酶分子穩(wěn)定性改造研究進(jìn)展

馮旭東，呂波，李春

（北京理工大學(xué)生命學(xué)院，北京 100081）

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酶分子穩(wěn)定性改造研究進(jìn)展

馮旭東，呂波，李春

（北京理工大學(xué)生命學(xué)院，北京 100081）

摘要：酶催化轉(zhuǎn)化在食品、醫(yī)藥和精細(xì)化工等領(lǐng)域起著越來越重要的作用。然而，目前大多數(shù)酶反應(yīng)需要在較溫和的條件下進(jìn)行以維持其正?；钚?，而在實(shí)際應(yīng)用的逆境中（如高熱、高酸、高鹽等），酶的耐受性卻較差、容易失活從而導(dǎo)致反應(yīng)效率下降，極大地限制了其推廣和應(yīng)用。因此，對(duì)酶分子進(jìn)行抗逆改造以提高其穩(wěn)定性和催化活性，是當(dāng)前研究的熱點(diǎn)也是難點(diǎn)。本文從化學(xué)修飾和分子改造兩個(gè)方面總結(jié)了酶分子穩(wěn)定性改造的新進(jìn)展，從定向進(jìn)化、半理性設(shè)計(jì)、理性設(shè)計(jì)和糖基化修飾4個(gè)角度重點(diǎn)闡述了分子改造提高酶穩(wěn)定性的方法，重點(diǎn)介紹了糖基化作為一種新的酶分子穩(wěn)定性改造技術(shù)的思路。

關(guān)鍵詞：生物化工；生物催化；酶；穩(wěn)定性；分子改造；糖基化

2015-06-30收到初稿，2015-09-24收到修改稿。

聯(lián)系人：李春。第一作者：馮旭東（1985—），男，博士研究生，講師。

Received date: 2015-06-30.

引 言

生物轉(zhuǎn)化是生物化工過程的核心技術(shù)之一，其中酶催化轉(zhuǎn)化是生物轉(zhuǎn)化的重要組成部分。酶分子是由活細(xì)胞產(chǎn)生的一種具有特殊催化功能的生物大分子，其高效性與專一性是其他化學(xué)催化劑所無法比擬的優(yōu)勢(shì)，因此其在食品、醫(yī)藥和精細(xì)化工等領(lǐng)域起著越來越重要的作用[1]。然而，目前大多數(shù)酶反應(yīng)需要在較溫和的條件下進(jìn)行以維持其正?；钚?，而在實(shí)際應(yīng)用的逆境中(如高熱、高酸、高鹽等)，酶的耐受性卻較差；容易失活從而導(dǎo)致反應(yīng)效率下降，極大地限制了其推廣和應(yīng)用。因此，對(duì)酶分子進(jìn)行抗逆改造以提高其穩(wěn)定性和催化活性，是當(dāng)前研究的熱點(diǎn)也是難點(diǎn)。本文從化學(xué)修飾以及分子改造兩個(gè)方面總結(jié)了酶分子穩(wěn)定性改造的最新進(jìn)展并展望了其未來的發(fā)展方向（圖1）。

圖1 化學(xué)修飾、分子改造以及糖基化改造酶分子穩(wěn)定性Fig.1 Engineering enzyme stability through chemical modification, molecular modification and glycosylation

1 化學(xué)修飾

在分子生物學(xué)技術(shù)興起之前，化學(xué)修飾是提高酶穩(wěn)定性的最重要方法之一[2]，其中應(yīng)用最廣泛的修飾劑是聚乙二醇（PEG）。PEG修飾法最早是在1985年由Veronese等提出[3]，PEG主要與酶分子的巰基、α-氨基、ε-氨基、羧基以及羥基等基團(tuán)進(jìn)行反應(yīng)[4]，其原理目前普遍認(rèn)為是PEG的兩親性可以提高酶分子的構(gòu)象動(dòng)力學(xué)從而提高其在高溫、有機(jī)溶劑等逆境下的穩(wěn)定性[5-6]。近些年也逐漸發(fā)展了其他的化學(xué)修飾方法。Inouye等[7]分別用2, 4, 6-三硝基苯磺酸，2, 4-二甲氧基聚乙二醇-6-氯-三嗪，以及戊二醛對(duì)小麥β-淀粉酶的氨基進(jìn)行修飾，最終使其耐熱溫度提高了1～8℃，熱力學(xué)性質(zhì)分析表明酶穩(wěn)定性的提高主要是熵驅(qū)動(dòng)。Ismaya等[8]發(fā)現(xiàn)用非極性的酸酐修飾α-淀粉酶可以將其穩(wěn)定性提高18倍，用親水性的PEG修飾可以提高α-淀粉酶對(duì)EDTA和胰蛋白酶的抗性。離子液體修飾也可以提高酶的穩(wěn)定性，Iborra等[9]用[btma][NTf2]或[toma][NTf2]修飾脂肪酶CALB，其在正己烷以及95℃高溫下的穩(wěn)定性均顯著提高，構(gòu)象分析表明離子液體有利于維持酶分子二級(jí)結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性。酶的固定化通常可以提高酶分子構(gòu)象的剛性從而提高其熱穩(wěn)定性[10]。隨著納米技術(shù)的興起，將酶固定在納米材料上形成的納米酶成為了研究的熱點(diǎn)[11]。Ge等[12]通過向酶的磷酸鹽緩沖液中加入硫酸銅制備出了雜化納米花結(jié)構(gòu)，而酶被包埋在了納米花結(jié)構(gòu)中，其穩(wěn)定性較游離酶有了大幅度提高。但是不適當(dāng)?shù)幕瘜W(xué)修飾也會(huì)降低酶的穩(wěn)定性，如van der Veen等[13]用琥珀?；揎椚芫负?，其熱穩(wěn)定性反而有所下降，溶解溫度降低了16.5℃，原因主要是由于琥珀酰基疏水基團(tuán)的暴露降低了溶菌酶構(gòu)象的穩(wěn)定性。因此，化學(xué)修飾沒有普適性的標(biāo)準(zhǔn)，需要根據(jù)酶的特性以及需求來選擇合適的化學(xué)試劑及修飾方法。另外，化學(xué)修飾經(jīng)常伴隨著酶活性的損失，其對(duì)每批的酶分子都要進(jìn)行修飾，不同批次之間存在著差異性。上述缺點(diǎn)限制了該方法在酶分子穩(wěn)定性改造中的應(yīng)用，如何解決這些問題將是化學(xué)修飾今后的研究重點(diǎn)。除了化學(xué)修飾，以遺傳學(xué)操作為基礎(chǔ)的分子改造技術(shù)是另外一種提高酶分子穩(wěn)定性的重要方法。

2 分子改造

2.1 定向進(jìn)化

定向進(jìn)化通過模擬自然進(jìn)化機(jī)制（隨機(jī)突變、重組和自然選擇），以改進(jìn)的誘變技術(shù)結(jié)合確定進(jìn)化方向的選擇方法，在體外改造基因，定向選擇有價(jià)值的非天然蛋白分子獲得某性能優(yōu)化的突變體[14-15]。定向進(jìn)化主要包括建立突變文庫(kù)、選擇合適的表達(dá)體系以及建立快速、有效的高通量篩選方法3個(gè)關(guān)鍵步驟[16]。在建立突變體文庫(kù)方面，為了得到分子多樣性最廣泛采用的方法有隨機(jī)突變的易錯(cuò)PCR 和DNA改組技術(shù)[17]。定向進(jìn)化的最大優(yōu)點(diǎn)是不需事先了解蛋白分子的空間結(jié)構(gòu)和機(jī)制就可以獲得滿足需要的突變體。一個(gè)經(jīng)典的例子是在1996年，Moore等[18]通過4輪易錯(cuò)PCR的定向進(jìn)化將p-硝基芐基酯酶在25%二甲基甲酰胺中的活性提高了50～60倍。Ogino等[19]利用易錯(cuò)PCR的定向進(jìn)化方法將BPO-A1 過氧化氫酶的熱穩(wěn)定性提高了5倍。上述的定向進(jìn)化是在原核生物中進(jìn)行的，最近也有報(bào)道在真核生物中進(jìn)行定向進(jìn)化來提高酶的穩(wěn)定性。Xu等[20]用2輪的易錯(cuò) PCR和2輪的DNA改組技術(shù)提高了在畢赤酵母中表達(dá)的脂肪酶的熱穩(wěn)定性，其溶解溫度提高了22℃，在60℃下的熱穩(wěn)定性提高了46倍。Zhao等[21]提出了定向進(jìn)化和定點(diǎn)飽和突變相結(jié)合的方法提高酶的熱穩(wěn)定性，首先用易錯(cuò)PCR構(gòu)建了含有3000個(gè)突變體的文庫(kù)，在65℃下篩選到了7個(gè)熱穩(wěn)定性提高的單點(diǎn)突變體，接著通過組合飽和突變獲得了四點(diǎn)突變體，其熱穩(wěn)定性較野生型提高了24.7倍。利用相同的思路，Yu等[22]將還原酶CgKR1溶解溫度提高了12℃。Hatada等[23]通過定向進(jìn)化的隨機(jī)突變確定了對(duì)呋喃果糖苷酶熱穩(wěn)定性有影響的5個(gè)氨基酸位點(diǎn)，接著對(duì)其進(jìn)行迭代飽和突變，最后獲得的突變體在65℃下的半衰期提高了16.5倍。盡管定向進(jìn)化被廣泛應(yīng)用到了酶穩(wěn)定性改造并取得了很大的成功，但由于其構(gòu)建的文庫(kù)中突變體數(shù)量太多，篩選過程成為了一項(xiàng)非常龐雜的工作，而得到的絕大多數(shù)突變體性質(zhì)卻沒有改進(jìn)。隨著越來越多的酶晶體結(jié)構(gòu)得到解析，學(xué)者逐漸發(fā)展了結(jié)合酶晶體結(jié)構(gòu)以及催化特性的半理性以及理性的改造方法[24]。

2.2 半理性設(shè)計(jì)

半理性設(shè)計(jì)以對(duì)酶分子結(jié)構(gòu)與功能有一定的理解為基礎(chǔ)，將目標(biāo)集中在少量的位點(diǎn)上，與定向進(jìn)化相比，其優(yōu)勢(shì)在于突變體文庫(kù)較小，不需要高通量的篩選方法，更容易獲得正向突變結(jié)果。半理性設(shè)計(jì)組合方法多變，主要策略有：基于蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)分析，對(duì)特定位點(diǎn)隨機(jī)突變；針對(duì)特定位點(diǎn)，結(jié)合隨機(jī)突變與點(diǎn)飽和突變進(jìn)行改造；針對(duì)特定位點(diǎn)，先進(jìn)行隨機(jī)突變?cè)冱c(diǎn)飽和突變；結(jié)合計(jì)算輔助的半理性設(shè)計(jì)。

2.2.1 提高蛋白質(zhì)柔性區(qū)域的剛性 酶分子的穩(wěn)定性主要取決于其構(gòu)象的剛性，統(tǒng)計(jì)學(xué)表明蛋白質(zhì)的剛性越強(qiáng)其抗逆性也越強(qiáng)，因此，學(xué)者提出對(duì)酶分子的柔性區(qū)域進(jìn)行剛性增強(qiáng)的改造來提高其穩(wěn)定性，其中，連接主要二級(jí)結(jié)構(gòu)（α-螺旋和β-折疊）的位于酶蛋白表面的loop具有很大的柔性，引起了廣泛關(guān)注[25]。例如，Rao等[26]對(duì)枯草芽孢桿菌脂肪酶表面所有l(wèi)oop的91個(gè)氨基酸進(jìn)行了定點(diǎn)飽和突變，鑒定出了6個(gè)位點(diǎn)對(duì)脂肪酶穩(wěn)定性有關(guān)鍵影響，最終得到的6點(diǎn)突變體在DMSO中的耐受性提高了3倍。除了表面的loop，蛋白質(zhì)的N和C端也是柔性較高的區(qū)域，這也是蛋白質(zhì)晶體衍射時(shí)，經(jīng)常有N和C端氨基酸序列丟失的主要原因，因此對(duì)該區(qū)域進(jìn)行改造經(jīng)?？梢蕴岣呙傅姆€(wěn)定性[25]。Gilbert 等[27]通過定向進(jìn)化結(jié)合定點(diǎn)飽和突變得到了含有7個(gè)突變位點(diǎn)的木聚糖酶，其溶解溫度較野生型提高了25℃，有趣的是7個(gè)位點(diǎn)全部位于酶分子的N端。Sylvestre等[28]發(fā)現(xiàn)將木聚糖酶N端的29、31、43 和58位的氨基酸突變后，其熱穩(wěn)定性較野生型提高了30倍，見圖2。

2.2.2 增強(qiáng)亞基間的相互作用 對(duì)于多亞基酶來講，亞基間是通過范德華力、氫鍵以及靜電等非共價(jià)作用連接從而保持酶分子整體構(gòu)象的穩(wěn)定性，這些作用力較弱，在逆境下容易被破壞，成為酶分子變性的重要原因。因此，通過強(qiáng)化亞基界面的相互作用而提高多亞基酶的穩(wěn)定性成為了一種新思路。Bechtold等[29]通過系統(tǒng)的亞基界面作用的優(yōu)化提高了D-塔格糖異構(gòu)酶（PcDTE）的穩(wěn)定性（圖3）。PcDTE是同源二聚體，作者通過分析亞基界面間的氨基酸，得到了31個(gè)潛在的對(duì)酶分子構(gòu)象有影響的突變位點(diǎn)，接著對(duì)這些位點(diǎn)進(jìn)行了迭代飽和突變，最終得到的9位點(diǎn)突變體，其半衰期較野生型提高了80多倍，構(gòu)象分析表明穩(wěn)定性提高的主要原因是突變后的氨基酸與相鄰的亞基間形成了更多的氫鍵作用。

圖2 木聚糖酶突變體N端的 Ala-29, Leu-31, Phe-43和Ile-58 通過與C端的疏水作用提高了酶分子的熱穩(wěn)定性[28]Fig.2 Ala-29, Leu-31, Phe-43, and Ile-58 at N-terminal of xylanase mutants established hydrophobic interaction with C-terminal to enhance thermostability[28]

2.2.3 基于B-factor的半理性設(shè)計(jì) B-factor是半理性改造酶穩(wěn)定性的一個(gè)重要依據(jù)，它反映一個(gè)氨基酸在整個(gè)酶分子中的柔性，B-factor值越大，柔性也越大，不利于酶的穩(wěn)定性，因此可以選擇B-factor值較大的氨基酸進(jìn)行飽和突變，減弱其柔性，從而得到抗逆性強(qiáng)的酶突變體[30-31]。Reetz等[30]找到了脂肪酶LipA的B-factor值最高的10個(gè)氨基酸位點(diǎn)，通過對(duì)這些位點(diǎn)進(jìn)行5輪的迭代飽和突變，將其在55℃的熱穩(wěn)定性提高了450多倍。Zhao等[32]對(duì)脂肪酶YlLip2的6個(gè)B-factor值最高的氨基酸位點(diǎn)進(jìn)行迭代飽和突變，得到了兩個(gè)陽(yáng)性突變體，其耐熱性的半衰期提高了2～5倍。需要注意的是，一般的B-factor值是通過酶分子的晶體結(jié)構(gòu)得到的，而酶在溶液中的柔性要大于其晶體狀態(tài)，因此，通過B-factor值進(jìn)行酶穩(wěn)定性改造時(shí)需要考慮到介質(zhì)對(duì)酶蛋白構(gòu)象的影響[33]。相應(yīng)發(fā)現(xiàn)不同具有高穩(wěn)定性的酶，其維持穩(wěn)定性的機(jī)制不斷被了解，使得采用理性設(shè)計(jì)對(duì)酶分子進(jìn)行改造以提高其穩(wěn)定性變得越來越具有理論意義。目前應(yīng)用較為廣泛的理性設(shè)計(jì)方法主要有：同源比對(duì)的策略，蛋白質(zhì)表面電荷的優(yōu)化策略，基于二硫鍵的設(shè)計(jì)策略，脯氨酸效應(yīng)的設(shè)計(jì)策略，基于蛋白質(zhì)解折疊自由能的設(shè)計(jì)策略等。

2.3 理性設(shè)計(jì)

理性設(shè)計(jì)是在對(duì)酶蛋白結(jié)構(gòu)與功能深刻認(rèn)識(shí)的基礎(chǔ)上，以定點(diǎn)突變技術(shù)和定點(diǎn)飽和突變技術(shù)為主的，對(duì)酶分子進(jìn)行改造的方法。隨著研究的深入，

圖3 D-塔格糖3-差向異構(gòu)酶PcDTE的同源二聚體結(jié)構(gòu) (a)；PcDTE單聚體界面的10個(gè)高度保留氨基酸 (b)；PcDTE單聚體界面的對(duì)熱穩(wěn)定性有顯著影響的9個(gè)氨基酸(c)[29]Fig.3 Dimer structure of PcDTE (a); ten highly conserved residues at PcDTE interface (b); and mutation of nine critical residues at PcDTE interface can significantly improve thermostability (c)[29]

2.3.1 同源比對(duì) 研究發(fā)現(xiàn)，中溫酶與其同家族嗜熱酶之間往往具有較高的同源性，因此，可以通過與熱穩(wěn)定性高的同源蛋白質(zhì)比對(duì)序列，找出與熱穩(wěn)定性相關(guān)的氨基酸位點(diǎn)，然后對(duì)其進(jìn)行突變，進(jìn)而可以提高中溫酶的穩(wěn)定性[34]。Lau等[35]將嗜溫性果膠酸酯裂解酶和4個(gè)同源耐熱酶進(jìn)行氨基酸序列比對(duì)，發(fā)現(xiàn)了9個(gè)潛在特異性顯著的位點(diǎn)，以耐熱酶為模板進(jìn)行了定點(diǎn)突變，最終得到的突變體溶解溫度提高了6℃，見圖4。利用類似的方法，Bejar等[36]通過理性分析只對(duì)淀粉酶MAUS149的兩個(gè)關(guān)鍵點(diǎn)進(jìn)行定點(diǎn)突變，將其在55℃下的半衰期提高了15～25 min。

2.3.2 基于蛋白質(zhì)構(gòu)象的理性設(shè)計(jì) 除了定點(diǎn)突變，也有對(duì)酶分子柔性loop進(jìn)行理性截短、截除或替換操作從而提高穩(wěn)定性的報(bào)道。Hauer等[37]對(duì)NCR還原酶的結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析，得到B-factor值較高的loop，將其中的4個(gè)氨基酸截除，突變酶在45℃的酶活較野生型提高了84.6%，在有機(jī)溶劑2-甲基-2-戊烯醛的耐受性提高了54.1%。Iwasaki等[38]通過對(duì)磷脂酶D結(jié)構(gòu)的分析，找到了一個(gè)高度柔性的位于酶分子表面的loop，將該loop整個(gè)截除后，突變酶在70℃ 的熱穩(wěn)定性提高了11.7倍，模擬分析表明，loop環(huán)的截除有利于提高酶分子的構(gòu)象穩(wěn)定性，見圖5。Bornscheuer等[39]發(fā)現(xiàn)loop替換也可以提高酶分子的穩(wěn)定性，作者將嗜溫性酯酶BsteE的“cap區(qū)域”與其同源的嗜熱酯酶BsubE的相應(yīng)區(qū)域進(jìn)行對(duì)調(diào)，將BsteE的溶解溫度提高了4℃。

圖4 通過嗜溫性果膠酸酯裂解酶NP_638163和4個(gè)同源耐熱酶的氨基酸序列比對(duì)確定對(duì)其熱穩(wěn)定性有顯著影響的突變體[35]Fig.4 Multiple sequence alignment of pectate lyases with its thermophilic counterparts[35]

圖5 通過截除磷脂酶D表面的loop提高酶分子熱穩(wěn)定性[38]Fig.5 Deletion of dynamic surface loop improves thermostability of phospholipase D[38]

2.3.3 基于計(jì)算機(jī)模擬的理性設(shè)計(jì) 上述的理性設(shè)計(jì)通常需要對(duì)酶分子的構(gòu)象有較為深刻的認(rèn)識(shí)，盡管隨著X射線晶體衍射技術(shù)的進(jìn)步，越來越多的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)被解析出來，但是其總數(shù)量仍然很少，這大大限制了理性改造的進(jìn)一步發(fā)展。近些年，計(jì)算機(jī)模擬技術(shù)的發(fā)展很好地彌補(bǔ)了這一不足，在研究某個(gè)目標(biāo)蛋白時(shí)，即使沒有其立體結(jié)構(gòu)的信息，也可以同源結(jié)構(gòu)為模板，借助分子模擬技術(shù)預(yù)測(cè)其結(jié)構(gòu)，已經(jīng)逐漸應(yīng)用到酶分子的理性改造中[40]。Wu 等[41 ]通過分子動(dòng)力學(xué)模擬了嗜溫性木聚糖酶AoXyn11A和其同源嗜熱酶EvXyn11TS的立體結(jié)構(gòu)，接著比較了兩者B-factor值差異較大的N端31個(gè)氨基酸，將EvXyn11TS的N端替換到AoXyn11A中，通過分子動(dòng)力學(xué)模擬得到改造后的AoXyn11A能量從-611.2 減少到了-663.2 kJ·mmol-1，證明了其構(gòu)象更加穩(wěn)定，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明改造后的AoXyn11A在70℃的酶活提高了197倍, 見圖6。Wu等[42]通過計(jì)算甲基硝苯硫磷酯水解酶所有位點(diǎn)突變后的熵值和去折疊自由能，以其為依據(jù)，得到了7個(gè)潛在的對(duì)酶分子熱穩(wěn)定性有影響的突變位點(diǎn)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，其中6個(gè)位點(diǎn)的突變可以提高酶的熱穩(wěn)定性，其溶解溫度最多提高了11.7℃。

圖6 通過分子動(dòng)力學(xué)模擬研究?jī)煞N熱穩(wěn)定性不同的木聚糖酶EvXyn11TS和AoXyn11A的B-factor[41]Fig.6 B-factors of amino acid residues of EvXyn11TSand AoXyn11A after a 15 ns MD simulation process at temperature of 300 K[41]

2.3.4 引入外源作用力的理性設(shè)計(jì) 除了通過遺傳學(xué)操作改變酶分子自身的氨基酸或loop的組成改變其空間結(jié)構(gòu)，也可以引入外源的分子或作用力穩(wěn)定酶分子的構(gòu)象從而提高其穩(wěn)定性。例如，自聚集兩性肽（SAPs）同時(shí)含有一定數(shù)量的親水性和疏水性的氨基酸，其可以自發(fā)地形成規(guī)則的納米結(jié)構(gòu)，Chen等[43]向脂氧化酶的N端融合6種不同的SAPs，使其在50℃下的熱穩(wěn)定性提高了2.3～4.5倍，比酶活提高了1～2.8倍。向酶分子引入剛性較強(qiáng)的氨基酸也可以提高其穩(wěn)定性，其中最重要的是脯氨酸法。脯氨酸包含一個(gè)亞氨基、一個(gè)羧基及一個(gè)吡咯烷環(huán)側(cè)鏈，由于自身吡咯烷環(huán)的束縛，脯氨酸具有更小的構(gòu)象自由度，可以減少酶分子構(gòu)象在變性狀態(tài)下的熵值，因此在酶分子柔性區(qū)域引入脯氨酸提高酶穩(wěn)定性，成為了理性改造提高酶分子穩(wěn)定性的重要手段[44]。湯恒等[45]對(duì)重組產(chǎn)紫青霉β-葡萄糖醛酸苷酶280位的甘氨酸突變?yōu)楦彼?，使其?0 °C下的熱穩(wěn)定性提高了5倍。最近，Liu等[46]發(fā)現(xiàn)向α-淀粉酶的表面引入精氨酸也可以提高其熱穩(wěn)定性。

靜電作用是維持酶分子構(gòu)象穩(wěn)定性的重要作用之一，因此在酶分子合適區(qū)域引入鹽橋也可以提高酶的穩(wěn)定性。Yu等[47]系統(tǒng)地研究了在不同區(qū)域引入鹽橋?qū)﹄嫠厦笩岱€(wěn)定性的影響。作者找到了3個(gè)柔性較大的區(qū)域：近活性中心、表面loop以及C末端，接著分別向這3個(gè)區(qū)域引入鹽橋，其中只有在C末端引入的鹽橋使酶分子的熱穩(wěn)定性提高了160%、在超聲波中的穩(wěn)定性提高了75%。Hwang 等[48]通過B-factor指標(biāo)，在葡萄糖苷酶的表面找到潛在的帶同種電荷的氨基酸，將其突變成帶相反電荷的氨基酸從而和相鄰氨基酸形成鹽橋，利用這種方法，共引入了6對(duì)鹽橋，酶分子的溶解溫度提高了0.6～8.8℃。二硫鍵對(duì)于維持大部分蛋白質(zhì)的功能和穩(wěn)定性起著重要的作用[49]，因此，在酶分子合適區(qū)域引入二硫鍵也可以提高其構(gòu)象穩(wěn)定性[50]。Zhang等[51]向纖維素酶C的由56個(gè)氨基酸組成的柔性亞結(jié)構(gòu)域引入了二硫鍵交聯(lián)，使其在65℃下的半衰期提高了5.8倍。Wu等[52]通過分子動(dòng)力學(xué)模擬確定了A型阿魏酸酯酶穩(wěn)定性較差的氨基酸位點(diǎn)，結(jié)合軟件分析考慮這些潛在位點(diǎn)的物理化學(xué)性質(zhì)，從而提高二硫鍵的引入概率，最終找到了一對(duì)位點(diǎn)A126-N152，將其突變?yōu)榘腚装彼嵋攵蜴I，將其熱穩(wěn)定性提高了10倍。

2.4 糖基化

糖基化是蛋白質(zhì)翻譯后的一種重要的加工過程，根據(jù)蛋白質(zhì)與糖鏈連接類型的不同，糖基化主要分為N-糖基化和O-糖基化[53]。其中，N-糖基化修飾的糖鏈連接在Asn-X-Ser/Thr結(jié)構(gòu)的（X-脯氨酸外的任意一種氨基酸）天冬酰胺側(cè)鏈的酰胺基上[54]。N-糖基化是最普遍、最重要的糖基化方式，生物信息學(xué)分析表明多于一半的真核蛋白都是糖蛋白，且多數(shù)為N-糖蛋白[55]。大量研究表明糖基化對(duì)酶的穩(wěn)定性有很大的影響。Fonseca-Maldonado等[56]研究了糖基化對(duì)P. pastoris中重組表達(dá)的木聚糖酶熱穩(wěn)定性的影響，通過質(zhì)譜分析確定了4個(gè)糖基化位點(diǎn)，結(jié)果表明糖基化的去除會(huì)使木聚糖酶的耐熱性降低至1/172，并且糖基化位點(diǎn)比糖鏈對(duì)熱穩(wěn)定性的影響更大。Li等[57-58]研究了N-糖基化對(duì)重組的β-葡萄糖醛酸苷酶的活性以及生化特性的影響。用酶解法完全水解掉糖基后，β-葡萄糖醛酸苷酶的熱穩(wěn)定性降低了15%～45%，另外，去糖基化對(duì)酶分子的二級(jí)結(jié)構(gòu)沒有顯著的影響，但是會(huì)促進(jìn)熱變性過程中酶的聚集，增加其柔性，從而導(dǎo)致其不可逆變性。Wu等[59]發(fā)現(xiàn)當(dāng)把P. pastoris表達(dá)的TI脂肪酶33位的糖基去除后，其耐熱性降低了80%。Zheng 等[60]將彈性蛋白酶在P. pastoris中重組表達(dá)進(jìn)行糖基化修飾，其熱穩(wěn)定性有了顯著的提高，在70℃半衰期提高了40%。酶蛋白的空間結(jié)構(gòu)決定了其功能，因此糖基化提高酶穩(wěn)定性的機(jī)理主要在于其對(duì)酶蛋白結(jié)構(gòu)方面的穩(wěn)定作用。一般認(rèn)為，糖基化可以減少蛋白質(zhì)的聚集，有利于其正確折疊，增加蛋白質(zhì)的剛性從而提高其穩(wěn)定性。Shental-Bechor等[61]研究了糖基化對(duì)蛋白質(zhì)SH3 domain折疊的影響，證明糖基化可以減少蛋白質(zhì)在伸展?fàn)顟B(tài)的穩(wěn)定性，從而有利于蛋白質(zhì)的折疊并提高其折疊后的熱力學(xué)穩(wěn)定性。然而，生物體內(nèi)自發(fā)的糖基化隨機(jī)性較強(qiáng)，大多數(shù)糖基化不能處于穩(wěn)定酶分子構(gòu)象的最佳位點(diǎn)，導(dǎo)致其對(duì)酶分子穩(wěn)定性的提升作用不顯著，甚至不合適的糖基化還會(huì)降低酶的穩(wěn)定性，大大限制了其應(yīng)用[62-63]。鑒于此，有學(xué)者提出人工引入糖基化提高酶穩(wěn)定性的思路。Han等[64]以畢赤酵母為底盤宿主向彈性蛋白酶的36和264位點(diǎn)人工引入了糖基化，其中264位的糖基化使酶在65℃下的半衰期延長(zhǎng)了3.7 min，而36位的糖基化反而降低了8 min。由此可見，人工引入糖基化確實(shí)可以提高酶的穩(wěn)定性，但糖基化位點(diǎn)需要謹(jǐn)慎選擇。目前，國(guó)內(nèi)外在這方面均處于剛起步，具有較大的發(fā)展空間。

3 結(jié)論與展望

目前對(duì)酶分子的穩(wěn)定性改造主要集中在耐熱性和耐有機(jī)溶劑等方面?；瘜W(xué)法修飾可以在一定程度上提高酶的穩(wěn)定性，但經(jīng)常伴隨著酶活性的損失，并對(duì)每批的酶分子都要進(jìn)行修飾，不同批次之間存在著差異性的問題，解決上述問題是化學(xué)修飾今后的研究重點(diǎn)。分子改造中，由于定向進(jìn)化的工作量較大以及篩選困難，半理性以及理性設(shè)計(jì)是未來的發(fā)展方向，因此如何結(jié)合酶分子晶體結(jié)構(gòu)以及計(jì)算機(jī)輔助模擬來理性設(shè)計(jì)突變策略在不影響酶活的條件下有效提高酶穩(wěn)定性是今后研究的重點(diǎn)。糖基化是調(diào)節(jié)酶穩(wěn)定性的一種有效手段，但是目前對(duì)糖基化影響酶構(gòu)象機(jī)理的研究還不徹底，如何能夠理性地設(shè)計(jì)位點(diǎn)引入糖基化是今后的研究重點(diǎn)。

References

[1] BORNSCHEUER U T, HUISMAN G W, KAZLAUSKAS R J, et al. Engineering the third wave of biocatalysis [J]. Nature, 2012, 485 (7397): 185-194.

[2] STEPANKOVA V, BIDMANOVA S, KOUDELAKOVA T, et al. Strategies for stabilization of enzymes in organic solvents [J]. ACS Catalysis, 2013, 3 (12): 2823-2836.

[3] VERONESE F M, LARGAJOLLI R, BOCCU E, et al. Surface modification of proteins—activation of monomethoxy-polyethylene glycols by phenylchloroformates and modification of ribonuclease and superoside-dismutase [J]. Applied Biochemistry and Biotechnology,1985, 11 (2): 141-152.

[4] GONZALEZ-VALDEZ J, RITO-PALOMARES M, BENAVIDES J. Advances and trends in the design, analysis, and characterization of polymer-protein conjugates for “PEGylaided” bioprocesses [J]. Analytical and Bioanalytical Chemistry, 2012, 403 (8): 2225-2235.

[5] CASTILLO B, SOLA R J, FERRER A, et al. Effect of PEG modification on subtilisin Carlsberg activity, enantioselectivity, and structural dynamics in 1,4-dioxane [J]. Biotechnology and Bioengineering, 2008, 99 (1): 9-17.

[6] LI C M, HUANG M, GU Z B, et al. Nanosilica sol leads to further increase in polyethylene glycol (PEG) 1000-enhanced thermostability of beta-cyclodextrin glycosyltransferase from Bacillus circulans [J]. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 2014, 62 (13): 2919-2924.

[7] DABA T, KOJIMA K, INOUYE K. Chemical modification of wheat β-amylase by trinitrobenzenesulfonic acid, methoxypolyethylene glycol, and glutaraldehyde to improve its thermal stability and activity [J]. Enzyme and Microbial Technology, 2013, 53 (6/7): 420-426.

[8] ISMAYA W T, HASAN K, KARDI I, et al. Chemical modification of Saccharomycopsis fibuligera R64 alpha-amylase to improve its stability against thermal, chelator, and proteolytic inactivation [J]. Applied Biochemistry and Biotechnology, 2013, 170 (1): 44-57.

[9] LOZANO P, DE DIEGO T, SAUER T, et al. On the importance of the supporting Candida antarctica lipase B in material for activity of immobilized ionic liquid/hexane and ionic liquid/supercritical carbon dioxide biphasic media [J]. Journal of Supercritical Fluids, 2007, 40 (1): 93-100.

[10] DICOSIMO R, MCAULIFFE J, POULOSE A J, et al. Industrial use of immobilized enzymes [J]. Chemical Society Reviews, 2013, 42 (15): 6437-6474.

[11] MISSON M, ZHANG H, JIN B. Nanobiocatalyst advancements and bioprocessing applications [J]. Journal of the Royal Society Interface, 2015, 12 (102). DOI: 10.1098/rsif.2014.0891.

[12] GE J, LEI J, ZARE R N. Protein-inorganic hybrid nanoflowers [J]. Nature Nanotechnology, 2012, 7 (7): 428-432.

[13] VAN DER VEEN M, NORDE W, STUART M C. Effects of succinylation on the structure and thermostability of lysozyme [J]. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 2005, 53 (14): 5702-5707.

[14] COBB R E, CHAO R, ZHAO H M. Directed evolution: past, present, and future [J]. AIChE Journal, 2013, 59 (5): 1432-1440.

[15] MARTINEZ R, JAKOB F, TU R, et al. Increasing activity and thermal resistance of Bacillus gibsonii alkaline protease (BgAP) by directed evolution [J]. Biotechnology and Bioengineering, 2013, 110 (3): 711-720.

[16] KOYAMA Y, HIDAKA M, NISHIMOTO M, et al. Directed evolution to enhance thermostability of galacto-N-biose/lacto-N-biose I phosphorylase [J]. Protein Engineering Design & Selection, 2013, 26 (11): 755-761.

[17] DENARD C A, REN H Q, ZHAO H M. Improving and repurposing biocatalysts via directed evolution [J]. Current Opinion in Chemical Biology, 2015, 25: 55-64.

[18] MOORE J C, ARNOLD F H. Directed evolution of a para-nitrobenzyl esterase for aqueous-organic solvents [J]. Nature Biotechnology, 1996, 14 (4): 458-467.

[19] YAMADA R, HIGO T, YOSHIKAWA C, et al. Improvement of the stability and activity of the BPO-A1 haloperoxidase from Streptomyces aureofaciens by directed evolution [J]. Journal of Biotechnology, 2014, 192: 248-254.

[20] YU X W, WANG R, ZHANG M, et al. Enhanced thermostability of a Rhizopus chinensis lipase by in vivo recombination in Pichia pastoris [J]. Microbial Cell Factories, 2012, 11: 102.

[21] RAO G D, LEE J K, ZHAO H M. Directed evolution of phloroglucinol synthase PhlD with increased stability for phloroglucinol production [J]. Applied Microbiology and Biotechnology, 2013, 97 (13): 5861-5867.

[22] HUANG L, XU J H, YU H L. Significantly improved thermostability of a reductase CgKR1 from Candida glabrata with a key mutation at Asp 138 for enhancing bioreduction of aromatic alpha-keto esters [J]. Journal of Biotechnology, 2015, 203: 54-61.

[23] OHTA Y, HATADA Y, HIDAKA Y, et al. Enhancing thermostability and the structural characterization of Microbacterium saccharophilum K-1 beta-fructofuranosidase [J]. Applied Microbiology and Biotechnology, 2014, 98 (15): 6667-6677.

[24] WIJMA H J, FLOOR R J, JANSSEN D B. Structure- and sequence-analysis inspired engineering of proteins for enhanced thermostability [J]. Current Opinion in Structural Biology, 2013, 23 (4): 588-594.

[25] NESTL B M, HAUER B. Engineering of flexible loops in enzymes [J]. ACS Catalysis, 2014, 4 (9): 3201-3211.

[26] YEDAVALLI P, RAO N M. Engineering the loops in a lipase for stability in DMSO [J]. Protein Engineering Design & Selection, 2013, 26 (4): 317-324.

[27] DUMON C, VARVAK A, WALL M A, et al. Engineering hyperthermostability into a GH11 xylanase is mediated by subtle changes to protein structure [J]. Journal of Biological Chemistry, 2008, 283 (33): 22557-22564.

[28] SONG L T, TSANG A, SYLVESTRE M. Engineering a thermostable fungal GH10 xylanase, importance of N-terminal amino acids [J]. Biotechnology and Bioengineering, 2015, 112 (6): 1081-1091.

[29] BOSSHART A, PANKE S, BECHTOLD M. Systematic optimization of interface interactions increases the thermostability of a multimeric enzyme [J]. Angewandte Chemie:International Edition, 2013, 52 (37): 9673-9676.

[30] REETZ M T, D CARBALLEIRA J, VOGEL A. Iterative saturation mutagenesis on the basis of B factors as a strategy for increasing protein thermostability [J]. Angewandte Chemie:International Edition, 2006, 45 (46): 7745-7751.

[31] CHEN C C, LUO H Y, HAN X, et al. Structural perspectives of an engineered beta-1,4-xylanase with enhanced enhanced thermostability [J]. Journal of Biotechnology, 2014, 189: 175-182.

[32] WEN S, TAN T W, ZHAO H M. Improving the thermostability of lipase Lip2 from Yarrowia lipolytica [J]. Journal of Biotechnology, 2012, 164 (2): 248-253.

[33] EASTMAN P, PELLEGRINI M, DONIACH S. Protein flexibility in solution and in crystals [J]. Journal of Chemical Physics, 1999, 110 (20): 10141-10152.

[34] CURRIN A, SWAINSTON N, DAY P J, et al. Synthetic biology for the directed evolution of protein biocatalysts: navigating sequence space intelligently [J]. Chemical Society Reviews, 2015, 44 (5): 1172-1239.

[35] XIAO Z, BERGERON H, GROSSE S, et al. Improvement of the thermostability and activity of a pectate lyase by single amino acid substitutions, using a strategy based on melting-temperature-guided sequence alignment [J]. Applied and Environmental Microbiology, 2008, 74 (4): 1183-1189.

[36] BEN M S, AGHAJARI N, BEN A M, et al. Enhancement of the thermostability of the maltogenic amylase MAUS149 by Gly312Ala and Lys436Arg substitutions [J]. Bioresource Technology, 2011, 102 (2): 1740-1746.

[37] REICH S, KRESS N, NEST B M, et al. Variations in the stability of NCR ene reductase by rational enzyme loop modulation [J]. Journal of Structural Biology, 2014, 185 (2): 228-233.

[38] DAMNJANOVIC J, NAKANO H, IWASAKI Y. Deletion of a dynamic surface loop improves stability and changes kinetic behavior of phosphatidylinositol-synthesizing streptomyces phospholipase D [J]. Biotechnology and Bioengineering, 2014, 111 (4): 674-682.

[39] GALL M G, NOBILI A, PAVLIDIS I V, et al. Improved thermostability of a Bacillus subtilis esterase by domain exchange [J]. Applied Microbiology and Biotechnology, 2014, 98 (4): 1719-1726.

[40] DAMBORSKY J, BREZOVSKY J. Computational tools for designing and engineering enzymes [J]. Current Opinion in Chemical Biology, 2014, 19: 8-16.

[41] GAO S J, WANG J Q, WU M C, et al. Engineering hyperthermostability into a mesophilic family 11 xylanase from Aspergillus oryzae by in silico design of N-terminus substitution [J]. Biotechnology and Bioengineering, 2013, 110 (4): 1028-1038.

[42] TIAN J, WANG P, HUANG L, et al. Improving the thermostability of methyl parathion hydrolase from Ochrobactrum sp. M231 using a computationally aided method [J]. Applied Microbiology and Biotechnology, 2013, 97 (7): 2997-3006.

[43] LU X, LIU S, ZHANG D, et al. Enhanced thermal stability and specific activity of Pseudomonas aeruginosa lipoxygenase by fusing with self-assembling amphipathic peptides [J]. Applied Microbiology and Biotechnology, 2013, 97 (21): 9419-9427.

[44] BOONE C D, RASI V, TU C, et al. Structural and catalytic effects of proline substitution and surface loop deletion in the extended active site of human carbonic anhydrase II [J]. FEBS Journal, 2015, 282 (8): 1445-1457.

[45] 湯恒, 黃申, 馮旭東, 等. 理性設(shè)計(jì)提高β-葡萄糖醛酸苷酶的熱穩(wěn)定性 [J]. 化工學(xué)報(bào), 2015, 66 (6): 2205-2211. TANG H, HUANG S, FENG X D, et al. Improvement of thermostability of beta-glucuronidase through rational design [J]. CIESC Journal, 2015, 66 (6): 2205-2211.

[46] DENG Z M, YANG H Q, SHIN H D, et al. Structure-based rational design and introduction of arginines on the surface of an alkaline alpha-amylase from Alkalimonas amylolytica for improved thermostability [J]. Applied Microbiology and Biotechnology, 2014, 98 (21): 8937-8945.

[47] CHEN J, YU H, LIU C, et al. Improving stability of nitrile hydratase by bridging the salt-bridges in specific thermal-sensitive regions [J]. Journal of Biotechnology, 2012, 164 (2): 354-362.

[48] LEE C W, WANG H J, HWANG J K, et al. Protein thermal stability enhancement by designing salt bridges: a combined computational and experimental study [J]. Plos One, 2014, 9 (11). DOI: 10.1371/journal.pone.0112751.

[49] HATAHET F, BOYD D, BECKWITH J. Disulfide bond formation in prokaryotes: history, diversity and design [J]. Biochimica Et Biophysica Acta-Proteins and Proteomics, 2014, 1844 (8): 1402-1414.

[50] HWA K Y, SUBRAMANI B, SHEN S T, et al. An intermolecular disulfide bond is required for thermostability and thermoactivity of beta-glycosidase from Thermococcus kodakarensis KOD1 [J]. Applied Microbiology and Biotechnology, 2014, 98 (18): 7825-7836.

[51] BADIEYAN S, BEVAN D R, ZHANG C. Study and design of stability in GH5 cellulases [J]. Biotechnology and Bioengineering, 2012, 109 (1): 31-44.

[52] YIN X, HU D, LI J F, et al. Contribution of disulfide bridges to the thermostability of a type A feruloyl esterase from Aspergillus usamii [J]. Plos One, 2015, 10 (5). DOI: 10.1371/journal.pone.0126864.

[53] NOTHAFT H, SZYMANSKI C M. Bacterial protein N-glycosylation: new perspectives and applications [J]. Journal of Biological Chemistry, 2013, 288 (10): 6912-6920.

[54] HEBERT D N, LAMRIBEN L, POWERS E T, et al. The intrinsic and extrinsic effects of N-linked glycans on glycoproteostasis [J]. Nature Chemcial Biology, 2014, 10 (11): 902-910.

[55] APWEILER R, HERMJAKOB H, SHARON N. On the frequency of protein glycosylation, as deduced from analysis of the SWISS-PROT database [J]. Biochimica Et Biophysica Acta-General Subjects, 1999, 1473 (1): 4-8.

[56] FONSECA-MALDONADO R, VIEIRA D S, ALPONTI J S, et al. Engineering the pattern of protein glycosylation modulates the thermostability of a gh11 xylanase [J]. Journal of Biological Chemistry, 2013, 288 (35): 25522-25534.

[57] ZOU S P, XIE L P, LIU Y L, et al. N-linked glycosylation influences on the catalytic and biochemical properties of Penicillium purpurogenum beta-D-glucuronidase [J]. Journal of Biotechnology, 2012, 157 (3): 399-404.

[58] ZOU S P, HUANG S, KALEEM I, et al. N-glycosylation enhances functional and structural stability of recombinant beta-glucuronidase expressed in Pichia pastoris [J]. Journal of Biotechnology, 2013, 164 (1): 75-81.

[59] ZHU J, LIU H, ZHANG J, et al. Effects of Asn-33 glycosylation on the thermostability of Thermomyces lanuginosus lipase [J]. Journal of Applied Microbiology, 2014, 117 (1): 151-159.

[60] HAN M H, WANG X F, DING H Y, et al.The role of N-glycosylation sites in the activity, stability, and expression of the recombinant elastase expressed by Pichia pastoris [J]. Enzyme and Microbial Technology, 2014, 54: 32-37.

[61] SHENTAL-BECHOR D, LEVY Y. Effect of glycosylation on protein folding: a dose book at thermodynamic stabilization [J]. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 2008, 105 (24): 8256-8261.

[62] SKROPETA D. The effect of individual N-glycans on enzyme activity [J]. Bioorganic & Medicinal Chemistry, 2009, 17 (7): 2645-2653.

[63] PIIRAINEN M A, DE RUIJTER J C, KOSKELA E V, et al. Glycoengineering of yeasts from the perspective of glycosylation efficiency [J]. New Biotechnology, 2014, 31 (6): 532-537.

[64] HAN M H, WANG X F, YAN G L, et al. Modification of recombinant elastase expressed in Pichia pastoris by introduction of N-glycosylation sites [J]. Journal of Biotechnology, 2014, 171: 3-7.

Foundation item: supported by the National Natural Science Foundation of China (21506011, 21425624, 21176028).

Advances in enzyme stability modification

FENG Xudong, Lü Bo, LI Chun
(School of Life Science, Beijing Institute of Technology, Beijing 100081, China)

Abstract:Enzymes play an increasingly important role in diverse industrial fields such as food, pharmacy and fine chemistry. However, most of the enzymes require mild reaction conditions to maintain the activity, and they have poor tolerance towards heat, acid and salt under stressful conditions in real applications. Thus, the enzymes are very labile to lose their activity, severely limiting their applications. Therefore, it is critical and also challenging to engineer enzymes for higher stability. In this paper, the progress in enzyme stability modification is summarized from perspectives of chemical decoration and molecular modification. The molecular modification is illustrated with regards to directed evolution, semi-rational, ration design and glycosylation, where the glycosylation as a new tool to improve enzyme stability is briefly reviewed.

Key words:biochemical engineering; biocatalysis; enzyme; stability; molecular modification; glycosylation

Corresponding author:Prof. LI Chun, lichun@bit.edu.cn

基金項(xiàng)目：國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（21506011，21425624，21176028）。

中圖分類號(hào)：Q 816

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號(hào)：0438—1157（2016）01—0277—08

DOI：10.11949/j.issn.0438-1157.20151025