多指標(biāo)正交試驗(yàn)法優(yōu)選小續(xù)命湯水提工藝＊

王仁杰，周恩麗，李 淼，秦建平，吳 云，孫永成，杜冠華，蕭 偉＊＊

（1. 江蘇康緣藥業(yè)股份有限公司 連云港 222001；2. 中藥制藥過(guò)程新技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室連云港 222001；3. 中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥物研究所 北京 100050）

多指標(biāo)正交試驗(yàn)法優(yōu)選小續(xù)命湯水提工藝＊

王仁杰1,2，周恩麗1,2，李 淼1,2，秦建平1,2，吳 云1,2，孫永成1,2，杜冠華3，蕭 偉1,2＊＊

（1. 江蘇康緣藥業(yè)股份有限公司 連云港 222001；2. 中藥制藥過(guò)程新技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室連云港 222001；3. 中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥物研究所 北京 100050）

目的：優(yōu)選小續(xù)命湯的水提工藝。方法：以升麻素苷、5-O-甲基維斯阿米醇苷、苦杏仁苷的提取率以及水提物的浸膏得率為綜合評(píng)價(jià)指標(biāo)，選取加水量、提取時(shí)間、提取次數(shù)為考察因素，采用正交試驗(yàn)法優(yōu)選小續(xù)命湯的水提工藝。結(jié)果：最佳回流提取工藝為10倍量水，回流提取3次，每次1.5 h。結(jié)論：該優(yōu)選工藝客觀可行、合理穩(wěn)定，可為小續(xù)命湯的產(chǎn)業(yè)化研究提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

多指標(biāo)成分 升麻素苷 5-O-甲基維斯阿米醇苷 苦杏仁苷 綜合評(píng)價(jià) 小續(xù)命湯 熵權(quán)法

“小續(xù)命湯”始載于《備急千金要方》（唐·孫思邈），該方具有“溫經(jīng)通陽(yáng)，扶正驅(qū)風(fēng)”的功能，主治“正氣虛弱，風(fēng)寒初中經(jīng)絡(luò)所致半身不遂，口眼歪斜，語(yǔ)音失利，筋脈拘急，頭痛頸強(qiáng)等”，主要用于治療中風(fēng)及中風(fēng)后遺癥，具有顯著的臨床療效，且應(yīng)用廣泛。本公司在該古方的現(xiàn)代研究[1-7]基礎(chǔ)之上開(kāi)發(fā)了一款新型口服制劑產(chǎn)品，用于腦中風(fēng)恢復(fù)期治療。該方由麻黃、桂枝、防風(fēng)、苦杏仁、人參、白芍、防己等12味中藥組成，處方中麻黃、桂枝、防風(fēng)、苦杏仁所含有效成分主要是升麻素苷、5-O-甲基維斯阿米醇苷、苦杏仁苷以及麻黃堿等成分，易溶于水[8-10]。通過(guò)前期藥效篩選試驗(yàn)，確定了這4味藥的水提工藝。為了最大限度地提取出以上有效成分，充分發(fā)揮其功效，本試驗(yàn)考慮采用水煎煮回流提取小續(xù)命湯的水溶性成分，選取升麻素苷、5-O-甲基維斯阿米醇苷和苦杏仁苷的提取率以及浸膏得率為綜合評(píng)分指標(biāo)，采用正交試驗(yàn)法多指標(biāo)優(yōu)選小續(xù)命湯的水提工藝。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

U3000型液相色譜儀（美國(guó)戴安公司）；RE-300型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（上海亞榮）；JK-250DB型數(shù)控超聲波清洗器（合肥金尼克機(jī)械制造有限公司）；DZTW型調(diào)溫電熱套（北京市永光明醫(yī)療儀器廠）；Sartorius BP 211D電子分析天平（德國(guó)Sartorius公司）；超純水機(jī)（美國(guó)Millipore公司）。

1.2 試藥

麻黃（產(chǎn)地吉林通榆）、苦杏仁（產(chǎn)地甘肅靈臺(tái)）、桂枝（產(chǎn)地廣西平南）、防風(fēng)（產(chǎn)地黑龍江杜爾百特）分別經(jīng)連云港康緣大藥房執(zhí)業(yè)藥師吳舟鑒定為麻黃科植物草麻黃Ephedra sinica Stapf.的干燥草質(zhì)莖、薔薇科植物杏Prunus armeniaca L.的干燥成熟種子、樟科植物肉桂Cinnamomum cassia Presl.的干燥嫩枝、傘形科植物防風(fēng)Saposhnikovia divaricata（Turcz.） Schischk.的干燥根；升麻素苷、5-O-甲基維斯阿米醇苷對(duì)照品（中國(guó)食品藥品檢定研究院，批號(hào)：111522-201008、111523-201007）；苦杏仁苷對(duì)照品（中國(guó)藥品生物制品檢定所，批號(hào)：110820-201004）；甲醇、乙腈為色譜純，其他試劑均為分析純，水為超純水。

2 方法與結(jié)果

2.1 指標(biāo)成分測(cè)定

2.1.1 升麻素苷和5-O-甲基維斯阿米醇苷的測(cè)定方法

色譜條件：Phenomenex C18鍵合硅膠柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；柱溫：30 ℃；檢測(cè)波長(zhǎng)254 nm；進(jìn)樣量：10 μL；流動(dòng)相為乙腈（A）-水（B），0-20 min，A：13%→30%；流速：1.0 mL·min-1。

對(duì)照品溶液的制備：分別精密稱取升麻素苷和5-O-甲基維斯阿米醇苷對(duì)照品適量，用50%甲醇溶解制成質(zhì)量濃度分別為47.05 μg·mL-1、52.05 μg·mL-1的對(duì)照品混合溶液，0.22 μm微孔濾膜濾過(guò)，冷藏備用。

供試品溶液的制備：精密量取待測(cè)提取液10 mL至中性氧化鋁柱，用50%乙醇洗脫，收集洗脫液，水浴揮干，殘?jiān)?0%甲醇溶解，轉(zhuǎn)移至10 mL容量瓶中，加入50%甲醇溶液稀釋至刻度搖勻，0.22 μm微孔濾膜（有機(jī)膜）濾過(guò)，取續(xù)濾液作為供試品溶液。

線性范圍的考察：精密量取升麻素苷和5-O-甲基維斯阿米醇苷對(duì)照品混合溶液2、4、8、12、16、20 mL，按擬定色譜條件進(jìn)樣檢測(cè)，記錄色譜峰面積。以峰面積（Y）為縱坐標(biāo)，以對(duì)照品進(jìn)樣量（X）為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得線性回歸方程。升麻素苷：Y=1 254.245 2 X-3.542 9（R2=0.999 9），5-O-甲基維斯阿米醇苷：Y= 1 815.057 9 X-14.172 5（R2=0.999 9），表明升麻素苷在0.094 1-0.941 0 mg范圍內(nèi)與峰面積呈良好線性關(guān)系，5-O-甲基維斯阿米醇苷在0.104 1-1.041 mg范圍內(nèi)與峰面積呈良好線性關(guān)系。

2.1.2 苦杏仁苷的測(cè)定方法

色譜條件：Phenomenex C18鍵合硅膠柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；柱溫：30 ℃；檢測(cè)波長(zhǎng)210 nm；進(jìn)樣量：10 μL；流動(dòng)相：甲醇-1%磷酸水溶液（21:79）；流速1.0 mL·min-1。

對(duì)照品溶液的制備：精密稱取芍藥苷對(duì)照品適量，用50%甲醇溶解制成質(zhì)量濃度為160.60 μg·mL-1的對(duì)照品溶液，0.22 μm微孔濾膜濾過(guò)，冷藏備用。

供試品溶液的制備：精密量取待測(cè)提取液10 mL至中性氧化鋁柱，用50%乙醇洗脫，收集洗脫液，水浴揮干，殘?jiān)?0%甲醇溶解，轉(zhuǎn)移至10 mL容量瓶中，加入50%甲醇溶液稀釋至刻度搖勻，0.22 μm微孔濾膜（有機(jī)膜）濾過(guò)，取續(xù)濾液作為供試品溶液。

線性范圍的考察：精密吸取芍藥苷對(duì)照品溶液1，3，5，10，15，20 mL，按擬定色譜條件進(jìn)樣檢測(cè)，記錄色譜峰面積。以峰面積為縱坐標(biāo)，以對(duì)照品進(jìn)樣量（mg）為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得線性回歸方程：Y= 980.39 X + 1.50（R2=0.999 8），表明苦杏仁苷在0.160 6-3.212 mg范圍內(nèi)與峰面積呈良好線性關(guān)系。

2.1.3 方法學(xué)考察

（1）精密度考察

精密量取升麻素苷和5-O-甲基維斯阿米醇苷混合對(duì)照品溶液、苦杏仁苷對(duì)照品溶液，分別按照各自色譜條件連續(xù)進(jìn)樣6次，每次進(jìn)樣10 μL，測(cè)定峰面積，結(jié)果升麻素苷、5-O-甲基維斯阿米醇苷、苦杏仁苷的RSD分別為0.35%、0.65%、0.96%，表明儀器精密度較高。

（2）穩(wěn)定性試驗(yàn)

取同一供試品溶液，分別于制備后0、2、4、6、8、12、24 h注入液相色譜儀，記錄各自的峰面積值。結(jié)果升麻素苷、5-O-甲基維斯阿米醇苷、苦杏仁苷的RSD分別為1.4%、1.6%、1.4%，表明在24 h內(nèi)供試品溶液穩(wěn)定性良好。

（3）重復(fù)性試驗(yàn)

精密量取待測(cè)提取液10 mL，平行量取6份，按擬定供試品溶液制備方法制備供試品溶液12份，每份精密吸取10 μL，分別按擬定的色譜條件進(jìn)行測(cè)定。結(jié)果升麻素苷、5-O-甲基維斯阿米醇苷、苦杏仁苷的RSD分別為0.72%、0.45%、0.56%，表明方法重復(fù)性良好。

（4）加樣回收試驗(yàn)

精密量取已知含量的提取液6份，每份5 mL，分別精密加入升麻素苷和5-O-甲基維斯阿米醇苷混合對(duì)照品溶液、苦杏仁苷對(duì)照品溶液1.0 mL，按2.1.1和2.1.2項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按各自項(xiàng)下擬定色譜條件進(jìn)行測(cè)定，計(jì)算升麻素苷的平均回收率99.24%，RSD 0.68%, 5-O-甲基維斯阿米醇苷的平均回收率99.43%，RSD 0.87%，苦杏仁苷的平均回收率99.25%，RSD 0.76%，表明本法回收率良好。

2.1.4 浸膏得率測(cè)定

精密量取待測(cè)樣品V1（mL），置于已恒重蒸發(fā)皿中（M1），在105℃烘箱內(nèi)干燥至恒重，取出置于干燥器中冷卻30 min，迅速精密稱重（M2），計(jì)算浸膏得率。公式如下：

m為待測(cè)樣品中藥材總質(zhì)量，V2為待測(cè)樣品總體積

2.2 基于信息熵理論的小續(xù)命湯水提工藝評(píng)價(jià)2.2.1 小續(xù)命湯水提工藝正交試驗(yàn)

在相關(guān)文獻(xiàn)[11-16]基礎(chǔ)上結(jié)合預(yù)實(shí)驗(yàn)，選取加水量（A）、提取時(shí)間（B）、提取次數(shù)（C）為考察因素，稱取麻黃30 g、苦杏仁90 g、桂枝30 g、防風(fēng)60 g為1份，共9份，以升麻素苷、5-O-甲基維斯阿米醇苷、苦杏仁苷提取率以及浸膏得率為綜合評(píng)價(jià)指標(biāo)，按L9（34）正交表進(jìn)行煎煮提取。試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果見(jiàn)表1。

2.2.2 小續(xù)命湯水提工藝研究數(shù)據(jù)的處理

根據(jù)文獻(xiàn)[17-19]所給出的步驟，建立原始評(píng)價(jià)指標(biāo)矩陣，原始評(píng)價(jià)矩陣如下：

計(jì)算Pij，將原始評(píng)價(jià)矩陣轉(zhuǎn)換為“概率”矩陣。

計(jì)算各項(xiàng)指標(biāo)的信息熵，得到評(píng)價(jià)指標(biāo)的信息熵。

計(jì)算第i項(xiàng)指標(biāo)的權(quán)系數(shù)。

對(duì)于1個(gè)m行n列的概率矩陣，綜合評(píng)價(jià)指標(biāo)Mm＝P1m×W1＋P2m×W2＋P3m×W3＋…＋Pnm×Wn。

將概率矩陣的數(shù)據(jù)進(jìn)行加權(quán)處理，得到綜合評(píng)價(jià)指標(biāo)M，再進(jìn)行方差分析，以確定最優(yōu)實(shí)驗(yàn)方案。正交試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表1，方差分析見(jiàn)表2。

由極差分析結(jié)果可知，各因素對(duì)綜合指標(biāo)的影響主次順序?yàn)镃＞B＞A，即提取次數(shù)＞提取時(shí)間＞加水量。方差分析結(jié)果表明，B、C兩個(gè)因素有顯著性差異，A因素?zé)o顯著性差異。最終確定最佳提取工藝為A2B3C3，即加10倍量水，提取3次，每次1.5 h。

表1 L9（34） 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果

表2 方差分析

表3 驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果

2.3 驗(yàn)證試驗(yàn)

為確證該工藝的優(yōu)劣和穩(wěn)定性，按最佳條件提取麻黃、苦杏仁、桂枝、防風(fēng)3批進(jìn)行驗(yàn)證，測(cè)定各指標(biāo)成分提取率，計(jì)算綜合評(píng)分，結(jié)果見(jiàn)表3，RSD為0.62%。結(jié)果表明優(yōu)化后的小續(xù)命湯水提工藝穩(wěn)定可行。

3 討論

依據(jù)熱力學(xué)中熵的概念，把信息集的平均信息量稱為信息熵[20]。在信息論中，信息熵是系統(tǒng)不確定性和無(wú)序性的度量。該理論用于多指標(biāo)綜合評(píng)價(jià)時(shí)，相當(dāng)于將每個(gè)評(píng)價(jià)指標(biāo)作為1個(gè)隨機(jī)變量，通過(guò)計(jì)算各指標(biāo)的信息熵，從而給出各個(gè)指標(biāo)的不同權(quán)重。對(duì)于一項(xiàng)評(píng)價(jià)指標(biāo)，其取值變異程度越大，指標(biāo)越有序，信息熵就越小，其提供的信息量越多，該指標(biāo)就越重要，所占權(quán)重系數(shù)相應(yīng)地就越大[18]。信息熵理論在多屬性決策問(wèn)題中的應(yīng)用屬于客觀賦權(quán)法的一種，經(jīng)過(guò)對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的整理、計(jì)算和分析，得到的權(quán)重系數(shù)，可靠性更高。

本研究選取小續(xù)命湯水提組藥材中的已知有效成分：升麻素苷、5-O-甲基維斯阿米醇苷、苦杏仁苷的提取率，加上水提物浸膏得率作為多指標(biāo)進(jìn)行綜合評(píng)價(jià)，可較為全面地評(píng)判所篩選工藝的優(yōu)劣。

在數(shù)據(jù)處理時(shí)，采用信息熵權(quán)重分析法對(duì)各指標(biāo)進(jìn)行客觀賦權(quán)。與主觀賦權(quán)法相比[21-23]，權(quán)重?cái)?shù)據(jù)完全來(lái)自于對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的數(shù)理分析，清晰地反映了指標(biāo)成分在不同提取條件下變化的客觀規(guī)律。分析結(jié)果更為科學(xué)、客觀，所優(yōu)選的工藝合理、穩(wěn)定、可行，可為小續(xù)命湯的產(chǎn)業(yè)化研究提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

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Optimum Water Extraction Method for Xiaoxuming Decoction via Multi-Target Orthogonal Design

Wang Renjie1,2, Zhou Enli1,2, Li Miao1,2, Qin Jianping1,2, Wu Yun1,2, Sun Yongcheng1,2, Du Guanhua3, Xiao Wei1,2
(1. Jiangsu Kanion Parmaceutical Co., Ltd., Lianyungang 222001, China;
2. State Key Laboratory of New-Tech for Chinese Medicine Pharmaceutical Process, Lianyungang 222001, China;
3. Institute of Materia Medica, Chinese Academy of Medical Science, Beijing 100050, China)

This study aimed to optimize the water extraction method for Xiaoxuming decoction through multitarget orthogonal experiment. The comprehensive evaluation indexes included the extraction percentages of prem-O-glucosylcimifugin, 4’-O-beta-glucopyranosyl-5-O-methylvisamminol and amygdalin from water. The volume of water, extraction duration, and extraction frequency were crucial indexes for orthogonal design. It was found that optimum extraction parameters included three times of refluxing extraction with ten folds water, and 1.5 h for each time. In conclusion, this optimum extraction process was stable, practical and reasonable in the area of industrial production, and laid a fundamental for the water extraction method exploration of Xiaoxuming decoction.

Multi-target components, prem-O-glucosylcimifugin, 4’-O-beta-glucopyranosyl-5-O-methylvisamminol, amygdalin, comprehensive evaluation, Xiaoxuming decoction, entropy method

10.11842/wst.2016.04.017

R283.6

A

（責(zé)任編輯：馬雅靜，責(zé)任譯審：朱黎婷）

2015-01-31

修回日期：2015-03-16

＊ 科學(xué)技術(shù)部“重大新藥創(chuàng)制”科技重大專項(xiàng)（2013ZX09402203）：現(xiàn)代中藥創(chuàng)新集群與數(shù)字制藥技術(shù)平臺(tái)，負(fù)責(zé)人：王振中。

＊＊ 通訊作者：蕭偉，本刊編委，博士，研究員級(jí)高級(jí)工程師，主要研究方向：中藥制劑和創(chuàng)新中藥的研究與開(kāi)發(fā)。