高脂誘導(dǎo)BRL-3A細(xì)胞胰島素抵抗模型的建立

金　 磊，王　 帥，王　 欣，海春旭，李文麗*（第四軍醫(yī)大學(xué)軍事預(yù)防醫(yī)學(xué)院毒理學(xué)教研室，陜西省自由基生物學(xué)與醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，陜西 西安　 710032）

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高脂誘導(dǎo)BRL-3A細(xì)胞胰島素抵抗模型的建立

金 磊，王 帥，王 欣，海春旭，李文麗*
（第四軍醫(yī)大學(xué)軍事預(yù)防醫(yī)學(xué)院毒理學(xué)教研室，陜西省自由基生物學(xué)與醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，陜西 西安 710032）

【摘要】目的： 采用棕櫚酸(PA)誘導(dǎo)BRL-3A細(xì)胞，建立肝細(xì)胞胰島素抵抗體外模型。方法：分別用不同濃度(0、50、100、200、300、400 μmol/L)棕櫚酸處理BRL-3A細(xì)胞不同時(shí)間(6、12、24 h)后，檢測(cè)細(xì)胞生存率、基礎(chǔ)葡萄糖消耗及胰島素刺激葡萄糖消耗的變化。結(jié)果：高濃度PA(200、300、400 μmol/L)使細(xì)胞生存率顯著降低(P<0.05)；低濃度PA(50、100 μmol/L)短時(shí)間(6和12 h)作用對(duì)細(xì)胞生存率無(wú)明顯影響(P>0.05)；不同濃度PA短時(shí)間(6 h)作用于細(xì)胞，其基礎(chǔ)葡萄糖消耗及胰島素刺激葡萄糖消耗與正常組相比無(wú)顯著變化(P>0.05)，作用24 h后細(xì)胞葡萄糖消耗量均明顯下降(P<0.05)，100 μmol/L的PA處理12 h可降低細(xì)胞基礎(chǔ)葡萄糖消耗及胰島素刺激的葡萄糖消耗量(P<0.05)，且在繼續(xù)培養(yǎng)至72 h攝糖能力無(wú)明顯改變。結(jié)論：100 μmol/L的PA作用12 h可誘導(dǎo)BRL-3A細(xì)胞產(chǎn)生胰島素抵抗。

【關(guān)鍵詞】棕櫚酸；胰島素抵抗；葡萄糖消耗；葡萄糖氧化酶法

作者信息： 金 磊，E-mail：kingleer001@163.com。*通信作者，李文麗，E-mail：liwenli@fmmu.edu.cn

Induction of insulin resistance by palmitic acid in BRL-3A cells

JIN Lei，WANG Shuai，WANG Xin，HAI Chunxu，LI Wenli*
(Shaanxi Key Lab of Free Radical Biology and Medicine, Department of Toxicology, School of Preventive Medicine, Fourth Military Medical University, Xi’an 710032, Shaanxi, China)

【ABSTRACT】OBJECTIVE: To investigate an insulin resistance in BRL-3A cells after their exposure to palmitic acid (PA). METHODS：BRL-3A cells were incubated with PA (0，50，100，200，300，400 μmol/L) for 6，12 or 24 hours. After the exposure，cell viability，basic and insulin-stimulated glucose consumption were assayed. RESULTS：Incubation of cells with high concentrations of PA (200，300，400 μmol/L) significantly decreased survival of cells (P<0.05). Incubation of cells with low concentrations of PA (50，100 μmol/L) for 6 and 12 h had no significant effect on cell viability (P>0.05). The basic and insulin-stimulated glucose consumption in these cells were not altered by different concentration of PA incubation for 6 h (P>0.05). However，24 h after the exposure，all concentrations of PA decreased glucose consumption (P<0.05). At 12 h after the exposure，100 μmol/L of PA decreased basic and insulin-stimulated glucose consumption (P<0.05)，and this ability remained unchanged after 72 h of continuing cultured. CONCLUSION：Incubation of BRL-3A cells with 100 μmol/L of PA for 12 h could induce insulin resistance in vitro.

【KEY WORDS】palmitic acid；insulin resistance；glucose consumption；glucose oxidase peroxidase

胰島素抵抗(insulin resistance，IR)是指生理劑量胰島素在機(jī)體內(nèi)產(chǎn)生生物學(xué)效應(yīng)低于正常，主要表現(xiàn)為胰島素敏感靶器官(肝臟、骨骼肌及脂肪)對(duì)胰島素介導(dǎo)的糖、脂質(zhì)、蛋白質(zhì)代謝能力下降。目前公認(rèn)的“共同土壤”學(xué)說(shuō)認(rèn)為IR是代謝綜合征、高血壓、高尿酸血癥、2型糖尿病、心腦血管疾病等聚集發(fā)病臨床征候群的共同發(fā)病基礎(chǔ)[1]。長(zhǎng)期IR人群出現(xiàn)心腦血管意外等終點(diǎn)事件的概率明顯高于正常人群。

肝臟作為胰島素作用的靶器官之一，可合成、儲(chǔ)存與釋放糖原，并與脂肪代謝密切相關(guān)。高能量飲食可使肝臟減少糖原合成，增加糖異生及肝糖原分解，是形成高血糖的主要原因之一[2-3]。建立IR肝細(xì)胞模型有助于在細(xì)胞水平和分子水平深入研究IR發(fā)生機(jī)制。目前IR細(xì)胞模型多采用3T3-L1(脂肪細(xì)胞)、HepG2(人肝癌細(xì)胞)細(xì)胞系等，對(duì)于常用實(shí)驗(yàn)動(dòng)物大鼠的正常肝細(xì)胞IR模型尚未見(jiàn)報(bào)道。本研究采用葡萄糖氧化酶法(glucose oxidase peroxidase，GOD-POD)，觀(guān)察棕櫚酸(palmitic a cid，PA)誘導(dǎo)大鼠正常肝細(xì)胞系(BRL-3A)產(chǎn) 生IR的可能性及穩(wěn)定性，為研究肝組織IR機(jī)制及改善肝組織IR藥物的篩選提供一種簡(jiǎn)單可靠的IR細(xì)胞模型。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

BRL-3A肝細(xì)胞系購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞生物所，RPMI 1640培養(yǎng)基購(gòu)自Gibco公司，PA、結(jié)晶牛胰島素購(gòu)自Sigma公司，四甲基偶氮噻唑藍(lán)[3-(4，5-dimethyl-2-thiazolyl)-2，5-diphenyl-2-H-tetrazolium bromide，MTT]購(gòu)自Amresco公司，新生牛血清購(gòu)自杭州四季青生物工程材料有限公司，胰蛋白酶、牛血清白蛋白購(gòu)自西安國(guó)安生物科技有限公司，葡萄糖測(cè)定試劑盒購(gòu)自北京普利萊基因技術(shù)有限公司。其余常規(guī)試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。酶標(biāo)儀為美國(guó)TECAN公司的Infinite 200 PRO。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 PA儲(chǔ)備液的配制 用無(wú)水乙醇配制200 mmol/L 的PA溶液，再加入溶有牛血清白蛋白的PBS平衡鹽溶液配制成5 mmol/L的PA儲(chǔ)備液，期間振蕩及50 ℃助溶，用0.22 μm孔徑一次性濾器進(jìn)行過(guò)濾分裝后-4 ℃凍存。使用前先取出儲(chǔ)備液放入37 ℃水浴鍋中，解凍并預(yù)熱30 min，冷卻至室溫后用無(wú)血清RPMI 1640培養(yǎng)液稀釋成所需濃度。

1.2.2 酶標(biāo)儀的精密度評(píng)估及葡萄糖濃度測(cè)定的線(xiàn)性范圍驗(yàn)證 采用10 mmol/L葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品對(duì)本實(shí)驗(yàn)檢測(cè)儀器Infinite 200 PRO酶標(biāo)儀的精密度進(jìn)行評(píng)估，結(jié)果符合實(shí)驗(yàn)要求。同時(shí)按照美國(guó)臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化委員會(huì)(Clinical and Laboratory Standards Institute，CLSI)的EP6-A文件[4]《定量測(cè)定項(xiàng)目的線(xiàn)性評(píng)價(jià)》要求驗(yàn)證葡萄糖濃度測(cè)定的線(xiàn)性范圍，結(jié)果符合試劑說(shuō)明書(shū)的要求(在0.02~20 mmol/L內(nèi)葡萄糖濃度與吸光度值呈線(xiàn)性關(guān)系，R2>0.99)。

1.2.3 BRL-3A細(xì)胞培養(yǎng) BRL-3A細(xì)胞用含10%新生牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)液，于37 ℃、飽和濕度、CO2體積分?jǐn)?shù)為5%的條件下培養(yǎng)。隔日換液1次，待細(xì)胞生長(zhǎng)至匯合度超過(guò)90%后，胰酶消化離心后按1∶ 3傳代培養(yǎng)。按每孔1.0×104個(gè)接種至96孔培養(yǎng)板，細(xì)胞匯合度超過(guò)80%時(shí)進(jìn)行分組處理。

1.2.4 實(shí)驗(yàn)分組 實(shí)驗(yàn)分正常對(duì)照組、PA組(濃度分別為50、100、200、300、400 μmol/L)及溶劑組(與PA組相對(duì)應(yīng)，乙醇含量分別為0.025、0.05、0.1、0.15、0.2 ml/L)，每組設(shè)9個(gè)復(fù)孔。

1.2.5 細(xì)胞相對(duì)生存率檢測(cè) 各組細(xì)胞處理完畢(6、12、24 h)后吸棄孔內(nèi)培養(yǎng)液，每孔加入5 mg/mL的MTT 20 μL，于37 ℃繼續(xù)孵育4 h，終止培養(yǎng)，棄上清，每孔加入DMSO 150 μL，置于酶標(biāo)儀振蕩3 min后，測(cè)定490 nm波長(zhǎng)處吸光度D(490)值，各處理組細(xì)胞相對(duì)生存率=各處理組D(490)值/對(duì)照組D(490)值×100%。

1.2.6 IR模型的評(píng)估 細(xì)胞按實(shí)驗(yàn)分組(0、50、100、200、300、400 μmol/L)處理完畢(6、12 、24 h)后吸棄孔內(nèi)培養(yǎng)液，PBS溶液洗2次，每孔加入100 μL無(wú)血清RPMI 1640培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)24 h，檢測(cè)各孔葡萄糖濃度，計(jì)算基礎(chǔ)葡萄糖消耗量。各孔消耗葡萄糖量=空白孔葡萄糖濃度-各孔葡萄糖濃度。

同樣，細(xì)胞分組處理后，每組其中5孔加含1×10-7mol/L胰島素的無(wú)血清RPMI 1640培養(yǎng)液100 μL，另5孔僅加無(wú)血清RPMI 1640培養(yǎng)液100 μL，30 min后吸棄孔內(nèi)培養(yǎng)液，PBS溶液洗2次，每孔加入100 μL無(wú)血清RPMI 1640培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)2 h后，檢測(cè)各孔葡萄糖濃度，計(jì)算胰島素刺激葡萄糖消耗量。各孔消耗葡萄糖量的計(jì)算方法同上。

根據(jù)Trinder反應(yīng)原理，葡萄糖在葡萄糖氧化酶(glucose oxidase，GOD)作用下生成葡萄糖酸和過(guò)氧化氫，然后用過(guò)氧化物酶(peroxidase，POD)催化過(guò)氧化氫，使色原物質(zhì)生成醌亞胺，顏色深淺與葡萄糖濃度呈正比。因此采用GOD-POD法可使用酶標(biāo)儀簡(jiǎn)便測(cè)定葡萄糖濃度。

1.2.7 IR模型穩(wěn)定性評(píng)估 綜合1.2.5及1.2.6結(jié)果選取合適PA濃度及作用時(shí)間點(diǎn)處理BRL-3A細(xì)胞建模成功后，吸棄孔內(nèi)培養(yǎng)液，PBS溶液洗2次，每孔加入100 μL無(wú)血清培養(yǎng)液，分別培養(yǎng)24、48、72 h后檢測(cè)基礎(chǔ)葡萄糖消耗和胰島素刺激葡萄糖消耗變化。

采用SPSS 20.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，數(shù)據(jù)用表示，多組間均數(shù)比較采用單因素方差分析，并用LSD-t檢驗(yàn)進(jìn)行兩兩比較。以α=0.05為檢驗(yàn)水準(zhǔn)。

2 結(jié) 果

2.1 PA對(duì)BRL-3A細(xì)胞生存率的影響

2.1.1 乙醇對(duì)BRL-3A細(xì)胞生存率的影響 不同濃度乙醇的溶劑組作用于BRL-3A細(xì)胞6、12和24 h后，其相對(duì)生存率與正常對(duì)照組相比差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P> 0.05)，即溶劑對(duì)細(xì)胞活性無(wú)干擾作用。結(jié)果見(jiàn)圖1。

圖1 不同濃度乙醇對(duì)BRL-3A細(xì)胞相對(duì)生存率影響

2.1.2 PA對(duì)BRL-3A細(xì)胞生存率的影響 50、100 μmol/L的PA作用于BRL-3A細(xì)胞不超過(guò)12 h，細(xì)胞生存率與正常對(duì)照組相比差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。隨PA作用濃度增加和作用時(shí)間延長(zhǎng)，細(xì)胞生存率比正常對(duì)照組顯著降低(P<0.05)，存在時(shí)間及劑量依賴(lài)關(guān)系。結(jié)果提示，用于建模的PA適宜濃度為小于200 μ mol/L，作用時(shí)間為12 h。結(jié)果見(jiàn)圖2。

與對(duì)照組比較，*P<0.05.圖2 不同濃度棕櫚酸對(duì)BRL-3A細(xì)胞相對(duì)生存率影響

2.2 PA對(duì)BRL-3A細(xì)胞基礎(chǔ)葡萄糖消耗的影響

2.2.1 乙醇對(duì)BRL-3A細(xì)胞基礎(chǔ)葡萄糖消耗的影響 不同濃度乙醇的溶劑組作用于BRL-3A細(xì)胞6、12、24 h后，其葡萄糖消耗與正常對(duì)照組相比差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，即溶劑對(duì)細(xì)胞基礎(chǔ)葡萄糖消耗無(wú)明顯影響。結(jié)果見(jiàn)圖3。

2.2.2 PA對(duì)BRL-3A細(xì)胞基礎(chǔ)葡萄糖消耗的影響 50 μmol/L的PA作用BRL-3A細(xì)胞不同時(shí)間(6、12和24 h)后，消耗葡萄糖量與對(duì)照組相比差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。隨PA濃度增加和作用時(shí)間延長(zhǎng)，BRL-3A細(xì)胞消耗葡萄糖量逐漸下降。100 μmol/L的PA作用12 h，BRL-3A細(xì)胞消耗葡萄糖量與正常對(duì)照組相比顯著降低(P<0.05)。結(jié)合PA對(duì)細(xì)胞生存率的結(jié)果，提示PA建模的適宜濃度為100 μmol/L，適宜作用時(shí)間為12 h。結(jié)果見(jiàn)圖4。

圖3 不同濃度乙醇對(duì)BRL-3A細(xì)胞基礎(chǔ)葡萄糖消耗的影響

與對(duì)照組比較，*P<0.05.圖4 不同濃度棕櫚酸對(duì)BRL-3A細(xì)胞基礎(chǔ)葡萄糖消耗的影響

2.3 PA對(duì)BRL-3A細(xì)胞胰島素刺激葡萄糖消耗的影響

正常對(duì)照組細(xì)胞在胰島素刺激后葡萄糖消耗量與未刺激時(shí)相比明顯增加(P<0.05)。隨PA作用濃度增加及作用時(shí)間延長(zhǎng)，胰島素刺激后細(xì)胞葡萄糖消耗量與同組細(xì)胞未刺激時(shí)相比差距逐漸下降。PA作用時(shí)間超過(guò)12 h的細(xì)胞，胰島素刺激后葡萄糖消耗量與未刺激時(shí)無(wú)明顯變化。進(jìn)一步證實(shí)，100 μmol/L的PA作用12 h可誘導(dǎo)BRL-3A細(xì)胞產(chǎn)生IR。結(jié)果見(jiàn)圖5。

2.4 PA誘導(dǎo)的IR細(xì)胞模型穩(wěn)定性評(píng)估

2.4.1 IR模型細(xì)胞繼續(xù)培養(yǎng)后基礎(chǔ)葡萄糖消耗變化 模型組BRL-3A細(xì)胞繼續(xù)培養(yǎng)直至72 h，其基礎(chǔ)葡萄糖消耗與正常對(duì)照組細(xì)胞相比仍較低，且繼續(xù)培養(yǎng)不同時(shí)間，細(xì)胞消耗葡萄糖量無(wú)明顯變化(P>0.05)，提示在72 h內(nèi)細(xì)胞模型較穩(wěn)定。結(jié)果見(jiàn)圖6。

2.4.2 IR模型細(xì)胞繼續(xù)培養(yǎng)后胰島素刺激葡萄糖消耗變化 正常對(duì)照組在胰島素刺激后細(xì)胞消耗葡萄糖量均增加 (P<0.05)，模型組細(xì)胞繼續(xù)培養(yǎng)直至72 h，胰島素刺激后細(xì)胞攝糖量與未刺激組無(wú)明顯變化(P>0.05)，進(jìn)一步提示在72 h內(nèi)模型細(xì)胞較穩(wěn)定。結(jié)果見(jiàn)圖7。

A：棕櫚酸作用6 h；B：棕櫚酸作用12 h；C：棕櫚酸作用24 h. 與對(duì)照組比較，*P<0.05.圖5 不同濃度棕櫚酸作用不同時(shí)間對(duì)BRL-3A細(xì)胞胰島素刺激葡萄糖消耗的影響

與對(duì)照組比較，*P<0.05.圖6 IR模型BRL-3A細(xì)胞繼續(xù)培養(yǎng)不同時(shí)間后基礎(chǔ)葡萄糖消耗的變化

3 討 論

IR是多基因遺傳基礎(chǔ)上受環(huán)境、精神、飲食、運(yùn)動(dòng)等因素綜合作用的結(jié)果。具體與肥胖、炎癥、氧化應(yīng)激、內(nèi)分泌激素、神經(jīng)中樞調(diào)節(jié)等方面有關(guān)。近年研究表明，脂肪代謝紊亂，尤其血清游離脂肪酸(free fatty acid，F(xiàn)FA)在非脂肪組織(肝臟、肌肉、腎臟等)的異位沉積是引起IR的始動(dòng)原因[5-7]。過(guò)量FFA被輸送至肝臟、肌肉，引起多種細(xì)胞因子(TNF-α、IL-6和PAI-1等)的分泌，巨噬細(xì)胞誘導(dǎo)的脂肪分解增強(qiáng)，出現(xiàn)內(nèi)皮功能異常、高凝狀態(tài)、炎性反應(yīng)增強(qiáng)[2-3，8]，活性氧產(chǎn)生大量增加，引起脂肪酸β氧化增加，導(dǎo)致氧化應(yīng)激損傷，影響胰島素信號(hào)通路，造成肝葡萄糖輸出，同時(shí)肝糖原合成下降、糖異生增強(qiáng)，肝酶及脂蛋白升高，肝細(xì)胞損傷加劇，最終導(dǎo)致非酒精性脂肪肝(nonalcoholic fatty liver disease，NAFLD)的發(fā)生[9-10]。而脂肪在胰腺的沉積亦可造成β細(xì)胞功能障礙，骨骼肌脂肪沉積可導(dǎo)致胰島素敏感性降低，腎臟的脂質(zhì)蓄積可改變腎濾過(guò)和重吸收功能[11]，因此目前人們對(duì)于IR機(jī)制的認(rèn)識(shí)從“血糖中心論”逐漸轉(zhuǎn)為“脂肪代謝紊亂中心論”。為研究機(jī)體肝細(xì)胞IR，目前常用的模型是HepG2細(xì)胞系(人肝癌細(xì)胞)[12]，但HepG2細(xì)胞株在氧化應(yīng)激、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、細(xì)胞代謝等蛋白組學(xué)表達(dá)均不同于正常細(xì)胞[13]，決定了它在葡萄糖攝取、糖原、脂質(zhì)合成研究中存在不足。因此，本研究選取大鼠正常肝細(xì)胞系，建立飽和高級(jí)脂肪酸誘導(dǎo)的IR模型具有重要意義。

A：正常對(duì)照組；B：模型組. 與對(duì)照組比較，*P<0.05.圖7 IR模型BRL-3A細(xì)胞繼續(xù)培養(yǎng)不同時(shí)間后對(duì)胰島素刺激葡萄糖消耗變化

目前體外實(shí)驗(yàn)中檢測(cè)葡萄糖主要采用C、H同位素標(biāo)記法示蹤[14-19]，此法能高靈敏度直接反映糖代謝過(guò)程中的葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)、氧化、糖原合成等具體情況，但存在易造成放射性污染、操作不便等不足。臨床檢測(cè)血糖常用的GOD-POD法，其采用酶標(biāo)儀、分光光度計(jì)、生化分析儀等常規(guī)儀器即可進(jìn)行，可靈敏、準(zhǔn)確地判斷細(xì)胞糖攝取能力及評(píng)價(jià)胰島素敏感性。本研究采用此法對(duì)BRL-3A細(xì)胞葡萄糖消耗進(jìn)行定量檢測(cè)，評(píng)價(jià)胰島素敏感性。由于此法為微量檢測(cè)，操作中干擾因素多，易出現(xiàn)實(shí)驗(yàn)誤差。故在實(shí)驗(yàn)中均使用同批次配置的無(wú)血清RPMI 1640培養(yǎng)液，未額外添加葡萄糖；各種干預(yù)結(jié)束后均用PBS平衡鹽溶液洗滌后檢測(cè)以消除干擾因素(血清、PA、胰島素等)。

隨著PA 作用濃度增大及時(shí)間延長(zhǎng)，細(xì)胞活力及葡萄糖攝取逐漸降低已達(dá)成共識(shí)，但PA制備模型的濃度因細(xì)胞而不同。溫宇等[20]報(bào)道，PA濃度達(dá)到1.0 mmol/L時(shí)才可明顯抑制3T3-L1細(xì)胞胰島素刺激下葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)，而高濃度PA可對(duì)細(xì)胞生存產(chǎn)生明顯抑制。因此本實(shí)驗(yàn)首先檢測(cè)了PA對(duì)細(xì)胞生存率的影響，在排除乙醇溶劑對(duì)結(jié)果影響后發(fā)現(xiàn)，較低濃度PA (50、100 μmol/L)較短時(shí)間(6和12 h)作用對(duì)細(xì)胞生存率無(wú)影響，高濃度PA (200、300、400 μmol/L)長(zhǎng)時(shí)間(24 h)作用后，細(xì)胞生存率與對(duì)照組相比明顯下降。與韓玲玲等[21]研究PA對(duì)細(xì)胞生存率的影響基本一致。

本實(shí)驗(yàn)研究了不同作用濃度和時(shí)間后細(xì)胞基礎(chǔ)葡萄糖消耗變化，發(fā)現(xiàn)PA短時(shí)間作用(6 h)對(duì)細(xì)胞基礎(chǔ)葡萄糖消耗無(wú)影響，而作用24 h后細(xì)胞耗糖量明顯下降，但因長(zhǎng)時(shí)間作用對(duì)細(xì)胞生存率影響較大，故6 h、24 h兩個(gè)時(shí)間點(diǎn)均不適合用于建模，PA作用12 h結(jié)果提示，100、200、300、400 μmol/L的PA可使細(xì)胞基礎(chǔ)葡萄糖消耗量下降，結(jié)合細(xì)胞生存率實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，100 μmol/L的PA作用12 h可作為BRL-3A細(xì)胞誘導(dǎo)IR的建模條件。IR一旦產(chǎn)生，則模型除基礎(chǔ)葡萄糖消耗會(huì)減少，還會(huì)對(duì)胰島素敏感性下降，表現(xiàn)為胰島素介導(dǎo)的葡萄糖消耗減低。因此，我們還用胰島素誘導(dǎo)的葡萄糖消耗實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步驗(yàn)證PA是否可誘導(dǎo)BRL-3A細(xì)胞產(chǎn)生IR。結(jié)果證實(shí)，候選IR建模條件處理的細(xì)胞在胰島素刺激后葡萄糖消耗并不增加，另外隨濃度增大、作用時(shí)間延長(zhǎng)，細(xì)胞對(duì)胰島素介導(dǎo)的葡萄糖攝取能力逐漸下降。故兩種方法均證實(shí)100 μmol/L濃度的PA作用12 h可誘導(dǎo)細(xì)胞產(chǎn)生IR。

對(duì)IR細(xì)胞模型的穩(wěn)定性進(jìn)行評(píng)估有利于進(jìn)一步對(duì)IR機(jī)制及相關(guān)藥物進(jìn)行研究。因此，本研究最后還探討了模型的穩(wěn)定性。結(jié)果表明，建模后更換正常培養(yǎng)液培養(yǎng)至72 h，細(xì)胞基礎(chǔ)和胰島素刺激葡萄糖消耗均無(wú)明顯變化。提示該模型在正常培養(yǎng)72 h內(nèi)可保持穩(wěn)定。因此，本研究成功建立了PA誘導(dǎo)的BRL-3A細(xì)胞胰島素抵抗模型，為研究肝臟IR發(fā)生機(jī)制及改善肝臟IR的藥物篩選提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

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基金項(xiàng)目：國(guó)家自然科學(xué)基金(31170807)

收稿日期：2015-07-03；

修訂日期：2015-12-16

中圖分類(lèi)號(hào)：R587.1

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號(hào)：1004-616X(2016)01-0046-06

doi:1 0.3969/j.issn.1004-616x.2016.01.010