HPLC 測定雄黃染毒小鼠血漿及肝臟中活性硫的含量

陳　默，苑　潔，霍韜光，張穎花，吳　輝，姜　泓

(中國醫(yī)科大學公共衛(wèi)生學院，遼寧沈陽110122)

?

HPLC 測定雄黃染毒小鼠血漿及肝臟中活性硫的含量

陳默，苑潔，霍韜光，張穎花，吳輝，姜泓*

(中國醫(yī)科大學公共衛(wèi)生學院，遼寧沈陽110122)

摘要:建立了HPLC測定雄黃染毒小鼠血漿及肝中活性硫含量的方法．結(jié)果表明，該方法準確、靈敏、可靠、檢出限低．研究發(fā)現(xiàn)，雄黃可引起小鼠血漿、肝中活性硫水平降低．

關(guān)鍵詞:高效液相色譜法;雄黃;活性硫

隨著對硫化氫( H2S) /活性硫( active sulfur)研究的逐漸深入，人們發(fā)現(xiàn)內(nèi)源性活性硫在機體內(nèi)的許多生理和病理過程中發(fā)揮著重要的作用．目前，活性硫含量的測定常采用頂空氣相色譜法［1］、敏感硫電極法［2］和亞甲基藍分光光度法［3］，然而這些方法的檢測靈敏度較低，特異性差，測定結(jié)果差異大，不適用于內(nèi)源性/低水平活性硫含量的測定．而高效液相色譜法( HPLC)是一種具有高分離能力、高靈敏度的分析方法，常用于生物樣品中組分的分離與檢測．因此，有必要建立HPLC測定生物樣品中活性硫含量的方法．另一方面，很多著名的中成藥(如安宮牛黃丸、牛黃解毒片、小兒至寶丸等)中含有雄黃( As4S4)，臨床上因不規(guī)范服用含雄黃中成藥而發(fā)生的慢性砷中毒事件時有報道［4－5］，(然而此類砷中毒事件中，雄黃是否會通過影響體內(nèi)H2S/活性硫的水平而產(chǎn)生毒性的相關(guān)研究未見報道)．因此，有必要探討雄黃對血漿、肝臟中活性硫的影響，為進一步闡明雄黃所致藥源性毒性作用物質(zhì)基礎(chǔ)的研究及早期預(yù)防提供理論依據(jù)和實驗數(shù)據(jù)．

1　實驗部分

1．1儀器與試劑

高效液相色譜儀(美國安捷倫公司) ; G1314F紫外檢測器，色譜數(shù)據(jù)工作站; ER-182A全自動電子天平(十萬分之一) (日本A＆D公司) ; 3K-18型超速低溫冷凍離心機( Sigma公司) ;超聲波細胞粉碎機(寧波新芝生物科技股份有限公司) ; pH-3c型酸度計(上海精密科學實業(yè)有限公司) ; XW-80A型旋渦混合器(上海精科實業(yè)有限公司) ; Easypure型純水系統(tǒng)(美國Barnstead公司)．雄黃(產(chǎn)地，甘肅) ; Na2S標準品( Na2S·9H2O) (＞98%，天津光復(fù)精細化工所) ;單溴二胺( MBB，Sigma公司) ;三氟乙酸( TFA，Sigma公司) ;色譜甲醇(天津光復(fù)精細化工所) ;色譜乙腈(山東禹王有限公司) ;其他試劑均為分析純．BCA蛋白定量測定試劑盒(北京鼎國生物技術(shù)有限公司)．

1．2實驗動物分組及染毒

SPF級雄性ICR小鼠40只(中國醫(yī)科大學實驗動物部提供)，體重( 20±2) g．隨機分為4組，每組10只．以0．5%羧甲基纖維素鈉( CMC-Na)水溶液為混懸介質(zhì)，第1組為對照組( 0．5% CMC-Na水溶液)，第2～4組分別灌胃給予雄黃混懸液0．15 g/kg、0．45 g/kg和1．35 g/kg．每日1次，每隔3天稱量體重1次，調(diào)節(jié)灌胃容量，連續(xù)灌胃8周．

1．3樣品采集及處理

于末次給藥24 h后，無水乙醚麻醉，眼眶取血，吸取部分全血4℃下12 000 rpm離心10 min，分離血漿，貯存于－70℃冰箱中待測．斷頭，取肝臟，預(yù)冷0．9%生理鹽水沖洗干凈，貯存于－70℃冰箱中待用．

1．4色譜條件

色譜柱為Thermo ODS柱( 250 mm×4．6 mm，i．d．，5 μm)，流動相為99．9%的乙腈(含0．1% TFA，A 相)，三氟乙酸緩沖液(含0．1% TFA，B相)，梯度洗脫．流速為0．6 mL/min，檢測波長為254 nm，進樣量為20 μL．梯度洗脫程序如下: 0～5 min( 15%～35%) ; 5～16 min( 35%～55%) ; 16～18 min( 55%～80%) ; 18～20 min( 80%～15%)．

1．5方法學考察

1．5．1標準曲線與檢測限

取對照組的平行混合血漿或肝臟勻漿液(混合Y液) 15 μL，加入15 μL活性硫標準對照液，得相當于濃度為0、3、6、15、30、60 μmol/L的活性硫血漿或肝臟樣品，每個濃度分別制備5個平行樣本，按1．6項下處理后，進入高效液相色譜儀進行分析，制備標準曲線．以血漿或肝臟樣品中活性硫濃度為橫坐標，衍生物色譜峰面積為縱坐標，用加權(quán)最小二乘法進行回歸計算，求得直線的回歸方程，即為標準曲線．檢測限為空白的3倍積分面積．

1．5．2精密度與準確度

取混合血漿及混合Y液15 μL，加入15 μL活性硫標準溶液，得濃度為5、20、40 μmol/L的活性硫質(zhì)控( QC)樣品，每個濃度分別制備5個平行樣本，重復(fù)3個分析批，連續(xù)測定3 d，以當日的標準曲線計算QC樣品的測得濃度，與配制的濃度對照，求得方法的準確度與精密度．

1．5．3回收率

取活性硫QC樣品，每一濃度進行5個平行樣本分析．另取混合Y液15 μL，加入15 μL去離子水，得空白樣品，同法測定．方法的回收率=(測得的質(zhì)控樣品濃度—測得的空白樣品濃度) /加入的活性硫標準溶液濃度．

1．6血漿及肝臟中活性硫含量的測定

準確稱取小鼠的肝臟100 mg，加入1 mL去離子水，超聲破碎2 min，混勻，為組織勻漿液．將其分成兩部分，分別用于活性硫和蛋白的測定．準確量取上述組織勻漿液30 μL及血漿30 μL，分別加入70 μL Tris-HCl緩沖溶液( pH=9．5)，再加入50 μL MBB衍生化試劑，室溫避光反應(yīng)30 min，加入100 μL SSB溶液沉淀蛋白，4℃下12 000 rpm離心10 min，取上清液，經(jīng)0．45 μm濾膜過濾，注入HPLC中．

按BCA蛋白定量測定試劑盒說明書中步驟測定各樣品中的蛋白濃度．

1．7統(tǒng)計分析

所得數(shù)據(jù)以平均值±標準差表示，用SPSS 17．0軟件單因素方差分析方法( ANOVA)進行各指標組間差異的顯著性檢驗，以P＜0．05作為檢驗的顯著性差異．

2　結(jié)果與討論

2．1方法學考察

2．1．1方法的專屬性

圖1給出了空白試劑、活性硫標準品、血漿及肝臟經(jīng)MBB衍生化后典型HPLC色譜圖．由圖可見活性硫衍生物與其他內(nèi)源性化合物分離良好，活性硫衍生物的保留時間為13．00 min．

圖1　空白( A)、活性硫標準品( B)、血漿( C)和肝臟( D)的HPLC圖Fig．1 HPLC graph of Blank ( A)，active sulfur standard ( B)，plasma( C) and liver ( D)

2．1．2標準曲線與檢測限

血漿及肝臟樣品中活性硫含量的線性回歸方程見表1，結(jié)果表明活性硫在一定濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，檢出限較低．

表1　活性硫的標準曲線、線性范圍、相關(guān)系數(shù)及檢出限( mean±SD，n=10)Table 1　Standard curves，linear ranges，correlation coefficient ( r) and detection limit of active sulfur contents in plasma and liver of mice ( mean±SD，n= 10)

2．1．3方法的精密度、準確度及回收率

由表2可見，血漿和肝臟中活性硫的日內(nèi)、日間精密度的RSD值分別小于7．1%和6．7%，準確度的RE在－1．5%～－8．6%范圍內(nèi)．該方法中3個濃度的活性硫在血漿及肝臟中的回收率在91．4%～98．5%之間．結(jié)果表明，我們建立的HPLC測定小鼠血漿及肝臟中活性硫的分析方法精密度、準確度及回收率良好，符合有關(guān)的規(guī)范要求．

表2　方法的精密度、準確度和回收率( mean±SD，n= 10)Table 2 Precision，accuracy and recovery of active sulfur contents in plasma and liver of mice ( mean±SD，n= 10)

2．2小鼠血漿及肝臟中活性硫含量

雄黃對小鼠血漿及肝臟中活性硫水平的影響見表3．與對照組相比，雄黃染毒1．35 g/kg組血漿及肝臟中活性硫水平顯著降低( P＜0．05)，色譜圖中活性硫的MBB衍生化物的峰高、峰面積明顯降低，0．15和0．45 g/kg劑量組沒有明顯的變化( P＞0．05)，色譜峰的峰高、峰面積沒有明顯變化．結(jié)果表明雄黃可使血漿及肝臟中活性硫水平明顯降低．

表3　小鼠血漿及肝臟中活性硫水平的測定結(jié)果( mean±SD，n= 10)Table 3 Active sulfur contents in plasma and liver of mice ( mean±SD，n= 10)

2．3實驗條件的優(yōu)化

活性硫很難直接被檢測，通常需要進行衍生化．MBB是一種熒光衍生化試劑，可以與HS－在堿性條件下進行衍生化反應(yīng)，生成硫化乙硼烷( sulfide-dibimane，SDB)，SDB是疏水性分子，化學性質(zhì)穩(wěn)定，在波長381 nm處具有較強的紫外吸收．試驗分別選擇254與381 nm作為檢測波長，結(jié)果顯示，在254 nm時的峰面積更大，檢測靈敏度更高，且檢出限更小，故選用254 nm作為實驗的檢測波長．因此，我們建立了MBB衍生化-HPLC-紫外檢測法，檢測靈敏度高于SHEN等［6］所建立的MBB衍生化-HPLC-熒光檢測法，并擴大了活性硫的HPLC檢測方法的應(yīng)用范圍．此外，與SHEN等［6］相比，保留時間提前約8 min，大大縮短了分析時間，節(jié)約分析成本．SHEN等［6］未對方法學進行系統(tǒng)確證和將方法用于應(yīng)用研究．因此，本研究對方法學進行了系統(tǒng)的研究，結(jié)果表明本方法的專屬性、靈敏度、精密度、準確度、回收率和穩(wěn)定性均良好，為方法的實際應(yīng)用提供了實驗依據(jù)．

對血漿、肝臟樣品中活性硫衍生物的穩(wěn)定性進行了考察，結(jié)果表明在室溫放置8 h，經(jīng)3次凍融循環(huán)，－70℃冷凍7 d后穩(wěn)定性良好．

此外，由于硫易被氧化，實驗前所有試劑和容器都經(jīng)過除氧處理．活性硫可以與玻璃結(jié)合，所以實驗中我們使用聚乙烯塑料管作為反應(yīng)器皿．

2．4活性硫、氧化應(yīng)激與雄黃

隨著對H2S/活性硫研究的逐漸深入，人們意識到，內(nèi)源性H2S在機體內(nèi)的許多生理和病理過程中發(fā)揮著重要的作用．內(nèi)源性H2S為小分子物質(zhì)，其在體內(nèi)分別以1/3的H2S氣體分子形式和2/3的硫氫化鈉( NaHS，即活性硫)形式存在，兩者之間形成一種動態(tài)平衡．因此建立準確、高通量的分析方法測定生物樣品中H2S/活性硫水平成為研究的重點．

雄黃是國務(wù)院在《醫(yī)療用藥毒性藥品管理辦法》中特別規(guī)定的28種毒性中藥之一．雄黃中的砷可被機體吸收進入血及肝臟中［7－8］．目前，氧化應(yīng)激和氧化損傷學說在慢性砷中毒發(fā)病機制的研究中已經(jīng)得到普遍認可．砷易與含有巰基的分子(如還原型谷胱甘肽和半胱氨酸)結(jié)合［9］，并抑制機體一些重要的生化反應(yīng)，從而產(chǎn)生毒性作用;而巰基能否發(fā)揮作用的關(guān)鍵就在于它所處的氧化或還原狀態(tài)，即處于還原巰基(－SH)或二硫鍵(－S－S－)狀態(tài)，活性硫發(fā)揮作用則與組織處于還原巰基狀態(tài)有極大關(guān)聯(lián);活性硫?qū)Χ喾N氧化性物質(zhì)(如O2－、次氯酸、H2O2等)都有抑制及清除作用，從而減輕氧化應(yīng)激，具有抗氧化作用［10－12］;我們的實驗結(jié)果表明，雄黃可引起血及肝臟中活性硫水平降低，但具體機制有待于進一步研究．

3　結(jié)論

建立了血漿和肝臟中活性硫的HPLC檢測方法，該方法的專屬性好，準確度和靈敏度高．利用該方法進行研究表明雄黃可引起小鼠血漿及肝臟中活性硫水平降低．

參考文獻:

［1］李英華，呂秀陽，呂麗麗，等．頂空氣相色譜法在藥物分析中的應(yīng)用［J ］．藥物分析雜志，2005，20( 11) : 1404－1405．

［2］李曉惠，杜軍保，唐朝樞．內(nèi)源性H2S對大鼠高肺血流性肺動脈高壓的調(diào)節(jié)作用［J ］．臨床兒科雜志，2006，24( 8) : 674－678．

［3］劉銀花，楊漢文，王小同，等．H2S對慢性低氧高二氧化碳模型大鼠學習記憶的影響［J］．中國臨床神經(jīng)科學，2011，19( 2) : 141－145．

［4］馬斌，李彤，姜泓．我國雄黃及其復(fù)方的毒副作用研究進展［J ］．中華中醫(yī)藥學刊，2013，31( 8) : 1623－1625．

［5］梁愛華，李春英，王金華，等．雄黃的毒性研究［J］．中國中藥雜志，2011，36( 14) : 1889－1894．

［6］SHEN X，PATTILLO C B，PARDUE S，et al．Measurement of plasma hydrogen sulfide in vivo and in vitro．Free Radic Biol Med，2011，50( 9) : 1021－31．

［7］苑潔，霍韜光，王艷蕾，等．HG-FAAS法測定雄黃染毒小鼠肝及腎臟中的砷含量［J ］．化學研究，2014，25 ( 1) : 82－85．

［8］張穎花，高詠，霍韜光，等．利用氫化物發(fā)生-冷阱捕集-原子吸收光譜聯(lián)用技術(shù)測定雄黃染毒大鼠血中砷的含量［J］．化學研究，2013，24( 3) : 274－276．

［9］姜泓，丁敬華，高雙，等．As(Ⅲ)和As(Ⅴ)與牛血清白蛋白的結(jié)合平衡研究［J ］．化學研究，2008，19 ( 2) : 91－93．

［10］孫燕，金紅芳，魏紅玲，等．巰基修飾劑對硫化氫的離體心臟灌流效應(yīng)的影響［J ］．中國藥理學通報，2009，25( 4) : 469－473．

［11 ］KIMURA Y，KIMURA H．Hydrogen sulfide protects neurons from oxidative stress ［J］．FASEB J，2004，18: 1165－1167．

［12 ］KIMURA Y，DARGUSCH R，SCHUBURT D，et al．Hydrogen sulfide protects HT22 neuronal cells from oxidative stress［J ］．Antioxid Redox Signal，2006，8: 661－670．

［責任編輯:吳文鵬］

Determination of active sulfur in plasma and liver of mice exposed to realgar by HPLC

CHEN Mo，YUAN Jie，HOU Taoguang，ZHANG Yinghua，WU Hui，JIANG Hong*

( School of Public Health，China Medical University，Shenyang 110122，Liaoning，China)

Abstract:A method of HPLC was established to detect the contents of active sulfur in plasma and liver of mice．The method is accurate，sensitive，reliable and low detection limit．It is found that realgar can reduce active sulfur levels in plasma and liver of mice．

Keywords:high performance liquid chromatography; realgar; active sulfur

作者簡介:陳默( 1991－)，女，碩士生，研究方向為中藥毒/藥效物質(zhì)基礎(chǔ)研究．*通訊聯(lián)系人，E-mail: jianghong@ mail．cmu．edu．cn．

基金項目:國家自然科學基金( 81473417，81403066)．

收稿日期:2015－10－09．

中圖分類號:O657．7

文獻標志碼:A

文章編號:1008－1011( 2016) 01－0081－04