGTCTG GCTTAGACG-3′)、下游引物Arch-amoAR(GCGGCC ATCCATCTGTATGT)[11];辣椒疫霉菌ITS上游引物CAPFW(5′-TTTAGTTGGGGGTCTTGTACC-3′)、下游引物CAPRV1(5′-CCTCCACAACCAGCAACA-3′)[12]。熒光定量PCR擴增體系為:1X SYBR?Premix Ex TaqTM(2X)(Takara寶生物工程有限公司)混合液10μL,上、下游引物各0.5μL,DNA模板2μL,ddH2O 7μL。反應程序:95℃預變性2 min,94℃變性30 s,60℃退火延伸34 s,40個循環(huán)。每個樣品設3個重復,以無菌水代替目標基因DNA為空白對照,定量PCR分析在ABI 7500 Real-time PCR system擴增儀上進行。

1.5 土壤常規(guī)理化性狀的分析

土壤的銨態(tài)氮、亞硝態(tài)氮和硝態(tài)氮的質(zhì)量濃度,采用2 mol·L-1KCl溶液浸提-流動分析儀法。用pH計測定土壤pH(水∶土=2.5∶1浸提),用電導率儀測定土壤電導率(水∶土=2.5∶1浸提)[13]。

1.6 數(shù)據(jù)分析

病情指數(shù)計算公式為:

采用SPSS 16.0軟件進行單因素方差分析,用SigmaPlot 10.0軟件作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同處理對辣椒疫病的防治以及對辣椒疫霉菌的抑制效果

從圖1可以看出,發(fā)病率最高的處理為CK(95.00%),其次為碳酸氫銨(AB)處理(85.00%)和DMPP處理(60.00%);AB+DMPP處理的發(fā)病率最低(32.20%),防治效果66.11%。各處理病情指數(shù)的變化趨勢與發(fā)病率一致,CK處理平均病情指數(shù)最高,其次為AB,而AB+DMPP處理病情指數(shù)最低(圖1)。

圖1 不同處理對辣椒疫病的發(fā)病率和病情指數(shù)的影響Fig.1 Effect of different treatments on chili pepper Phytophthora blight disease incidence and disease index

熒光定量PCR對4個處理中辣椒疫霉定量結(jié)果(圖2)表明,兩個采樣時期所有處理均能檢測到熒光信號,土壤培養(yǎng)15 d(15 DAT)各疫霉的數(shù)量介于1.5×105～24.3×105copies·g-1(土),CK處理疫霉菌數(shù)量最多,其次為AB處理,AB+DMPP處理疫霉菌數(shù)量最少。辣椒移栽后28 d(即土壤處理43 d后,43 DAT)各處理疫霉菌數(shù)量均有不同程度的上升,AB處理疫霉菌數(shù)量增加1.1倍,但各處理疫霉菌趨勢與15 DAT相似;4個處理的病原菌數(shù)量與疫病發(fā)病率呈現(xiàn)較好的對應關(guān)系:發(fā)病率最低的AB+DMPP處理,其疫霉數(shù)量最少(2.1×105copies·g-1),顯著低于其他各處理,其次為DMPP(15.4×105copies·g-1),發(fā)病率最高的CK處理,辣椒根際疫霉數(shù)量最高(37.1×105copies·g-1),分別比AB、DMPP和AB+DMPP處理高0.4倍、1.4倍和16.8倍。

2.2 不同處理對土壤氨氧化細菌、氨氧化古菌和總細菌、總真菌數(shù)量的影響

從圖3可以看出,氨氧化細菌amoA基因拷貝數(shù)介于5×107～16.1×108copies·g-1,且兩個采樣時期相比差異不大。AB處理氨氧化細菌amoA基因拷貝數(shù)最高,其次是CK和AB+DMPP處理。DMPP處理氨氧化細菌amoA基因拷貝數(shù)最低。DMPP顯著降低了土壤氨氧化細菌amoA基因拷貝數(shù),DMPP處理和AB+DMPP處理氨氧化細菌amoA基因拷貝數(shù)分別比CK和AB低84.7%～34.9%、69.5%～92.9%。古菌amoA基因拷貝數(shù)介于2.4×107～4.5×108copies·g-1。DMPP對古菌amoA基因拷貝數(shù)的影響沒有明顯規(guī)律。細菌16S rRNA基因拷貝數(shù)介于1.09×1011～7.36×1011copies·g-1,除AB+DMPP處理外,栽植辣椒增加了土壤中16S rRNA基因拷貝數(shù),AB+DMPP處理和DMPP處理的土壤16S rRNA基因拷貝數(shù)平均值比未添加DMPP處理的高出54.7%。真菌18S rRNA基因拷貝數(shù)介于1.26×107～1.61×108copies·g-1。除AB+DMPP處理外,栽植辣椒后真菌18S rRNA基因拷貝數(shù)增加了2.5～4.9倍。DMPP處理土壤15d后,對真菌18S rRNA基因拷貝數(shù)影響不顯著,但栽植辣椒28d后,施加DMPP的處理真菌18S rRNA基因拷貝數(shù)比未施加的數(shù)量低55.6%～72.3%(圖3)。

2.3 不同處理對土壤銨態(tài)氮、硝態(tài)氮、亞硝態(tài)氮含量的影響

各處理的土壤銨態(tài)氮含量隨硝化作用的進行逐漸降低(圖4),但DMPP處理的下降速率顯著低于CK。在培養(yǎng)的第15 d,CK和AB的土壤銨態(tài)氮濃度下降了69.6%和79.9%,而DMPP處理和AB+DMPP處理分別下降了47.2%和38.7%。整個培養(yǎng)期間,添加DMPP處理銨態(tài)氮含量均保持較高水平。同培養(yǎng)時期相比,培養(yǎng)8 d后添加DMPP處理銨態(tài)氮含量顯著高于未添加DMPP處理。

圖3 不同處理土壤氨氧化細菌、氨氧化古菌、細菌和真菌數(shù)量Fig.3 Abundance of soil AOB,AOA,total bacteria and total fungi under different treatments

圖4 不同處理下土壤銨態(tài)氮、硝態(tài)氮、亞硝態(tài)氮含量變化的趨勢Fig.4 Change trends of ammonium,nitrate and nitrite contents in soil under different treatments

所有處理土壤硝態(tài)氮量隨培養(yǎng)時間的推移逐漸升高(圖4),但其土壤硝態(tài)氮含量在AB和CK中急速上升,而在DMPP和AB+DMPP處理中上升緩慢。盆栽試驗結(jié)束時(培養(yǎng)的第43 d),CK、AB處理土壤中硝態(tài)氮含量達到峰值(379 mg·kg-1、474 mg·kg-1),較初始值分別上升了 279 mg·kg-1、364 mg·kg-1, DMPP、AB+DMPP處理只分別增加了151 mg·kg-1、225 mg·kg-1。整個培養(yǎng)期間,AB處理硝態(tài)氮含量始終最高,DMPP處理硝態(tài)氮含量始終最低。

亞硝態(tài)氮是硝化過程的中間產(chǎn)物。試驗表明, AB處理的土壤在培養(yǎng)的前4 d出現(xiàn)了較高濃度的亞硝態(tài)氮(圖4),在第4 d達到峰值為25 mg·kg-1,而施加DMPP的各處理均能夠顯著抑制土壤亞硝態(tài)氮的產(chǎn)生(P<0.05),培養(yǎng)7 d后基本檢測不到。

2.4 不同處理對土壤pH和電導率的影響

由圖5A可知,AB處理和DMPP處理pH在培養(yǎng)后第 2 d上升至最高,分別為 8.78(AB)和 8.81 (DMPP),AB+DMPP處理的pH峰值出現(xiàn)在第4 d (8.71),而后各處理的pH 都呈下降趨勢(4～15 d);與銨態(tài)氮的變化相似,AB處理下降幅度最大,DMPP 和AB+DMPP處理pH的下降幅度小于其他處理。整個培養(yǎng)過程中,DMPP和AB+DMPP處理土壤的pH始終保持在較高水平,但兩處理間差異不顯著。培養(yǎng)8 d后,AB處理土壤pH最低。培養(yǎng)15 d后(即辣椒移栽后),各處理土壤pH趨于穩(wěn)定。

圖5B顯示,隨著培養(yǎng)時間的延長,土壤電導率呈增長趨勢,其中AB處理電導率值最大。與土壤pH值相反,培養(yǎng)7 d后,添加了DMPP的兩個處理(PC+DMPP、AB+DMPP)土壤電導率始終低于未添加DMPP的處理。

圖5 不同處理的土壤pH(A)和電導率(B)變化趨勢Fig.5 Change trends of pH(A)and EC(B)of soil under different treatments

2.5 土壤理化性質(zhì)和微生物指標的主成分分析

主成分分析結(jié)果顯示(圖6),第1主成分、第2主成分分別解釋了樣本中68.2%、15.7%的變異。第1主成分將是否添加DMPP的處理區(qū)分開,添加DMPP的兩個處理:DMPP和AB+DMPP排在第1主成分的正軸,未添加DMPP的CK和AB處理排在第1主成分的負軸,說明DMPP對土壤肥力和微生物數(shù)量影響很大。第2主成分將是否添加碳酸氫銨的處理區(qū)分開,AB以及AB+DMPP排在第2主成分的正軸,CK以及DMPP排在第2主成分的負軸。辣椒疫病的發(fā)生率DI與土壤pH、銨態(tài)氮濃度、氨氧化古菌、細菌和真菌數(shù)量負相關(guān),與土壤EC、硝態(tài)氮及亞硝態(tài)氮含量、氨氧化細菌及疫霉菌數(shù)量正相關(guān)。土壤中疫霉菌的數(shù)量與銨態(tài)氮濃度呈負相關(guān),與硝態(tài)氮及亞硝態(tài)氮濃度呈正相關(guān)。土壤肥力指標之間也有明顯相關(guān)關(guān)系:如EC與銨態(tài)氮、硝態(tài)氮濃度之間,pH與EC、銨態(tài)氮、硝態(tài)氮濃度之間相關(guān)性較高。

圖6 各處理辣椒疫病發(fā)生率與土壤理化性狀及微生物數(shù)量的主成分分析Fig.6 Principal component analysis(PCA)of the disease incidence of chili pepper hytophthora blight,populations of different microbia and soil chemical properties under different treatments at 15 days after treatment

3 討論

近年來,由于不合理的耕作管理引起的土壤連作障礙問題逐漸受到人們的關(guān)注。土壤連作障礙表現(xiàn)為土壤養(yǎng)分供應比例失調(diào)(如硝態(tài)氮的累積)、土壤酸化、次生鹽堿化、微生物量和微生物活性降低、有害生物(如病原菌)的增加等[14-15]。疫霉是一種普遍存在的重要土傳病原菌,在世界范圍內(nèi)危害辣椒、番茄(Lycopersicon esculentum)、西葫蘆(Cucurbita pepo)等多種作物,常給農(nóng)作物生產(chǎn)帶來毀滅性經(jīng)濟損失[1-2]。辣椒疫病的發(fā)病程度除受到植株健康狀況、環(huán)境因子,如土壤溫度、濕度、養(yǎng)分狀況,耕作制度和栽培管理條件等影響外[16],還取決于根際和土體土壤中的病原菌數(shù)量及遺傳變異程度和土壤微生物區(qū)系[17-18]。在本試驗中,施用DMPP后,辣椒疫病的發(fā)生率與土壤硝態(tài)氮含量、電導率、疫霉菌數(shù)量顯著正相關(guān),而與土壤pH、銨態(tài)氮含量、細菌及真菌數(shù)量顯著負相關(guān)。采用碳酸氫銨結(jié)合DMPP處理土壤后15 d,土壤中的銨態(tài)氮含量較高,硝態(tài)氮含量較低,疫霉菌數(shù)量顯著減少,土壤中病原菌源菌基數(shù)越低,后期病害發(fā)生率就越低[19-21]。

氨在土壤中大量累積是含氮有機物抑制土壤病原菌防控作物土傳病害的重要機制之一[3]。Chun和Lockwood[22]研究認為,土壤中 P.cinnamomi和 P. parasitica數(shù)量的下降與氨對土壤溶液中孢子囊的形成和萌發(fā)有關(guān)。病原菌與土壤溶液中的氨接觸時間越長,孢子囊萌發(fā)率越低[3]。銨抑制病原微生物的機理在于:氨化作用促使土壤pH在短時間內(nèi)升高,pH的升高使得土壤溶液中NH3的濃度迅速升高,因此能有效殺滅病原菌[3,22-23]。DMPP對土壤硝化過程的抑制作用表現(xiàn)在土壤銨態(tài)氮濃度的升高和硝態(tài)氮濃度的降低,這種作用在此培養(yǎng)試驗取樣的4～15 d表現(xiàn)顯著,這與薛妍等[24]、石美等[25]的研究結(jié)果一致。本試驗中,DMPP處理土壤15 d對真菌數(shù)量影響不明顯,但顯著降低了土壤辣椒疫霉菌的數(shù)量,這與孫莉等[4]的研究結(jié)果即硝化抑制劑對尖孢鐮刀菌生長沒有影響不一致,其原因可能是辣椒疫霉病菌屬于卵菌,其細胞壁的主要成分是纖維素;而尖孢鐮刀菌是真菌中進化程度較高一類,其細胞壁主要成分是幾丁質(zhì),DMPP對辣椒疫霉菌的抑制效果可能與其的細胞壁成分有關(guān),但確切的作用機理尚需進一步研究。

土壤硝化作用是在硝化微生物參與下完成的生物化學反應。硝化抑制是通過選擇性的對土壤硝化微生物直接快速且強烈地抑制,來實現(xiàn)其硝化抑制作用的。Di等[26]對新西蘭高氮草地土壤的研究表明土壤中施加DMPP可顯著抑制AOB的生長,改變其群落結(jié)構(gòu),但對AOA無顯著影響。而Zhang等[27]得出AOA在強酸性土壤硝化作用中占據(jù)主導地位的結(jié)論。本研究結(jié)果表明,DMPP顯著降低了土壤中AOB的數(shù)量,而對AOA數(shù)量影響不大,這可能與土壤中起主導作用的氨氧化微生物類群有關(guān)。細菌是土壤微生物中數(shù)量最多的一個類群,約占土壤微生物總量的70%～90%。本研究中DMPP處理雖然降低了氨氧化細菌的數(shù)量,但增加了土壤細菌總量,可能是因為氨氧化菌是細菌群落中參與氮素轉(zhuǎn)化生理菌群,在細菌群落中所占的比例很小,且生長增殖速度緩慢,對土壤細菌總量的貢獻不大。此外, DMPP作為一種有機碳化合物,其本身及其在土壤中的降解產(chǎn)物可能為微生物提供了可利用的C源,從而促進了土壤微生物的增殖[28];所以盡管本研究中DMPP處理土壤氨氧化菌數(shù)量顯著降低,但土壤總細菌數(shù)量仍然比對照高。土壤真菌數(shù)量對DMPP響應不明顯,這是因為與細菌相比,土壤真菌可能對低劑量DMPP反應不敏感[28]。

在整個培養(yǎng)期內(nèi),土壤的電導率與銨態(tài)氮含量負相關(guān),而與硝態(tài)氮含量正相關(guān),因為一部分銨態(tài)氮被吸附,另一部分還可進入黏土礦物的晶體中,成為固定態(tài)銨,而土壤膠體對硝態(tài)氮吸附能力較弱,因此硝態(tài)氮對土壤電導率的貢獻較大[29]。各處理土壤pH和銨態(tài)氮的變化趨勢相同,表現(xiàn)為先上升后下降,這主要與土壤中的氮素轉(zhuǎn)化有關(guān):碳酸氫銨施入土壤后,在適宜水分條件下會迅速水解轉(zhuǎn)化使土壤pH上升,隨后發(fā)生的硝化作用銨態(tài)氮氧化為硝態(tài)氮,此過程釋放H+導致土壤pH下降。本研究中硝化抑制劑處理土壤pH顯著高于不施用DMPP處理。這是由于硝化抑制劑施用后,土壤中較長時間保持較高的NH-N含量和較低的 NO-N含量,造成土壤pH的升高[29],這更加有利于土壤溶液中游離氨濃度的提高,增強殺菌效果。

4 結(jié)論

在DMPP作用下,土壤氨氧化細菌(AOB)數(shù)量受到抑制,使得銨態(tài)氮濃度在較長時間內(nèi)保持較高水平,而硝態(tài)氮含量顯著下降,同時土壤pH上升,導致土壤中疫霉菌數(shù)量下降,辣椒疫病發(fā)生率顯著下降。但由于銨對土壤病原微生物的殺滅作用受到土壤性質(zhì)(質(zhì)地、pH等)的影響,因此利用該方法防控土傳病害的土壤適宜性,以及針對不同病害特征的處理方式還有待進一步的研究。

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DMPP-enhanced control efficacy of chili pepper Phytophthora blight using ammonium bicarbonate:Action effects and mechanisms*

CAO Yun1,WANG Guangfei1,GUO Dejie1,MAYan1**,LUO Dexu2,SUN Yudong2,WANG Guolian2
(1.Institute of Agricultural Resources and Environment,Jiangsu Academy of Agricultural Sciences,Nanjing 210014,China; 2.Huai’an Academy of Agricultural Sciences,Huai’an 223001,China)

Phytophthora blight of chili pepper,caused by oomycetes of Phytophthora capsici,has been reported to be a key limiting factor of chili pepper production worldwide.Increased public interest in protecting the environment and human health has prompted research in agronomic strategies that reduce the use of fungicides.Alternative control methods with high efficacy, low cost and limited environmental effect are high-priority research areas for sustainable agriculture.Under the same incubation conditions(soil moisture of 60%of field capacity,temperature of 25℃ and inoculation concentration of P.capsici of 500 CFU·g-1),DMPP(1%applied pure N)and ammonium bicarbonate(AB)[100 mg(N)·kg-1]were added tofluvo-aquic soil and incubated for 15 d.Soil without any addition of DMPP and/or AB was set as the control.After incubation,DMPP orAB-treated soil was used to grow chili pepper in a pot experiment for 28 d.The effect of DMPP and AB application on disease incidence of Phytophthora blight of chili pepper was then compared.The soil physio-chemical and microbial responses(soil pH,electric conductivity,concentrations of different forms of nitrogen;numbers of total bacteria,fungi,P.capsici and ammonia-oxidizing bacteria)to the addition of DMPP and AB were determined.The relationship between Phytophthora blight disease incidence and soil phyiso-chemical and microbial characteristics was evaluated.The aim of the study was to investigate the control effects of DMPP-enhanced ammonium biocarbonate on Phytophthora blight of chili pepper and correlation with soil physio-chemical properties,and provided technological support for control of Phytophthora blight of chili pepper of greenhouse. The results suggested that compared with the control,the contents of soil ammonium nitrogen in DMPP and DMPP+AB treatments were higher,and the contents of nitrate and nitrite nitrogen significantly lower.The application of DMPP for 15 d decreased copied gene numbers of bacterial amoA and P.capsici ITS genes by 34.9%(P>0.05)and 93.8%(P<0.05), respectively.The copied 16S rRNA gene number increased by 54.7%(P<0.05)compared with non-DMPP treatments. However,the copied numbers of fungal 18S rRNA gene and archaeal amoA gene were not significantly affected by DMPP. After incubation for 15 d,soil from each treatment was put into pots and ten chili pepper plants grown in each pot for 28 d.The P.capsici density was lowest in AB+DMPP(2.1×105copies·g-1)treatment,followed by DMPP(15.4×105copies·g-1).The control experiment had the highest number of pathogen(37.1×105copies·g-1),which was 0.4-fold,1.4-fold and 16.8-fold higher than those of AB,DMPP and AB+DMPP,respectively.The results from the pot experiment showed that the control treatment had the highest disease incidence(95.00%),followed by AB treatment(85.00%)and AB+DMPP treatment had the lowest disease incidence(32.20%).The efficacy of Phytophthora blight disease control by AB+DMPP treatment was 66.11%.Disease incidence was positively correlated with soil electrical conductivity,nitrate content and P.capsici population,but negatively correlated with soil pH,ammonium content and bacterial and fungal populations.The above results suggested that the control of chili pepper Phytophthora blight by the combined application of DMPP and ammonium bicarbonate decreased the number of ammoniaoxidizing bacteria,which,in turn,increased ammonium content,but also decreased soil nitrate content.Thus P.capsici population reduced under high concentration of ammonium,which effectively controlled chili pepper Phytophthora blight.

Nitrification inhibitor;3,4-dimethyl pyrazole phosphate(DMPP);Ammonium bicarbonate;Chili pepper; Phytophthora blight;Ammonia-oxidizing bacteria

S

A 文章編號:1671-3990(2016)10-1382-09

10.13930/j.cnki.cjea.160322

* 農(nóng)業(yè)部公益性行業(yè)專項(201303023)和江蘇省科技廳支撐計劃(BE2014343)資助

**通訊作者:馬艷,主要研究方向為保護地土壤質(zhì)量調(diào)控。E-mail:myjaas@sina.com

曹云,主要研究方向為農(nóng)業(yè)廢棄物資源化與新型肥料研制。E-mail:youngtsao66@126.com

2016-04-06 接受日期:2016-05-09

* This work was supported by the Special Fund for Agricultural Scientific Research in the Public Interest(201303023),and the Support Project of Science and Technology Department of Jiangsu Province of China(BE2014343).

**Corresponding author,E-mail:myjaas@sina.com

Received Apr.6,2016;accepted May 9,2016