黑果枸杞葉多糖LRLP3的結(jié)構(gòu)、抗氧化活性及免疫活性

劉　洋，殷　璐，龔桂萍，彭藝芳，黃琳娟，王仲孚

(西北大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，西部資源生物與現(xiàn)代生物技術(shù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，西安710069)

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黑果枸杞葉多糖LRLP3的結(jié)構(gòu)、抗氧化活性及免疫活性

劉洋，殷璐，龔桂萍，彭藝芳，黃琳娟，王仲孚

(西北大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，西部資源生物與現(xiàn)代生物技術(shù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，西安710069)

摘要黑果枸杞葉經(jīng)水提醇沉，離子交換柱層析和凝膠柱層析分離純化，得到平均分子量為79400的均一多糖組分LRLP3.對(duì)該多糖的理化性質(zhì)、結(jié)構(gòu)、抗氧化活性及免疫活性的研究結(jié)果表明，LRLP3為多分支結(jié)構(gòu)，主鏈為( 1→3)βGalp，大部分半乳糖6位存在分支;支鏈由( 1→6)βGalp，( 1→4)βGalp，( 1→3)βAraf，( 1→3)αArap，( 1→5)βAraf和( 1→2，4)αRhap組成，非還原末端由αAraf，βGalp和βGlcp組成.LRLP3具有較強(qiáng)的還原能力，可顯著清除1，1-二苯基-2-三硝基苯肼( DPPH)自由基、羥自由基和超氧陰離子自由基，有效抑制Cu2+/H2O2誘導(dǎo)的蛋白氧化損傷和H2O2誘導(dǎo)的細(xì)胞氧化損傷.LRLP3在體外對(duì)未經(jīng)誘導(dǎo)和經(jīng)刀豆蛋白( ConA)或脂多糖( LPS)誘導(dǎo)的小鼠脾細(xì)胞增殖均有促進(jìn)作用.

關(guān)鍵詞黑果枸杞葉;多糖;結(jié)構(gòu)分析;抗氧化活性;免疫活性

黑果枸杞( Lyciumruthenicum Murray)系茄科( Solanaceae)枸杞屬( Lycium)植物，主要分布于我國(guó)西北地區(qū)，是民族醫(yī)藥中的常用藥材［1］.研究發(fā)現(xiàn)，黑果枸杞果實(shí)中含有氨基酸、維生素、礦物質(zhì)和微量元素等豐富的營(yíng)養(yǎng)成分以及多糖、色素和黃酮等活性成分［2～4］，其果實(shí)提取物具有抗氧化、降血脂、抗癌、抗動(dòng)脈硬化和免疫調(diào)節(jié)等功效［5～7］.近年來(lái)，已有對(duì)黑果枸杞葉活性成分進(jìn)行研究的報(bào)道.白紅進(jìn)等［8］測(cè)定了黑果枸杞葉片甲醇提取物的抗氧化活性，發(fā)現(xiàn)其對(duì)1，1-二苯基-2-三硝基苯肼( DPPH)自由基、羥自由基和超氧陰離子自由基均有較好的清除能力;李進(jìn)等［9］發(fā)現(xiàn)黑果枸杞葉片總黃酮能顯著抑制小鼠紅細(xì)胞溶血，增強(qiáng)小鼠血清抗活性氧能力，抑制小鼠肝組織脂質(zhì)過(guò)氧化產(chǎn)物丙二醛( MDA)的生成.多糖是一類(lèi)具有重要生物活性的物質(zhì)［10～14］，且這些生物活性與其理化性質(zhì)和結(jié)構(gòu)有著密切關(guān)系［15～17］.

本文從黑果枸杞葉中分離純化得到均一性多糖組分LRLP3，對(duì)其理化性質(zhì)、化學(xué)結(jié)構(gòu)、抗氧化活性和免疫活性進(jìn)行了研究，從分子水平上為闡明多糖的構(gòu)效關(guān)系奠定了理論基礎(chǔ).

1　實(shí)驗(yàn)部分

1.1試劑與儀器

黑果枸杞葉子收集于新疆柴達(dá)木盆地; Hela細(xì)胞購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞所; Balb/c雄性小鼠購(gòu)自第四軍醫(yī)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心.DEAE-纖維素( DEAE-52)購(gòu)自Whatman公司; Sephadex G-100填料購(gòu)自Pharmacia公司;雞蛋白蛋白( OVA)、牛血清白蛋白( BSA)、考馬斯亮藍(lán)、胰蛋白酶、噻唑藍(lán)( MTT)、脂多糖( LPS)、刀豆蛋白( ConA)、甲基瑪琳硼烷絡(luò)合物、吩嗪硫酸甲酯( PMS)、氯化硝基四氮唑藍(lán)( NBT)、1，1-二苯基-2-三硝基苯肼( DPPH)和二甲基亞砜( DMSO)均購(gòu)自Sigma公司;其它試劑均為分析純.

Waters 2695型高效液相色譜儀(配置2414示差折光檢測(cè)器，美國(guó)Waters公司) ; Perkin Elmer Lambda 25 UV/VIS紫外分光光度計(jì)(美國(guó)鉑金埃爾默公司) ; Shimadzu GC 2010型氣相色譜儀，rtx-50型色譜柱(日本島津公司) ; Shimadzu GCMS-QP 2010型氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀，rtx-5型色譜柱(日本島津公司) ; Multiskan Ascent酶標(biāo)儀(美國(guó)熱電公司) ; Thermo-LTQ XL液相質(zhì)譜聯(lián)用儀(美國(guó)熱電公司).

1.2實(shí)驗(yàn)過(guò)程

1.2.1 LRLP3的分離和純化將黑果枸杞葉陰干，粉碎過(guò)篩后，用80℃熱水提取、濃縮，經(jīng)醇沉、Savage法［18］脫蛋白、透析(透析袋截留分子量為3000)、凍干得黑果枸杞葉粗多糖.粗多糖經(jīng)DEAE-52離子交換柱和Sephadex G-100凝膠過(guò)濾色譜柱分離純化后得到多糖組分LRLP3.

1.2.2 LRLP3的理化性質(zhì)測(cè)定采用高效凝膠滲透色譜法［19］( HPGPC)對(duì)LRLP3的相對(duì)分子量進(jìn)行測(cè)定.

采用苯酚-硫酸法［20］和Bradford法［21］對(duì)LRLP3的總糖和蛋白質(zhì)含量進(jìn)行測(cè)定.

采用Jacob Lehrfeld法［22］對(duì)LRLP3的單糖組成進(jìn)行分析.GC程序升溫過(guò)程: 180℃保持2 min，以6℃/min的速度升溫至210℃，再以0. 3℃/min的速度提升到215℃，最后以6℃/min的速度升溫至240℃保持30 min.載氣為氮?dú)?空氣，柱流速0. 88 mL/min，壓力110 kPa，進(jìn)樣量0. 5 μL;分流比19∶1.

采用KBr壓片法［23］，于4000～400 cm－1范圍內(nèi)進(jìn)行紅外光譜測(cè)定;用紫外分光光度計(jì)于200～400 nm波長(zhǎng)范圍內(nèi)對(duì)LRLP3進(jìn)行紫外光譜掃描.

1.2.3 LRLP3的結(jié)構(gòu)表征部分酸水解:稱(chēng)取40 mg干燥L(fēng)RLP3樣品，加入10 mL 0. 02 mol/L的H2SO4，于80℃攪拌反應(yīng)12 h.對(duì)水透析3 d后，取透析袋內(nèi)溶液凍干得到主鏈LRLP3-I;將袋外溶液減壓濃縮后用碳酸鋇溶液中和，離心取上層清液，凍干后得到支鏈LRLP3-O.按照LRLP3的單糖組成分析方法對(duì)LRLP3-I和LRLP3-O分別進(jìn)行單糖組成分析.

甲基化分析:采用Need法［24］對(duì)樣品LRLP3和LRLP3-I進(jìn)行甲基化.甲基化過(guò)程重復(fù)3次，由紅外光譜檢測(cè)發(fā)現(xiàn)樣品甲基化完全.將全甲基化樣品加入2 mL甲酸中，于100℃水解3 h去聚合，減壓抽干后加入甲醇抽干，重復(fù)3次以去除殘留甲酸.然后，加入三氟乙酸( TFA，2 mol/L)于121℃水解2 h，加蒸餾水抽干數(shù)次，用硼氫化鈉還原1. 5 h，抽干后進(jìn)行乙?；?，得到部分甲基化的糖醇乙酸酯衍生物，對(duì)其進(jìn)行GC和GC-MS分析.程序升溫條件:于140℃保持3 min，然后以2℃/min的速度升溫至250℃并保持20 min.

LRLP3-O的ESI-MS分析:取少量LRLP3-O過(guò)陽(yáng)離子交換樹(shù)脂除去鹽，用氮?dú)獯蹈珊笕苡谶m量甲醇溶液中，于正離子模式下進(jìn)行ESI-MS檢測(cè)［25］.

LRLP3的核磁共振分析:取30 mg干燥L(fēng)RLP3樣品溶于1 mL高純度重水中，凍干后再溶于重水中，反復(fù)交換3次，將樣品用重水溶于5 mm核磁管中，于30℃在600 MHz核磁共振儀( Varian)上采集1H NMR和13C NMR譜.

1.2.4 LRLP3的抗氧化活性采用Oyaizu等［26］的方法測(cè)定LRLP3的還原能力.

采用Shimada等［27］的方法測(cè)定LRLP3清除DPPH自由基的能力.

采用Fenton系統(tǒng)［28］測(cè)定LRLP3清除羥自由基的能力.

采用PMS-NADH-NBT系統(tǒng)［29］測(cè)定LRLP3清除超氧陰離子的能力.

其中，As為樣品的吸光值，Ac為空白對(duì)照吸光值.

采用Cu2+/H2O2誘導(dǎo)的BSA蛋白氧化損傷實(shí)驗(yàn)［30］測(cè)定LRLP3在蛋白水平上的抗氧化活性.蛋白含量由Quanlity One 4.6.4軟件分析，根據(jù)蛋白的含量判斷樣品抗氧化能力的強(qiáng)弱，即蛋白的含量越高，LRLP3的抗氧化活性越高，反之亦然.

采用H2O2氧化損傷細(xì)胞模型［31］對(duì)LRLP3的體外細(xì)胞抗氧化活性進(jìn)行測(cè)定.Cell relative survival rate( %) = As/Ac×100%，根據(jù)細(xì)胞相對(duì)存活率的高低判斷樣品抗氧化能力的強(qiáng)弱，即細(xì)胞的相對(duì)存活率越高，LRLP3的抗氧化能力越強(qiáng)，反之亦然.

1.2.5 LRLP3的免疫活性小鼠脾細(xì)胞的制備:無(wú)菌環(huán)境下取10周雄性Balb/c小鼠脾臟，用磷酸鹽緩沖液( PBS)清洗3次，加入適量PBS緩沖液于100目細(xì)胞篩上研磨，于1000 r/min轉(zhuǎn)速下離心6min;棄去上層清液，加入紅細(xì)胞裂解液，混合均勻，靜置5 min后加入PBS緩沖液，于1000 r/min轉(zhuǎn)速下離心5 min;棄去上層清液，用PBS緩沖液清洗數(shù)次直至無(wú)紅色物質(zhì)，用含胎牛血清( FBS，體積分?jǐn)?shù)10%)的RPMI-1640培養(yǎng)液調(diào)整細(xì)胞濃度至5×106Cell/mL.

采用Cho等［32］的方法測(cè)定LRLP3單獨(dú)刺激組以及LRLP3與有絲分裂原ConA( 5 μg/mL)或LPS ( 10 μg/mL)共同刺激組對(duì)小鼠脾細(xì)胞增殖的影響.Growth index of mouse spleen=As/Ac.

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用Microsoft Excel 2007軟件處理，結(jié)果用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示;用SPSS 12.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，采用單因素方差分析( ANOVO)及Tukey多重比較進(jìn)行差異顯著性分析，P＜0. 05說(shuō)明組間差異具有顯著性意義.

2　結(jié)果與討論

2.1 LRLP3的分離純化和理化性質(zhì)

各新升格本科院?？筛鶕?jù)本校藝體類(lèi)本科專(zhuān)業(yè)的辦學(xué)規(guī)模，將藝體類(lèi)的專(zhuān)業(yè)英語(yǔ)按專(zhuān)業(yè)大類(lèi)分為美術(shù)類(lèi)、音樂(lè)類(lèi)、體育類(lèi)，或按照藝體類(lèi)各細(xì)化專(zhuān)業(yè)進(jìn)行劃分，共設(shè)置拓展層和提高層兩個(gè)層級(jí)：拓展層專(zhuān)業(yè)英語(yǔ)開(kāi)設(shè)2學(xué)期，提高層專(zhuān)業(yè)英語(yǔ)開(kāi)設(shè)1學(xué)期，每學(xué)期都為2個(gè)學(xué)分。由于英語(yǔ)基礎(chǔ)與能力水平相對(duì)偏低的學(xué)生的語(yǔ)言基礎(chǔ)需繼續(xù)夯實(shí)、語(yǔ)言的基本技能需繼續(xù)提高，因此該層級(jí)的專(zhuān)業(yè)英語(yǔ)不單獨(dú)開(kāi)設(shè)，而是在通用英語(yǔ)教學(xué)中適當(dāng)融入相關(guān)專(zhuān)業(yè)知識(shí)的內(nèi)容。同樣，同一層級(jí)如有多個(gè)教學(xué)班，實(shí)行走班制。

將500 g黑果枸杞葉片粉末用80℃熱水提取2次，合并提取液減壓濃縮，經(jīng)乙醇沉淀、Savage試劑除游離蛋白、對(duì)水透析及冷凍干燥后得2. 7 g粗多糖.粗多糖經(jīng)DEAE-52纖維素柱層析，分別以蒸餾水和0. 05，0. 10，0. 25，0. 50 mol/L NaHCO3溶液進(jìn)行梯度洗脫，分離得到5個(gè)多糖組分.其中得率較多的第3個(gè)組分(用0. 10 mol/L NaHCO3洗脫)經(jīng)Sephdex G100凝膠過(guò)濾柱分離，用0. 1 mol/L NaCl溶液洗脫，進(jìn)一步純化得到200 mg多糖組分LRLP3.

高效凝膠滲透色譜測(cè)定結(jié)果表明，LRLP3在HPLC譜圖上顯示單一對(duì)稱(chēng)峰(見(jiàn)本文支持信息圖S1)，說(shuō)明其為均一性多糖，可進(jìn)行下一步結(jié)構(gòu)和活性測(cè)定.根據(jù)保留時(shí)間計(jì)算其相對(duì)分子量為79400.硫酸苯酚法測(cè)得其總糖含量為98. 2%，Bradford法測(cè)得其蛋白質(zhì)含量為1. 3%.紫外光譜掃描結(jié)果表明，LRLP3在波長(zhǎng)200 nm處有很強(qiáng)的吸收峰，而在波長(zhǎng)280 nm處幾乎無(wú)吸收，說(shuō)明該多糖幾乎不含蛋白質(zhì)，這與糖含量及蛋白含量測(cè)定結(jié)果一致.

紅外光譜分析結(jié)果表明，LRLP3具有多糖典型的特征吸收峰，3419 cm－1處為多糖游離氫鍵上O—H的伸縮振動(dòng)，2950 cm－1處為C—H鍵的伸縮振動(dòng)峰.單糖組成分析結(jié)果顯示，LRLP3主要由阿拉伯糖( Ara)和半乳糖( Gal)組成，另外含有少量的鼠李糖( Rha)和葡萄糖( Glc)，其相對(duì)摩爾比為2∶1∶0. 12∶0. 06.

2.2 LRLP3的結(jié)構(gòu)解析

2.2.1 LRLP3的甲基化分析為了解析LRLP3的化學(xué)結(jié)構(gòu)，判定各單糖殘基之間的連接方式，先將LRLP3完全甲基化，之后再經(jīng)完全酸水解、還原和乙酰化處理后進(jìn)行GC和GC-MS分析.LRLP3在GC總離子流圖中共出現(xiàn)11個(gè)峰，分別代表了11種糖殘基，根據(jù)其在GC上的出峰時(shí)間和對(duì)應(yīng)的質(zhì)譜離子碎片峰，與標(biāo)準(zhǔn)譜圖進(jìn)行對(duì)照，確定了糖殘基的類(lèi)型.再根據(jù)部分甲基化糖醇乙酸酯在GC上的峰面積與相應(yīng)的響應(yīng)因子［33］，計(jì)算得到各甲基化糖基的相對(duì)摩爾比，結(jié)果如表1所示.

Table 1　Partially O-methylated alditol acetates of LRLP3 and LRLP3-I

由表1可知，LRLP3具有多分支的結(jié)構(gòu)特征，分支糖由大量的半乳糖以-3，6) Galp( 1-連接方式以及少量的鼠李糖以-2，4) Rhap( 1-連接方式組成.阿拉伯糖以Araf( 1-，-3) Araf( 1-，-3) Arap( 1-和-5) Araf( 1-這4種連接方式存在，所占比例為所有糖基的62. 9%;半乳糖以Galp( 1-，-4) Galp( 1-，-3) Galp( 1，-6) Galp( 1-和-3，6) Galp( 1-這5種連接方式存在，所占比例為31. 5%;鼠李糖以-2，4) Rhap( 1-分支方式存在，所占比例為3. 7%;葡萄糖則以末端糖Glcp( 1-形式存在，所占比例為1. 9%.在甲基化分析中，各種糖基所占比例和單糖組成分析相符，說(shuō)明在甲基化過(guò)程中糖鏈未受到破損.

2.2.2 LRLP3的部分酸水解和LRLP3-I的甲基化分析由于LRLP3的甲基化分析結(jié)果無(wú)法確定該多糖的主鏈和支鏈糖基，因此進(jìn)一步采用H2SO4( 0. 02 mol/L)對(duì)其進(jìn)行部分酸水解.樣品經(jīng)過(guò)部分酸水解后對(duì)蒸餾水透析，得到透析袋內(nèi)大分子( LRLP3-I)和透析袋外小分子( LRLP3-O)兩部分.分別進(jìn)行單糖組成分析，結(jié)果表明，LRLP3-I僅由半乳糖組成，說(shuō)明該多糖的主鏈由半乳糖構(gòu)成;而LRLP3-O則由阿拉伯糖和少量的鼠李糖和葡萄糖組成，相對(duì)摩爾比為1∶0. 06∶0. 03，說(shuō)明該多糖的支鏈主要由阿拉伯糖構(gòu)成.

對(duì)比LRLP3與LRLP3-I的甲基化結(jié)果(表1)發(fā)現(xiàn)，部分酸水解后，阿拉伯糖基、鼠李糖殘基和葡萄糖殘基完全消失，說(shuō)明其都位于多糖的支鏈，這與單糖組成分析結(jié)果一致.各半乳糖殘基的數(shù)量也發(fā)生了變化，-4) Galp( 1-消失，-3，6) Galp( 1-減少，-6) Galp( 1-和Galp( 1-增加.一方面，-4) Galp( 1-減少數(shù)與Galp( 1-增加數(shù)相等，說(shuō)明-4) Galp( 1-靠近主鏈，并且與靠近末端的阿拉伯糖殘基相連，當(dāng)阿拉伯糖被酸水解掉以后，-4) Galp( 1-成為新的末端Galp( 1-;另一方面，-3，6) Galp( 1-減少的數(shù)量與-6) Galp( 1-增加的數(shù)量相等，推測(cè)其原因?yàn)樵谒岬淖饔孟拢?3，6) Galp( 1-在O3位發(fā)生水解，致使-3，6) Galp( 1-變成-6) Galp( 1-.

2.2.3 LRLP3-O的ESI-MS分析為了進(jìn)一步研究該多糖的支鏈結(jié)構(gòu)，對(duì)LRLP3-O進(jìn)行ESI-MS一級(jí)質(zhì)譜分析，結(jié)果如圖1所示(二級(jí)質(zhì)譜見(jiàn)本文支持信息圖S2).可見(jiàn)，LRLP3的支鏈含有大量不同聚合度的阿拉伯糖，以及1個(gè)鼠李糖和不同聚合度的阿拉伯糖.

2.2.4 LRLP3的NMR譜圖分析采用NMR對(duì)LRLP3的糖苷鍵構(gòu)型進(jìn)行分析.根據(jù)文獻(xiàn)［34～36］的報(bào)道和上述分析結(jié)果，對(duì)NMR譜圖中的化學(xué)位移進(jìn)行了歸屬.

Fig.1　ESI-MS analysis of LRLP3-O

在LRLP3的1H NMR氫譜［見(jiàn)本文支持信息圖S3( A)］中，有3種異頭碳的氫位移，δ為5. 26， 5. 10和4. 53，分別由T-α-Araf，β-Araf和β-Glcp產(chǎn)生;δ 1. 26由α-Rhap的H6產(chǎn)生.在LRLP3的13C NMR譜［見(jiàn)本文支持信息圖S3( B)］中，δ為110. 2，106. 83，105. 4，104. 4，103. 6和96. 8分別歸屬為T(mén)-α-Araf，β-Glcp，1，3-α-Arap，1，3-β-Araf，1，5-β-Araf和T-β-Glcp;δ 19. 2為α-Rhap C6的特征化學(xué)位移.

綜合單糖組成、部分酸水解、甲基化、質(zhì)譜分析和核磁共振分析的結(jié)果，推測(cè)LRLP3是一種具有多分支結(jié)構(gòu)的阿拉伯半乳聚糖，可能具有如圖2所示的重復(fù)單元結(jié)構(gòu).

將黑果枸杞葉多糖( LRLP3)與黑果枸杞果實(shí)多糖［37］( LRGP3)的理化性質(zhì)和結(jié)構(gòu)進(jìn)行比較發(fā)現(xiàn)，兩者存在異同.在理化性質(zhì)方面，LRLP3和LRGP3的相對(duì)分子量、糖含量和蛋白含量均相差不大，但二者的單糖組成存在較大差異，LRLP3中含有Glc，而LRGP3沒(méi)有，而且各種糖的相對(duì)摩爾比也不同.在結(jié)構(gòu)方面，兩者都是主鏈結(jié)構(gòu)為1→3-linked β-Galp的半乳阿拉伯聚糖，但其支鏈組成和聚合度存在較大差異: LRLP3含有1，3-linked α-Araf和1，3-linked α-Arap，而LRGP3含有1，2-linked α-Araf，且末端組成也不同( LRLP3含有β-Glcp末端，而LRGP3沒(méi)有).

Fig.2　Hypothetical structure of the repeat unit of LRLP3

2.3 LRLP3的體外抗氧化活性

2.3.1 LRLP3的還原能力及清除自由基能力通常，樣品的還原能力與抗氧化活性之間存在顯著的正相關(guān)性，還原能力的高低可以反映抗氧化能力的強(qiáng)弱.為了研究LRLP3的抗氧化性，首先測(cè)定了其還原能力，結(jié)果如圖3( A)所示，不同濃度的LRLP3都具有一定的還原能力.在0. 5～1. 0 mg/mL濃度范圍內(nèi)，LRLP3的還原能力無(wú)明顯變化;當(dāng)濃度＞1. 0 mg/mL時(shí)，吸光值隨著濃度的增加而升高，即還原能力隨著濃度的增大而顯著增加，說(shuō)明LRLP3具有抗氧化潛力.

Fig.3　Antioxidant effect in vitro of LRLP3( A) Reducing power of LRLP3; ( B) scavenging effect on DPPH radical by LRLP3; ( C) scavenging effect on hydroxyl radical by LRLP3; ( D) scavenging effect on superoxide radical by LRLP3.The results were from three independent experiments and expressed as means±S.D.

DPPH自由基清除實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖3( B)所示，不同濃度的LRLP3對(duì)DPPH自由基均有顯著的清除作用.在實(shí)驗(yàn)濃度范圍內(nèi)，LRLP3對(duì)DPPH自由基的清除率隨著濃度的增大而提高，清除率依次為38. 2%，58. 9%，62. 2%，70. 3%和75. 6%，其IC50值為0. 95 mg/mL.與維生素C( Vc，IC50=0. 041 mg/ mL)相比，其對(duì)DPPH的清除能力雖然有一定差距，但也有顯著的清除作用.

采用Fenton系統(tǒng)考察了LRLP3對(duì)羥自由基的清除能力，結(jié)果如圖3( C)所示.不同濃度的LRLP3對(duì)羥自由基表現(xiàn)出一定的清除作用，并且清除能力隨著濃度的增大而提高.當(dāng)濃度為3 mg/mL時(shí)，清除率達(dá)到了80%，其IC50=0. 671 mg/mL，高于Vc( IC50=1. 54 mg/mL)的清除羥自由基能力.

采用PMS-NADH-NBT系統(tǒng)測(cè)定了LRLP3對(duì)超氧陰離子的清除能力，結(jié)果如圖3( D)所示.不同濃度的LRLP3均對(duì)超氧陰離子具有良好的清除能力.在0. 05～0. 1 mg/mL范圍內(nèi)，其清除能力無(wú)明顯變化;當(dāng)濃度為0. 5，1和2 mg/mL時(shí)，其清除率分別為45. 87%，62. 36%和92. 13%.當(dāng)Vc濃度為2 mg/mL時(shí)，對(duì)超氧陰離子的清除率為68. 19%，因此，LRLP3對(duì)超氧陰離子的清除能力大于Vc.

2.3.2 LRLP3在蛋白和細(xì)胞水平上的抗氧化活性在生物體內(nèi)，Cu2+和H2O2同時(shí)存在會(huì)產(chǎn)生羥自由基，當(dāng)羥自由基水平過(guò)高時(shí)會(huì)對(duì)大分子物質(zhì)如蛋白質(zhì)造成損傷.因此，用Cu2+/H2O2體系考察了LRLP3在蛋白水平上的抗氧化作用，結(jié)果如圖4( A)所示.可見(jiàn)，不同濃度的LRLP3對(duì)Cu2+/H2O2誘導(dǎo)的BSA蛋白氧化損傷均具有顯著的保護(hù)作用.當(dāng)LRLP3濃度達(dá)到3 mg/mL時(shí)，與對(duì)照組(未加LRLP3)相比，蛋白損傷率由82. 7%下降至30. 8%，說(shuō)明LRLP3是一種很好的抗氧化劑.

Fig.4　Protective effect of LRLP3 on Cu2+/H2O2-induced BSA protein damage( A) and H2O2-induced HeLa cells damage( B)The results were obtained from three independent experiments and expressed as means±S.D.＊＊P＜0. 01 compared with control group;＊＊＊P＜0. 001 compared with control group;“-”means“BSA protein or HeLa cells were not treated with H2O2or Cu2+/H2O2or LRLP3”; “+”means“BSA protein or HeLa cells were treated with H2O2or Cu2+/H2O2or LRLP3”.

圖4( B)結(jié)果表明，LRLP3對(duì)H2O2誘導(dǎo)的氧化損傷細(xì)胞模型具有一定的保護(hù)作用，受H2O2損傷的細(xì)胞的存活率明顯低于未損傷細(xì)胞.當(dāng)LRLP3濃度＜12. 5 μg/mL時(shí)，對(duì)氧化損傷細(xì)胞無(wú)保護(hù)作用;但當(dāng)其濃度達(dá)到25 μg/mL時(shí)，對(duì)氧化損傷細(xì)胞具有保護(hù)作用，細(xì)胞相對(duì)存活率提高了7%;當(dāng)濃度為200 μg/mL時(shí)，細(xì)胞相對(duì)存活率達(dá)到101. 4%，與未損傷細(xì)胞存活率無(wú)差異.

2.4 LRLP3的免疫活性

脾臟是T淋巴細(xì)胞和B淋巴細(xì)胞定居及接受抗原刺激后產(chǎn)生免疫應(yīng)答的重要場(chǎng)所，分化激活后的淋巴細(xì)胞能夠產(chǎn)生多重細(xì)胞因子，與機(jī)體的細(xì)胞免疫和體液免疫密切相關(guān)［38］.本文采用MTT法檢測(cè)LRLP3在體外對(duì)正常小鼠脾細(xì)胞增殖能力的影響以判斷LRLP3是否具有免疫活性，結(jié)果見(jiàn)圖5.

對(duì)于LRLP3單獨(dú)刺激組［圖5( A)］，當(dāng)樣品濃度＜25 μg/mL時(shí)，與RPMI-1640對(duì)照組(脾細(xì)胞增殖指數(shù)設(shè)為1)相比，增殖指數(shù)為1. 002，表明在該濃度下LRLP3對(duì)小鼠脾細(xì)胞增殖無(wú)影響;而濃度為50 μg/mL時(shí)，脾細(xì)胞增殖指數(shù)增加;當(dāng)濃度達(dá)到800 μg/mL時(shí)，增殖指數(shù)為1. 45.這表明當(dāng)LRLP3濃度在50～800 μg/mL范圍內(nèi)，能夠刺激小鼠脾細(xì)胞的增殖.

Fig.5　In vitro effects of LRLP3 on splenocyte proliferation index( A)，ConA-induced splenocyte proliferation( B) and LPS-induced splenocyte proliferation( C)The results were from three independent experiments and expressed as means±S.D.＊＊P＜0. 01 compared with control group;“－”means “splenocytes were not treated with LPS or ConA or LRLP3”;“+”means“splenocytes were treated with LPS or ConA or LRLP3”.

對(duì)于ConA誘導(dǎo)的T淋巴細(xì)胞刺激組［圖5( B)］，在ConA和不同濃度( 0～800 μg/mL) LRLP3共同作用下，脾細(xì)胞增殖指數(shù)隨著LRLP3濃度的增加而增長(zhǎng)，表明在T細(xì)胞有絲分裂原ConA存在下，LR-LP3對(duì)小鼠脾細(xì)胞增殖具有促進(jìn)作用.

對(duì)于LPS誘導(dǎo)的B淋巴細(xì)胞刺激組［圖5( C)］，脾細(xì)胞增殖指數(shù)全部增長(zhǎng)，并呈現(xiàn)濃度依賴(lài)性.當(dāng)LRLP3濃度達(dá)到800 μg/mL時(shí)，增殖指數(shù)為對(duì)照組的2. 48倍，表明在B細(xì)胞有絲分裂原LPS存在下，LRLP3對(duì)小鼠脾細(xì)胞增殖同樣具有促進(jìn)作用.

此外，對(duì)于同一濃度的3種不同刺激下的腺細(xì)胞增殖能力而言，LPS誘導(dǎo)的B淋巴細(xì)胞刺激組的增殖能力＞ConA誘導(dǎo)的T淋巴細(xì)胞刺激組＞多糖單獨(dú)刺激組.脾細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，LRLP3是一種潛在的免疫活性成分，對(duì)小鼠的細(xì)胞免疫功能具有促進(jìn)作用.

3　結(jié)　論

從黑果枸杞葉中分離純化出水溶性多糖LRLP3，研究了其理化性質(zhì)、化學(xué)結(jié)構(gòu)、體外抗氧化活性和免疫活性.結(jié)果表明，LRLP3與LRGP3(黑果枸杞果實(shí)多糖)同樣是一種具有免疫增強(qiáng)活性的阿拉伯半乳聚糖;同時(shí)，LRLP3具有良好的還原能力，具有清除1，1-二苯基-2-三硝基苯肼( DPPH)自由基、羥自由基和超氧陰離子自由基的能力，還可以有效抑制Cu2+/H2O2誘導(dǎo)的蛋白氧化損傷和H2O2誘導(dǎo)的細(xì)胞氧化損傷.因此，LRLP3可以作為天然抗氧化劑和免疫增強(qiáng)劑應(yīng)用于食品和醫(yī)藥領(lǐng)域.

支持信息見(jiàn)http: / /www.cjcu.jlu.edu.cn/CN/10.7503/cjcu20150690.

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Structural Characterization，Antioxidant Activity and Immunomodulatory Activity of the Polysaccharide LRLP3 from Leaves of Lycium ruthenicum Murra?

LIU Yang，YIN Lu，GONG Guiping，PENG Yifang，HUANG Linjuan，WANG Zhongfu*
( Key laboratory for Western China Resource Biology and Biotechnology，Ministry of Education，College of Life Science，Northwest University，Xi’an 710069，China)

?Supported by the National Natural Science Foundation of China( Nos.21375103，31370804) and the Scientific Research Program Fund for Shaanxi Province Key Laboratory，China( No.14JS01).

Abstract A combination of chemical and instrumental analysis was performed to investigate the structural characterization and biological activity of a polysaccharide LRLP3 which was isolated from the Lycium ruthenicum leaves.The results demonstrated that LRLP3 was a highly branched polysaccharide with a backbone of ( 1→3) -linked-βGalp substituted at C-6 position by galactosyl.The branches were composed of( 1→6) -linkedβGalp，( 1→4) -linked-βGalp，( 1→3) -linked-αAraf and βArap，( 1→5) -linked-αAraf，and ( 1→2，4) -linked αRhap，and the terminal residues were αAraf，βGalp and βGlcp.Additional，LRLP3 had strong reducing power，could significantly scavenge DPPH，hydroxyl and superoxide free radical，could effectually inhibit Cu2+/H2O2induced protein damage and H2O2induced cell damage in vitro.Meanwhile，immunological assay showed that LRLP3 could stimulate proliferation of spleen lymphocytes significantly with or without mitogens ( ConA or LPS) in vitro.Therefore，LRLP3 was a natural arabinogalactan which had the potential function of antioxidant and immunoloregulation.

KeywordsLyciumruthenicum Murray leaves; Polysaccharide; Structural analysis; Antioxidant activity; Immunological activity

( Ed.: P，H，F(xiàn)，K)

基金項(xiàng)目:國(guó)家自然科學(xué)基金(批準(zhǔn)號(hào): 21375103，31370804)和陜西省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室科研項(xiàng)目(批準(zhǔn)號(hào): 14JS101)資助.

收稿日期:2015-09-08.網(wǎng)絡(luò)出版日期: 2016-01-04.

doi:10.7503/cjcu20150690

中圖分類(lèi)號(hào)O629.12

文獻(xiàn)標(biāo)志碼A

聯(lián)系人簡(jiǎn)介:王仲孚，男，博士，教授，博士生導(dǎo)師，主要從事糖生物學(xué)與糖工程方面的研究.E-mail: wangzhf@ nwu.edu.cn