米曲霉氨基?；傅募兓按置感再|(zhì)研究

張媛媛，張彬（石家莊學(xué)院化工學(xué)院，河北石家莊050035）

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米曲霉氨基?；傅募兓按置感再|(zhì)研究

張媛媛，張彬
（石家莊學(xué)院化工學(xué)院，河北石家莊050035）

摘要：利用硫酸銨分級(jí)鹽析法從米曲霉L-09中提取氨基?；?，比活力為56.01 U/mg，純化倍數(shù)為2.06，酶活力回收率為80 %。詳細(xì)研究該粗酶的酶學(xué)性質(zhì)。結(jié)果表明，經(jīng)鹽析法提純的粗酶最適pH為7，最適反應(yīng)溫度為55℃，在55℃下熱穩(wěn)定性良好。溶液中的金屬離子對(duì)酶活力有很大影響。其中，高濃度的Fe2+、Mn2+和Ca2+對(duì)酶活力有抑制作用，低濃度的Co2+離子對(duì)酶活力有激活作用。

關(guān)鍵詞：氨基?；?；純化；粗酶性質(zhì)

氨基酸作為一種常見(jiàn)的手性化合物，其生產(chǎn)、應(yīng)用與人類(lèi)息息相關(guān)。D-氨基酸如D-丙氨酸[1]，D-苯丙氨酸[2]因其重要的生理功能，在醫(yī)藥、食品等行業(yè)中都有較好的潛在價(jià)值[3]。但D-氨基酸在自然界中含量稀少，直接提取的成本較高，也無(wú)法通過(guò)發(fā)酵法獲得，因此使用氨基?；笇?duì)D，L-氨基酸進(jìn)行酶學(xué)拆分是生產(chǎn)D-氨基酸的行之有效的方法之一[4]。

氨基?；改軐?zhuān)一地水解N-?；?L-氨基酸的酰胺鍵，獲得L-氨基酸，反應(yīng)物中留下的D-氨基酸可通過(guò)化學(xué)方法轉(zhuǎn)型或繼續(xù)拆分[5]。氨基?；笍V泛存在于動(dòng)物[6]、植物[7]和微生物細(xì)胞[8]中，米曲霉氨基?；甘怯擅浊巩a(chǎn)生的胞外酶。

自60年代末日本將固定化氨基?；赋晒?yīng)用于生產(chǎn)以來(lái)，國(guó)內(nèi)有關(guān)于該酶固定化的研究報(bào)道很多[9-10]。受成本限制固定化氨基?；傅某霭l(fā)酶液通常采用鹽析等蛋白質(zhì)初級(jí)純化方法進(jìn)行處理，所以研究經(jīng)初步純化后的粗酶液的酶學(xué)性質(zhì)對(duì)于后續(xù)的固定化操作有很大意義。本文以米曲霉L-09為出發(fā)菌，詳細(xì)研究了經(jīng)鹽析法初步純化后的氨基酰化酶粗酶液的酶學(xué)性質(zhì)，為該酶的固定化操作提供了更確切的參考。

1材料和方法

1.1菌種

米曲霉L-09：石家莊學(xué)院食品科學(xué)實(shí)驗(yàn)室選育保藏。

1.2培養(yǎng)基

1.2.1黃豆汁瓊脂培養(yǎng)基

豆汁200 mL（20 g黃豆加水200 mL浸提過(guò)夜，煮沸2 h，用紗布過(guò)濾即可），蔗糖6 g，MgSO4·7H2O 0.1 g，K2HPO40.072 g，瓊脂4 g，pH自然。

1.2.2固體培養(yǎng)基

麩皮∶豆餅粉∶水= 4∶1∶5；吐溫-80 0.5 %；植酸0.05 %，以上均為質(zhì)量比；pH自然。

1.3主要原料及儀器

N-乙酰-DL-蛋氨酸（N-AC-DL-Met），純度99 %：購(gòu)于江蘇省張家港市氨基酸有限公司；721型分光光度計(jì)：島津有限公司；H.H.S型電熱恒溫水浴鍋：鄭州市鞏義華玉儀器廠；SHZ_DⅢ型循環(huán)水真空泵：上海比朗儀器制造有限公司；冷凍高速離心機(jī)：湖南湘儀儀器有限公司；79-1型磁力加熱攪拌器：上海梅穎浦儀器儀表制造有限公司。

1.4方法

1.4.1米曲霉的固態(tài)培養(yǎng)

取1 mL的霉菌孢子懸液（106個(gè)/mL）接種到固態(tài)培養(yǎng)基內(nèi)，于30℃，100 r/min的搖床上培養(yǎng)2 d。

1.4.2米曲霉氨基酰化酶的提取

取培養(yǎng)好的固體培養(yǎng)基若干，加入7倍于其質(zhì)量的蒸餾水，于30℃，100 r/min的搖床上浸提1 h，紗布過(guò)濾、抽濾得到酶液。

1.4.3鹽析法純化米曲霉氨基?；?/p>

向酶液中緩慢添加研細(xì)的固體（NH4）2SO4，使溶液中的（NH4）2SO4達(dá)到一定的飽和度，4℃靜置2 h，10 000 r/min冷凍離心15 min，所得沉淀用磷酸緩沖液溶解，透析除鹽并測(cè)定酶活。在添加（NH4）2SO4的同時(shí)要注意攪拌均勻，防止局部鹽濃度過(guò)高，引起酶蛋白變性。

1.4.4酶活力測(cè)定方法

取0.2 mL待測(cè)酶液于試管中，依次加入0.4 mL pH 7.0的磷酸緩沖液，0.2 mL（0.15 mmol/L）CoCl2，0.2 mL（0.2mol/L）N-AC-DL-Met，37℃恒溫水浴30min，迅速取出，沸水浴5 min滅酶，待冷卻后加入1 mL pH 5.4的NaAc-HAc緩沖液，0.5 mL茚三酮顯色劑，沸水浴15 min，冷卻，加入3 mL 60 %（體積分?jǐn)?shù)）的乙醇溶液，在570 nm下比色，得到吸光度值，并由標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出待測(cè)酶液中蛋氨酸的含量。對(duì)照溶液先滅酶，再加入底物N-AC-DL-Met，其余同上。

酶活力單位（U）定義為：在pH 7.0和37℃下，1 h內(nèi)酶催化底物水解釋放出1 μmol L-蛋氨酸為1 U。

1.4.5蛋白的測(cè)定方法

考馬斯亮蘭法[11]。

2結(jié)果與討論

2.1鹽析中（NH4）2SO4飽和度的確定

2.1.1一級(jí)鹽析（NH4）2SO4飽和度的確定

向酶液中添加不同質(zhì)量的（NH4）2SO4，使其在酶液中的飽和度分別達(dá)到20 %、30 %、40 %、50 %、60 %、70 %、80 %。得到沉淀中的酶活力回收率與（NH4）2SO4飽和度之間的關(guān)系如圖1所示。

圖1不同（NH4）2SO4飽和度對(duì)氨基?；该富盍厥章实挠绊慒ig.1 Effect of saturation of ammonium sulfate on recovery rate of aminoacylase

從圖中看出，當(dāng)（NH4）2SO4飽和度為30 %時(shí)，僅有不到10 %的酶活力保留在沉淀中；當(dāng)飽和度大于60 %時(shí)，沉淀中的酶活力回收率都較高。因此，一級(jí)鹽析選用的（NH4）2SO4飽和度為30 %。

酶活力回收率/% =（純化后總酶活力/純化前總酶活力）×100

2.1.2二級(jí)鹽析（NH4）2SO4飽和度的確定

去除30 %（NH4）2SO4飽和度沉淀后，上清液中繼續(xù)添加（NH4）2SO4，使飽和度分別達(dá)到60 %、70 %和80 %。所得結(jié)果見(jiàn)表1。

表1（NH4）2SO4二次鹽析試驗(yàn)結(jié)果Table 1 Result of the second salting-out of ammonium sulfate

從表1中看出，（NH4）2SO4飽和度為70 %時(shí)，酶活力回收率與80 %飽和度時(shí)相差不大，但是純化倍數(shù)高于80 %飽和度。因此，二級(jí)鹽析選用的（NH4）2SO4飽和度為70 %。

比活力=單位酶活力/蛋白質(zhì)濃度；純化倍數(shù)=純化后的比活力/粗酶液的比活力

2.2粗酶酶學(xué)性質(zhì)的研究

發(fā)酵法提取的氨基?；敢航?jīng)過(guò)鹽析，透析和聚乙二醇濃縮后，就得到了可用于固定化研究的粗酶液。下面對(duì)此氨基?；复置敢旱拿笇W(xué)性質(zhì)進(jìn)行了研究。

2.2.1溫度對(duì)酶活力的影響

通過(guò)測(cè)定不同反應(yīng)溫度下的酶活力，得到溫度對(duì)氨基?；杆饽芰Φ挠绊?，如圖2所示（定義最大酶活力為100 %）。

從圖中看出，氨基?；冈?5℃時(shí)對(duì)底物NAC-DL-Met的水解能力最強(qiáng)。

圖2溫度對(duì)酶活力的影響Fig.2 Effect of temperature on aminoacylase activity

2.2.2熱穩(wěn)定性研究

將粗酶液密閉于試管中，并將試管分別放置在37、50、55、60、65、70、80℃的水浴中保溫30 min，取出試管，在37℃下測(cè)定酶活力，結(jié)果見(jiàn)圖3（定義初始酶活力為100 %）。

圖3酶的熱穩(wěn)定性曲線Fig.3 Thermal stability of the aminoacylase

從圖中看出，粗酶液在37℃下的熱穩(wěn)定性良好，在70℃下放置30 min失活現(xiàn)象顯著。

對(duì)酶液在37℃和55℃下的熱穩(wěn)定性進(jìn)行了進(jìn)一步的試驗(yàn)研究，將粗酶液分別置于37℃和55℃水浴中放置8 h，間隔1 h測(cè)定其酶活力，結(jié)果如圖4所示（定義初始酶活力為100 %）。

圖4 37℃、55℃條件下酶的熱穩(wěn)定性Fig.4 The thermal stability of the aminoacylase on the 37℃and 55℃condition

從試驗(yàn)結(jié)果得知，粗酶液在55℃水浴中放置8 h，酶活力保留率在82 %以上；在37℃水浴中表現(xiàn)出更好的熱穩(wěn)定性，放置8 h酶活力保留率仍在90 %以上；該酶2個(gè)溫度環(huán)境下均沒(méi)有明顯失活現(xiàn)象，表明其具有良好的熱穩(wěn)定性。結(jié)合溫度對(duì)酶活力的影響試驗(yàn)結(jié)果，在55℃下，該酶對(duì)底物N-AC-DL-Met的水解能力最強(qiáng)。實(shí)際應(yīng)用過(guò)程中，在對(duì)酶的熱穩(wěn)定性影響較小的前提下，可適當(dāng)升高溫度，來(lái)提高酶促反應(yīng)速度，以達(dá)到最佳反應(yīng)效果。

2.2.3 pH對(duì)酶活力的影響

通過(guò)改變反應(yīng)液的酸堿條件，得到酶活力與溶液pH之間的關(guān)系如圖5所示（定義最大酶活力為100%）。

圖5 pH對(duì)酶活力的影響Fig.5 Effect of pH on aminoacylase activity

由圖中看出，米曲霉氨基?；冈谥行院腿鯄A性的條件下對(duì)底物的水解能力較強(qiáng)，在pH 4時(shí)已基本失活，其最適pH為7.0。

2.2.4金屬離子對(duì)酶活力的影響

氨基?；甘且环N含Zn2＋的酶[12]，有2個(gè)金屬離子松散結(jié)合位點(diǎn)，可與二價(jià)金屬離子結(jié)合。而在工業(yè)生產(chǎn)中金屬離子的攝入是不可避免的，因此，研究了幾種常見(jiàn)金屬離子對(duì)粗酶液酶活力的影響，結(jié)果如表2所示。

表2金屬離子對(duì)酶活力的影響Table 2 Effect of metal ion on anmioacylase activity

從表2中可以看出，Mg2+、Zn2＋和Li＋對(duì)酶活力的影響不大，Cu2＋對(duì)酶活力有強(qiáng)的抑制作用，高濃度的Fe2＋、Mn2＋和Ca2＋對(duì)酶活力也有抑制作用，而低濃度的Co2+和Ca2＋對(duì)酶活力有激活作用。對(duì)Co2+和Ca2＋做進(jìn)一步的研究，結(jié)果見(jiàn)圖6、圖7。

圖6 Co2+濃度對(duì)酶活力的影響Fig.6 Effect of ion of Co2+on aminoacylase activity

圖7 Ca2+濃度對(duì)酶活力的影響Fig.7 Effect of ion of Ca2+on aminoacylase activity

從圖中可以看出：Ca2+濃度在0.1 mmol/L~1 mmol/L之間時(shí)對(duì)酶活力有很強(qiáng)的激活作用，Ca2＋濃度在小于1 mmol/L時(shí)對(duì)酶活力也有激活作用，但效果不如前者顯著。

2.2.5酶的保存穩(wěn)定研究

研究了粗酶液的保存穩(wěn)定性。將酶液放置在4℃冰箱中保存，間歇測(cè)定酶液的殘留酶活力，得到酶活力與放置時(shí)間的關(guān)系曲線如圖8所示。

由圖8看出，當(dāng)放置時(shí)間為30 d時(shí)，酶活力損失率僅為25 %，由公式t1/2=ln2/kd，CEt/CE0=e-kd×t。式中：t1/2為半衰期；CE0為初始酶活力；CEt為t時(shí)的相對(duì)酶活力；kd為衰變常數(shù)。計(jì)算出該粗酶液的半衰期為104 d。

3　結(jié)論

利用硫酸銨二級(jí)沉淀法獲得的粗酶液比活力為56.01 U/mg，純化倍數(shù)為2.06，酶活力回收率為80 %。該粗酶液的半衰期是104 d，最適pH為7.0，最適溫度為55℃，在55℃下熱穩(wěn)定性良好。通過(guò)對(duì)熱穩(wěn)定性和最適溫度的綜合比較看出，在熱穩(wěn)定良好的時(shí)間范圍內(nèi)，55℃下該酶的水解能力明顯優(yōu)于37℃，即粗酶液的最佳使用溫度為55℃。因此，在游離酶及固定化酶的實(shí)際應(yīng)用中可以根據(jù)反應(yīng)條件、反應(yīng)時(shí)間等具體情況，選取合適的反應(yīng)溫度，以提高催化效率。

通過(guò)研究金屬離子對(duì)酶活力的影響得知，Cu2＋及高濃度的Fe2＋、Mn2＋和Ca2＋對(duì)酶活力有抑制作用，Co2+濃度在0.1 mmol/L~1 mmol/L之間及Ca2＋濃度小于10 mmol/L時(shí)均對(duì)酶活力有很強(qiáng)的激活作用，但后者效果不如前者顯著。因此在酶活力測(cè)定及實(shí)際生產(chǎn)應(yīng)用中應(yīng)該添加適量Co2+來(lái)提高酶活力，同時(shí)應(yīng)盡量避免原料中對(duì)酶活力有抑制作用的金屬離子所帶來(lái)的負(fù)面影響。在使用海藻酸鈣對(duì)氨基?；高M(jìn)行包埋固定化時(shí)應(yīng)考慮到Ca2＋濃度對(duì)粗酶液酶活力的影響。

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Study on Purification and Properties of Aminoacylase of Aspergilus oryzae

ZHANG Yuan-yuan，ZHANG Bin
（Institute of Chemical Technology，Shijiazhuang University，Shijiazhuang 050035，Hebei，China）

Abstract：The aminoacylase from Aspergillus oryzae was partially purified by ammonium sulfate fractionation. The specific activity of aminoacylase was 56.01 U/mg. The purification ratio and recovery were 2.06 and 80 %. The optimal pH of aminoacylase was 7.0. The optimal temperature of aminoacylase was 55℃. The thermal stability of aminoacylase under 55℃was good. The ions in the solvent infected the aminoacylase. Fe2+，Mn2+and Ca2+in high concentration lowered the activity of aminoacylase，the Co2+in low concentration activated the

aminoacylase.

Key words：aminoacylase；purification；properties

收稿日期：2014-10-13

DOI：10.3969/j.issn.1005-6521.2016.02.046

作者簡(jiǎn)介：張媛媛（1983—），女（漢），講師，博士研究生，研究方向：發(fā)酵工程，食品安全與食品分析。