miR-143、MMP-2 和TIMP-1在哈薩克族食管癌組織中的表達及其臨床病理意義

李秀梅郭 瓊王 崠陳 艷李 卉諶宏鳴*李惠武（. 新 疆醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院新疆 烏魯木齊 8300；. 新疆武警總隊醫(yī)院新疆 烏魯木齊 8300）

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miR-143、MMP-2 和TIMP-1在哈薩克族食管癌組織中的表達及其臨床病理意義

李秀梅1，郭 瓊1，王 崠2，陳 艷1，李 卉1，諶宏鳴1，*，李惠武1
（1. 新 疆醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，新疆 烏魯木齊 830011；2. 新疆武警總隊醫(yī)院，新疆 烏魯木齊 830011）

【摘要】目的： 探討在新疆哈薩克族食管癌組織中miR-143、基質(zhì)金屬蛋白酶-2(MMP-2) 和基質(zhì)金屬蛋白酶抑制劑-1(TIMP-1)的表達及其臨床意義。方法：根據(jù)前期芯片檢測結(jié)果，通過靶點預(yù)測軟件PicTar， TargetScan和miRanda預(yù)測miR-143可能與腫瘤相關(guān)的靶基因。并采用實時熒光定量PCR方法檢測30例哈薩克族食管癌組織及相應(yīng)癌旁組織中miR-143、MMP-2和TIMP-1的表達水平，分析其與臨床病理特征的關(guān)系。結(jié)果：miR-143在哈薩克族食管癌組織中表達較遠端癌旁組織中明顯降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.000)； miR-143低表達與分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、臨床分期相關(guān)(P依次為0.042、0.039、0.007)；MMP-2、TIMP-1在哈薩克族食管癌組織中表達均較遠端癌旁組織中增高，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.026和P=0.021)；MMP-2高表達與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移正相關(guān)(r=0.367， P=0.037)；miR-143與MMP-2、TIMP-1的表達均呈負相關(guān)(r依次為-0.442、-0.410，P均<0.05)，MMP-2與TIMP-1的表達呈正相關(guān)(r=0.794，P=0.000)。結(jié)論：miR-143與MMP-2、TIMP-1表達失調(diào)共同參與哈薩克族食管癌的發(fā)生發(fā)展過程，MMP-2和TIMP-1可能是miR-143的靶基因。

【關(guān)鍵詞】食管癌；miR-143；基質(zhì)金屬蛋白酶-2；基質(zhì)金屬蛋白酶抑制劑-1

作者信息： 李秀梅，Tel：13899818077，E-mail：dr.lxm@163.com。*通信作者，諶宏鳴，E-mail：chenhongming5709@163.com

Expression and significance of miR-143, MMP-2 and TIMP-1 in esophageal
cancer in Kazaks

LI Xiumei1，GUO Qiong1，WANG Dong2，CHEN Yan1，LI Hui1，CHEN Hongming1，*，LI Huiwu1
(1. School of Basic Medicine, Xinjiang Medical University, Urumqi 830011; 2. Xinjiang Armed Police Hospital, Urumqi 830011, Xinjiang, China)

【ABSTRACT】OBJECTIVE: To study expressions of miR-143，matrix metalloproteinase-2(MMP-2) and tissue inhibitor of metalloproteinase-1(TIMP-1) in esophageal cancer tissue and normal tissue among Kazaks and to investigate the relationship between their expressions and clinical pathological features. METHODS： Using real time-PCR to detect the expression of miR-143，MMP-2 and TIMP-1 in 30 esophageal cancer specimens. RESULTS：The expression levels of miR-143 in cancer tissue were lower than those of normal tissues(P=0.000)．The lower expression of miR-143 was significantly related to the cellular differentiation， lymph node metastasis and clinical stage (P=0.042，0.039，0.007)．The expression levels of MMP-2，TIMP-1 in cancer tissue were higher than those of normal tissues(P=0.026，0.021)．Enhanced expression of MMP-2 was significantly related to lymph node metastasis(r=0.367，P=0.037)．The expression of miR-143 in the Kazak’s esophageal cancer was negatively related to the expressions of MMP-2 and TIMP-1 (r=-0.442，-0.410； P=0.001，0.003)．The expression of MMP-2 positively related to that of TIMP-1(r=0.794，P= 0.000)． CONCLUSION：The under-expression of miR-143 and over-expressions of MMP-2 and TIMP-1 may have important roles in carcinogenesis of esophageal cancer in Kazaks.

【KEY WORDS】esophageal cancer；miR-143；matrix m etalloproteinase-2；tissue i nhibitor o f m etalloproteinase-1

食管癌(esophageal cancer，EC)是世界上6大常見惡性腫瘤之一，食管癌患病率因地區(qū)變化而顯著不同，在新疆哈薩克族食管癌發(fā)病率最高(155.9/10萬)[1]。microRNA是一類具有組織特異性或發(fā)育階段特異性、非編碼調(diào)控的小RNA，近幾年的研究發(fā)現(xiàn)在腫瘤組織及外周血中microRNA的表達與腫瘤的發(fā)生和發(fā)展密切相關(guān)[2]。我們前期實驗采用芯片篩查出35個在哈薩克族食管癌組織中差異顯著的microRNA，提示哈薩克族食管癌組織microRNA表達譜發(fā)生了明顯改變，其中miR-143表達下調(diào)2倍。本文根據(jù)芯片的數(shù)據(jù)結(jié)果首先采用熒光定量PCR技術(shù)檢測30例新疆哈薩克族食管癌組織及其遠端癌旁組織中miR-143的表達情況，驗證芯片結(jié)果的準確性，然后通過軟件預(yù)測基質(zhì)金屬蛋白酶-2 (matrix metalloproteinase-2，MMP-2)和基質(zhì)金屬蛋白酶抑制劑-1 ( tissue i nhibitor o f m etalloproteinase-1，TIMP-1)可能是miR-143的靶基因，結(jié)合前期試驗結(jié)果MMP-2、TIMP-1與哈薩克族食管癌侵襲轉(zhuǎn)移密切相關(guān)[3]。因此，本文中我們分析了miR-143與MMP-2、TIMP-1表達的相關(guān)性，旨在探討三者在哈薩克族食管癌發(fā)生發(fā)展中的作用及其臨床病理意義。

1 材料與方法

1.1 靶基因的預(yù)測

根據(jù)芯片檢測結(jié)果，通過靶點預(yù)測軟件PicTar，TargetScan和miRanda(委托北京博奧晶典生物技術(shù)有限公司檢測)預(yù)測miR-143可能與腫瘤相關(guān)的靶基因。

1.2 臨床資料

30例新疆哈薩克族食管癌組織及遠端癌旁對照正常組織(距離癌組織5 cm以上)均取自2008—2013年新疆醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院手術(shù)切除標本，患者術(shù)前均未接受放化療，手術(shù)中取材后迅速將標本置于液氮中，置于-80 ℃ 冰箱保存。癌組織病理切片均診斷為鱗狀上皮細胞癌。男15例，女15例；年齡36~65歲，中位年齡54歲；腫瘤臨床分期按國際TNM分期(UICC，2 009年)，其中I期3例、Ⅱ期11例、Ⅲ期16例；有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移14例，無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移16例；低分化16例，高分化14例。

1.3 引物與主要試劑

miScript II RT Kit、miScript SYBR Green PCR Kit、引物，均購自Qiagen公司；RNA提取試劑Trizol購自Promega公司。引物序列如下：miR-143，上游5'-AT GCCCTTTCATCATTGC-3'，下游5'-GAGCTACAGTGCT TC-3'；U6，上游5'-CTCGCTTCGGCAGCACA-3'，下游5'-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3'；MMP-2，上游5'-AGATCTTCTTCTTCAAGGACC-3'，下游5'-GGCTGG TCAGTGGCTTGGGG-3'；TIMP-1，上游5'-GATCCAG CGCCCAGAGAGACA-3'，下游5'-AGCTTCCACTCCGG GCAGGAT-3'。

1.4 組織總RNA提取、逆轉(zhuǎn)錄及實時熒光定量PCR

采用Trizol試劑一步法提取總RNA，紫外分光光度計測定其純度。以提取的總RNA為模板，按miScript II RT Kit說明書進行逆轉(zhuǎn)錄。以得到的cDNA為模板進行實時熒光定量PCR擴增。PCR擴增反應(yīng)體積為25 μL，反應(yīng)條件：94 ℃、2 min；94 ℃、20 s，61 ℃、30 s，72 ℃、30 s，40個循環(huán)；72 ℃、5 min。

1.5 統(tǒng)計學(xué)分析

應(yīng)用SPSS 16.0軟件包，數(shù)據(jù)采用2-ΔΔCT法

進行分析，基因在哈薩克族食管癌組織和遠端癌旁組織中表達量的比較采用t檢驗，各基因與哈薩克族食管癌臨床病理因素的關(guān)系采用Spearman雙變量相關(guān)性分析，以α=0.05為檢驗水準。

2 結(jié) 果

2.1 miR-143靶基因預(yù)測結(jié)果

見表1。為了減少假陽性率，挑選至少出現(xiàn)在2個軟件中的基因作為其可能的靶基因。最終我們選擇了MMP-2和TIMP-1基因。

表1 miR-143腫瘤相關(guān)靶基因的預(yù)測

2.2 腫瘤組織中miR-143、MMP-2和TIMP-1 的表達

熒光定量PCR檢測結(jié)果顯示，30例哈薩克族食管癌組織及癌旁組織中，miR-143在腫瘤組織中的表達下調(diào)，與癌旁組織相比，其相對表達水平(0.23± 0.08)下調(diào)了近3倍，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。在腫瘤組織中MMP-2和TIMP-1的相對表達量(1.83±0.17、2.21±0.22)均明顯高于癌旁組織，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P均<0.05)。見圖1。

圖1 腫瘤組織中miR-143、MMP-2、TIMP-1的表達

2.3 哈薩克族食管癌組織中miR-143、MMP-2、TIMP-1表達與病理因素的關(guān)系

結(jié)果顯示：miR-143的表達在低分化組顯著低于中、高分化組，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組顯著低于無淋巴轉(zhuǎn)移組(P均<0.05)，臨床分期Ⅱb～Ⅲ期組miR-143表達顯著下調(diào)，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P均<0.05)。且miR-143低表達與分化程度(r=-0.586，P=0.008)、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移(r= -0.378，P=0.013)和臨床分期均呈負相關(guān)(r=-0.524，P=0.003)。有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的腫瘤組織中MMP-2的表達顯著高于淋巴結(jié)未轉(zhuǎn)移的腫瘤組織，MMP-2的高表達與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移呈正相關(guān)(r= 0.367，P=0.002)。TIMP-1的表達與分化程度、臨床分期及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移均無明顯相關(guān)關(guān)系。見表2。

2.4 基因相關(guān)性分析

Spearman相關(guān)分析顯示在哈薩克族食管癌組織中miR-143與MMP-2表達量負相關(guān)(r=-0.442， P= 0.001)，miR-143與TIMP-1表達量負相關(guān)(r=-0.410，P=0.003)，TIMP-1與MMP-2表達量呈正相關(guān)(r=0.794，P=0.000)。見表3。

表2 食管癌組織中miR-143、MMP-2和TIMP-1的表達與病理資料的關(guān)系

表3 miR-143與MMP-2和TIMP-1相關(guān)性的分析(CT值)

3 討 論

食管癌是我國最常見的惡性腫瘤之一，在我國食管癌的發(fā)病率具有明顯的地域性，在新疆哈薩克族食管癌發(fā)病率最高，目前早發(fā)現(xiàn)、早治療是提高食管癌患者5年生存率的有效方法，因此，尋找食管癌早期診斷和預(yù)后標志物有重要意義。近年來microRNA的研究是分子腫瘤學(xué)研究的熱點之一，生物信息學(xué)數(shù)據(jù)表明，microRNA在細胞生長和發(fā)育過程中發(fā)揮重要作用，microRNA參與體內(nèi)許多重要腫瘤相關(guān)基因的表達，調(diào)控著細胞分化、凋亡及增殖，microRNA表達失調(diào)與腫瘤發(fā)生密切相關(guān)[4-5]。我們前期microRNA芯片結(jié)果顯示在哈薩克族食管癌發(fā)生發(fā)展過程中miR-143表達發(fā)生了改變，因此我們隨機選用30 例哈薩克族食管癌組織及癌旁組織，采用熒光定量PCR檢測miR-143的表達以驗證microRNA芯片的準確性，并分析其臨床病理意義。

miR-143是人類細胞中存在較為廣泛的一種microRNA，目前報道在直腸癌、膀胱癌、宮頸癌[6-8]等人類眾多惡性腫瘤標本及腫瘤細胞系中miR-143低表達，其低表達可以促進腫瘤的發(fā)生。王勇等[9]研究發(fā)現(xiàn)在肝外膽管癌中miR-143呈低表達，miR-143質(zhì)粒轉(zhuǎn)染膽管癌細胞株QBC939后發(fā)現(xiàn)膽管癌細胞阻滯于G1期、細胞凋亡增加、細胞生長受到抑制，提示miR-143可能與膽管癌發(fā)生相關(guān)。本研究結(jié)果與此基本相符，在哈薩克族食管癌組織中miR-143表達明顯下調(diào)，與遠端癌旁組織相比，其表達水平僅為癌旁組織水平的1/3，且其表達與分化程度、臨床分期、淋巴轉(zhuǎn)移相關(guān)，在低分化、有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的腫瘤組織中miR-143表達顯著低于高分化、無淋巴轉(zhuǎn)移的癌組織，隨著臨床病程的進展，miR-143表達呈現(xiàn)下調(diào)趨勢，以上實驗結(jié)果提示miR-143表達下調(diào)參與了哈薩克族食管癌的分化及侵襲轉(zhuǎn)移的生物學(xué)進程。

MicroRNA通過對靶基因的表達調(diào)控而發(fā)揮作用，因此我們對顯著下調(diào)的miR-143進行靶點預(yù)測，以求進一步認識其與哈薩克族食管癌發(fā)生的關(guān)系。結(jié)果表明，miR-143的靶基因包括凋亡相關(guān)基因BCL-2、腫瘤轉(zhuǎn)移相關(guān)基因TIMP-1、MMP-2等。MMPs是一類結(jié)構(gòu)具有同源性、活性依賴鋅離子的蛋白水解酶，由纖維母細胞、中性粒細胞、巨噬細胞及腫瘤細胞分泌，在腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程中MMPs降解細胞外基質(zhì)成分，調(diào)控腫瘤新生血管形成，影響細胞黏附分子的功能以及腫瘤細胞的生長[10-11]?；|(zhì)金屬蛋白酶抑制因子(TIMPs)是一類多基因家族的編碼蛋白，是MMPs的天然抑制劑，目前已知的TIMPs主要有4種，分別為TIMP-1~TIMP-4[12-13]。在30例哈薩克族食管癌標本中我們檢測了MMP-2和TIMP-1的表達，結(jié)果顯示在腫瘤組織中MMP-2和TIMP-1的表達均顯著高于正常組織，而TIMP-1高表達與MMP-2表達正相關(guān)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，提示MMP-2和TIMP-1表達上調(diào)共同參與了哈薩克族食管癌的發(fā)生發(fā)展過程。 在30例癌組織中，MMP-2 的表達與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移顯著相關(guān)(P< 0.05)，在有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的腫瘤組織中MMP-2 的表達顯著高于淋巴結(jié)未轉(zhuǎn)移的腫瘤組織，提示MMP-2可能是哈薩克族食管癌發(fā)生侵襲、轉(zhuǎn)移的主導(dǎo)因素。MMP-2 過度表達有利于細胞外基質(zhì)的分解，使腫瘤向深層浸潤并突破血管和淋巴管，促進血管生成，造成血行和淋巴轉(zhuǎn)移。在本試驗中TIMP-1在哈薩克族食管癌組織中表達上調(diào)，但TIMP-1表達與腫瘤分化、轉(zhuǎn)移及臨床分期均無明顯相關(guān)性，而TIMP-1高表達與MMP-2表達高度相關(guān)，推測在哈薩克族食管癌發(fā)病過程中，隨著MMPs表達失調(diào)，TIMP-I表達上調(diào)可能發(fā)揮保護作用即抑制腫瘤細胞的侵襲和轉(zhuǎn)移。相關(guān)性分析顯示，在30例哈薩克族食管癌組織中miR-143與MMP-2、TIMP-I的表達負相關(guān)，提示miR-143表達下調(diào)與MMP-2和TIMP-1表達上調(diào)具有關(guān)聯(lián)，MMP-2和TIMP-1作為miR-143預(yù)測靶基因，其具體的調(diào)控機制有待于我們在今后的試驗中進一步探討。

綜上所述，在哈薩克族食管癌組織中miR-143表達下調(diào)，與前期芯片實驗結(jié)果相符。且miR-143低表達與MMP-2和TIMP-1高表達負相關(guān)，提示miR-143與MMP-2和TIMP-1表達失調(diào)共同發(fā)揮作用，參與食管癌發(fā)生發(fā)展過程。系統(tǒng)篩查micoRNA表達譜、鑒定micoRNA靶基因?qū)μ剿鱩icoRNA在腫瘤發(fā)生發(fā)展中所發(fā)揮的重要作用，揭示micoRNA在基因表達調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中的功能具有重要意義。

參考文獻

[1] 張月明. 新疆食管癌的分布[J]. 新疆醫(yī)學(xué)院學(xué)報，1988，11(2)：139-144．

[2] Varnholt H. The role of microRNAs in primary liver cancer[J]. Ann Hepatol，2008，7(2)：104-113.

[3] 李秀梅，陳 艷，王洪江，等. 哈薩克族食管癌中MMP-1、MMP-2、MMP-7、TIMP-1和MTA1的表達及其臨床病理意義[J]. 癌 變·畸變·突變，2011，23(3)：190-198.

[4] Nehad MA，Michelle L，Emma I，et al. miR-218 suppresses nasopharyngeal cancer progression through down regulation of survivin and the SLIT2-ROBO1 pathway[J]. Cancer Res，2011，71(6)：381-2391.

[5] Ozen M，Creighton CJ，Ozdemir M. Wide spread deregulation of microRNA expression in human prostate cancer[J]．Oncogene，2008，27(12)：1788-1793.

[6] Chen X，Guo X，Zhang H. Role of miR-143 targeting KRAS in colorectal tumorigenesis[J]. Oncogene，2009，28(10)：1385-1392.

[7] 李鵬超，陶 俊，呂 強，等. MiR-143在膀胱移行細胞癌中的表達和功能[J]. 南京醫(yī)科大學(xué)學(xué)報：自然科學(xué)版，2010，30(9)：1235-1239.

[8] Takagi T，Iio A，Nakagawa Y. Decreased expression of microRNA-143 and-145 in human gastric cancers[J]. Oncology，2009，77(1)：12-21.

[9] 王 勇，孫躍明. microRNA143、microRNA145對膽管癌細胞株 QBC939生長周期及凋亡的影響[J]. 南京醫(yī)科大學(xué)學(xué)報，2010，30(5)：612-616.

[10] REN Ye，GUO Fengjing，CHEN Anmin，et al. Involvement of MMP-2 in adriamycin resistance dependent on ERK1/2 signal pathway in human osteosarcoma MG-63 cells[J]. J Huazhong U Sci-Med，2012，32(1)：82-86.

[11] 朱慧芳，左學(xué)軍，雷 鳴，等. MMP-2、TIMP-2和CD44V6基因蛋白在卵巢漿液性腫瘤中的表達及臨床意義[J]. 中國婦幼保健醫(yī)院，2011，2(22)：3470-3472.

[12] Jung YS，Liu XW，Chirco R，et al. TIMP-1 induces an EMT-like phenotypic conversion in MDCK cells independent of its MMP-inhibitory domain[J]. PLoS One，2012，7(6)：38773-38779.

[13] Wang Yunyan，Meng Junsong，Zhuang Haijun，et al. Expressions and clinical significances of MMP-2 and TIMP-2 mRNA in bladder transitional cell carcinomas[J]. Chin Germ J Clin Oncol，2011，10(5)：278-281.

基金項目：新疆維吾爾自治區(qū)科技廳地方病分子生物學(xué)實驗室開放課題(XJDX0208-2012-02)

收稿日期：2014-11-29；

修訂日期：2015-10-23

中圖分類號：R734.2

文獻標志碼：A

文章編號：1004-616X(2016)01-0032-05

doi:1 0.3969/j.issn.1004-616x.2016.01.007