連翹葉不同溶劑提取物體外抗氧化活性研究

賈東升，李榮喬，謝曉亮，溫春秀，崔施展，劉銘（河北省農(nóng)林科學(xué)院經(jīng)濟作物研究所，藥用植物研究中心，河北石家莊050051）

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連翹葉不同溶劑提取物體外抗氧化活性研究

賈東升，李榮喬，謝曉亮*，溫春秀，崔施展，劉銘
（河北省農(nóng)林科學(xué)院經(jīng)濟作物研究所，藥用植物研究中心，河北石家莊050051）

摘要：比較連翹葉不同提取溶劑提取物的抗氧化活性。分別以水、60 %乙醇、80 %乙醇、無水乙醇、乙酸乙酯為溶劑制備連翹葉提取物，測定不同提取物中多糖、總酚和黃酮含量；以BHT為陽性對照，采用DPPH自由基（DPPH·）、羥基自由基（·OH）、超氧陰離子（O2-·）、ABTS自由基（ABTS+·）清除活性和鐵離子還原能力（FRAP）法考察各溶劑提取物的抗氧化活性；考察提取物中活性物質(zhì)含量與其活性的相關(guān)性。連翹葉不同溶劑提取物均具有抗氧化活性，均呈一定的量效關(guān)系，且不同溶劑提取物的抗氧化活性強弱順序隨評價方法的不同而不同。連翹葉不同溶劑提取物中總酚含量和黃酮含量均與·OH清除活性和鐵離子還原能力具有較高的相關(guān)性，黃酮含量還與O2-·清除活性具有較高的相關(guān)性。連翹葉80 %乙醇提取物和60%乙醇提取物抗氧化活性相對較高。

關(guān)鍵詞：連翹葉；抗氧化活性；多糖；總酚；黃酮

近年來自由基成為許多學(xué)者研究的熱點，其通過氧化作用破壞細胞結(jié)構(gòu)和功能，因此抗氧化劑研究越來越受到關(guān)注。目前常用抗氧化劑多為人工合成，相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)，人工抗氧化劑可抑制體內(nèi)代謝酶活性，過量食用可導(dǎo)致機體代謝紊亂，并且會致畸、致癌[1]，因此天然抗氧化劑的研究具有重要意義。我國中藥材資源豐富，分布廣泛，含有多種抗氧化成分如多糖、多酚、黃酮等，從中藥材中提取低毒、安全、有效的天然抗氧化劑已成為抗氧化劑發(fā)展的必然趨勢。

連翹是我國傳統(tǒng)的中藥材，廣泛分布于河北省太行山地區(qū)，果實是其主要入藥部位，副產(chǎn)物連翹葉常常被廢棄。有研究表明，連翹葉中含有豐富的多糖、多酚和黃酮類物質(zhì)，是一種具有較大開發(fā)前景的天然抗氧化劑資源[2-5]。因此，本研究采用不同溶劑提取連翹葉，對提取物中的多糖、總酚和黃酮含量進行測定，考察不同溶劑提取物的抗氧化活性，并考察提取物中多糖、總酚和黃酮含量與其抗氧化活性的相關(guān)性，以期為連翹葉資源在食品、醫(yī)藥和日化領(lǐng)域的應(yīng)用開發(fā)提供試驗支持。

1試驗材料

1.1儀器

DGX-92438-2型干燥箱：上海?，攲嶒炘O(shè)備有限公司；分析天平：METTLER TOLEDO；RE52CS-1旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀：上海亞榮生化儀器廠；FD-1B-50冷凍干燥機：北京博醫(yī)康實驗儀器有限公司；752PC型紫外可見分光光度計：上海光譜儀器有限公司；MK3型酶標(biāo)儀：Thermo Fisher。

1.2試劑

連翹葉：2014年10月采摘于邯鄲涉縣連翹基地；沒食子酸（批號：110831-201403）、蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品（批號：100080-201408）：中國藥品生物制品檢定所；Folin-Ciocalteu試劑（分析純）、1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH，分析純）、2，2'-聯(lián)氮雙（3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸）二銨鹽（ABTS，分析純）：Sigma；2，4，6-三吡啶基三嗪（TPTZ，分析純）：上海江萊生物科技有限公司；2，6-二叔丁基-4-甲基苯酚（BHT，分析純）：濟寧宏明化學(xué)試劑有限公司；水為高純水，其余試劑均為分析純。

2試驗方法

2.1連翹葉不同溶劑提取工藝

將新鮮連翹葉置于55℃干燥箱中干燥，粉碎過20目篩得連翹葉粉末，按1∶35（g/mL）料液比分別加入不同提取溶劑（蒸餾水、60 %乙醇、80 %乙醇、無水乙醇、乙酸乙酯），回流提取1 h，提取2次，抽濾，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮至近干，冷凍干燥得不同溶劑提取物。

2.2多糖含量測定

采用苯酚-硫酸法測定連翹葉提取物中多糖的含量[2]。精密移取0.1 mg/mL葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.8、1.0 mL，置于具塞試管中，用蒸餾水稀釋至1 mL，各加入6 %苯酚溶液1 mL，搖勻，迅速加入濃硫酸5 mL，沸水浴20 min，冷卻至室溫，于490 nm處測定吸光度，以吸光值為橫坐標(biāo)，葡萄糖濃度為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

多糖含量測定：以1 mL樣品溶液代替葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液測定樣品中多糖含量。

2.3總酚含量測定

Folin-Ciocalteu法測定[6]。

沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制：精密稱取10.0 mg沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)品，溶于4 mL 50 %甲醇溶液，制備標(biāo)準(zhǔn)品溶液。準(zhǔn)確吸取標(biāo)準(zhǔn)品溶液0.0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL 于EP管中，用50 %甲醇補至1.0 mL。取不同濃度標(biāo)準(zhǔn)品溶液各0.2 mL，加入2.0 mL 50 % Folin-Ciocalteu試劑，混合后加入4.0 mL 0.2 g/L碳酸鈉溶液，用蒸餾水定容至10.0 mL，充分振蕩混勻后于25℃黑暗條件下溫育2 h，在760 nm處的波長處測定吸光值。吸光值為橫坐標(biāo)，沒食子酸濃度為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

總酚含量的測定：以0.2 mL樣品溶液代替沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)溶液測定樣品中總酚含量。

2.4黃酮含量測定

三氯化鋁顯色法[6]。

蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制：精密稱取17.5 mg蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品，溶于7 mL 50 %甲醇溶液，制備標(biāo)準(zhǔn)品溶液。準(zhǔn)確吸取標(biāo)準(zhǔn)品溶液0.0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL于EP管中，用50 %甲醇補至1.0 mL。取不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)品溶液1 mL，加入0.1 g/L AlCl3200 μL，1 mol/L醋酸酐200 μL，加蒸餾水使反應(yīng)體系為6.0 mL，充分振蕩后于室溫條件下放置30 min，在415 nm的波長處測定吸光值。以吸光值為橫坐標(biāo)，蘆丁濃度為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

黃酮含量的測定：以1.0 mL樣品溶液代替蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液測定樣品中黃酮含量。

2.5抗氧化活性測定

2.5.1 DPPH·清除能力測定[6]

將連翹葉提取物配制成濃度分別為0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6 mg/mL的溶液，作為待測樣品備用。取不同濃度樣品2.0 mL，加入等體積0.09 mmol/LDPPH乙醇溶液，混勻后避光反應(yīng)30 min，以乙醇代替樣品為空白對照，于517nm波長處測定吸光值，DPPH·清除率按式（1）計算：

式中：A0為空白樣品吸光值；As為待測樣品吸光值。

2.5.2·OH清除能力的測定[7]

將連翹葉提取物配制成濃度分別為0.2、0.3、0.6、0.8、1.0、1.2 mg/mL的溶液，作為待測樣品備用。取0.75 mol/L鄰二氮菲無水乙醇溶液1 mL，加入磷酸緩沖液（pH 7.4）2 mL和去離子水1 mL，混勻后加入1 mL 0.75 mol/L的FeSO4，混勻，加入0.01 % H2O21 mL，37℃水浴60 min，536 nm下測其吸光值A(chǔ)損；以1 mL去離子水代替H2O2，吸光值為A未損；以1 mL樣品代替去離子水，吸光值為A樣；取2 mL磷酸緩沖液（pH7.4）和1 mL樣品溶液，充分混勻后加入3 mL去離子水，吸光值為A參。取2 mL磷酸緩沖液（pH 7.4）加入4 mL去離子水，作為空白調(diào)零A空，·OH清除率按式（2）計算：

2.5.3 O2-·清除能力的測定[8]

式中：k0為空白體系吸光值隨時間的變化率；ki為樣品體系吸光值隨時間的變化率。

2.5.4 ABTS+·清除能力的測定[9]

將連翹葉提取物配制成濃度分別為0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6 mg/mL的溶液，作為待測樣品備用。準(zhǔn)確稱取K2S2O40.504 7 g溶于1 L 7 mmol/L ABTS溶液中，于室溫避光條件下放置12 h~16 h，制得ABTS反應(yīng)液。取樣品溶液1.0 mL，加入ABTS反應(yīng)液1.5 mL，50 %甲醇2.5 mL，混勻，2 min后于745 nm處測定吸光值，以蒸餾水代替樣品為空白對照，ABTS+·清除率按式（4）計算：

式中：A0為空白樣品吸光度；As為待測樣品吸光度。

2.5.5 FRAP法測定抗氧化能力[10]

標(biāo)準(zhǔn)曲線制作：取濃度分別為0.0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mmol/L FeSO4溶液各150 μL，分別加入4.5 mL FRAP試劑（由0.3 mol/L醋酸緩沖液25 mL、10 mmol/L TPTZ溶液2.5 mL、20 mmol/LFeCl3溶液2.5 mL組成），37℃水浴10 min，于593 nm處測定吸光值，以吸光值為橫坐標(biāo)，F(xiàn)eSO4濃度為縱坐標(biāo)制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。

將連翹葉提取物配制成濃度分別為0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2 mg/mL的溶液，作為待測樣品備用。按標(biāo)準(zhǔn)曲線制作方法，以樣品溶液代替FeSO4測定吸光值。樣品抗氧化活性（FRAP值）以達到同樣吸光度所需的FeSO4的毫摩爾數(shù)表示，1FRAP單位= 1.0 mmol/L FeSO4，樣品的當(dāng)量FeSO4值即FRAP值越大表示其抗氧化活性越高。

3結(jié)果與分析

3.1連翹葉固形物得率以及提取物中多糖、總酚和黃酮含量

多糖含量測定回歸方程為Y=0.005 4X+0.046 3，R2=0.993；總酚含量測定回歸方程為Y=11.73X-1.041，R2=0.997；黃酮含量測定回歸方程為Y=29.17X+0.052，R2=0.994。

5種不同溶劑連翹葉提取物中固形物得率以及提取物中多糖、總酚和黃酮含量測定結(jié)果見表1。

表1連翹葉固形物得率以及提取物中多糖、總酚和黃酮含量Table 1 The solid recovery，polysaccharide，total phenols and flavonoids contents of different extracts from Forsythia suspensa leaves

表1連翹葉固形物得率以及提取物中多糖、總酚和黃酮含量Table 1 The solid recovery，polysaccharide，total phenols and flavonoids contents of different extracts from Forsythia suspensa leaves

注：-表示成分未檢出；同一列字母不同表示差異顯著，P<0.05。

固形物/%　多糖/（mg/g）總酚/（mg/g）黃酮/（mg/g）蒸餾水　27.52±1.43a36.83±2.06a24.76±2.19a　 35.27±7.33a60 %乙醇　24.54±0.98b4.46±0.23b　 33.26±2.25b148.63±10.52b80 %乙醇　23.23±1.13b　 -　 39.84±2.31c134.57±12.68b無水乙醇　19.14±0.83c　 -　 35.73±2.12b98.47±11.64c乙酸乙酯　17.33±0.68d　 -　 25.85±2.36a　 88.62±9.37c

結(jié)果表明，連翹葉提取物中固形物、多糖、總酚和黃酮含量隨提取溶劑的不同而不同。以蒸餾水為提取溶劑時，固形物得率最高，其次是60 %乙醇、80 %乙醇、無水乙醇、乙酸乙酯；水提取物中多糖含量最高，其次是60 %乙醇提取物，其余3種提取物中均未檢測到多糖；以80 %乙醇為提取溶劑時，提取物中總酚含量最高，其次是無水乙醇提取物、60 %乙醇提取物、乙酸乙酯提取物、蒸餾水提取物；以60 %乙醇為提取溶劑時，提取物中黃酮含量最高，其次是80 %乙醇提取物、無水乙醇提取物、乙酸乙酯提取物、蒸餾水提取物。

3.2 DPPH·清除活性

連翹葉不同溶劑提取物的DPPH·清除活性見圖1。

由圖1可以看出，連翹葉不同溶劑提取物均具有DPPH·清除活性，在提取物濃度為0.1 mg/mL~0.6 mg/mL范圍內(nèi)，DPPH·清除率隨提取物濃度的增加而升高，在80 %乙醇提取物濃度為0.6 mg/mL時清除率達到最大值90.64 %。

3.3 OH·清除活性

圖1連翹葉不同溶劑提取物的DPPH·清除活性Fig.1 Comparison of the DPPH·scavenging activities of Forsythia suspensa leaves extracts with different solvents

圖2連翹葉不同溶劑提取物的·OH清除活性Fig.2 Comparison of the·OH scavenging activities of Forsythia suspensa leaves extracts with different solvents

連翹葉不同溶劑提取物的·OH清除活性見圖2。由圖2可以看出，連翹葉不同溶劑提取物均具有·OH清除活性，在提取物濃度為0.2 mg/mL~1.2 mg/mL范圍內(nèi)，·OH清除率隨提取物濃度的增加而升高，在80 %乙醇提取物濃度為1.2 mg/mL時清除率達到最大值76.53 %。

3.4 O2-·清除活性

連翹葉不同溶劑提取物的O2-·清除活性見圖3。

圖3連翹葉不同溶劑提取物的O2-·清除活性Fig.3 Comparison of the O2-·scavenging activities of Forsythia suspensa leaves extracts with different solvents

由圖3可以看出，連翹葉不同溶劑提取物均具有O2-·清除活性，在提取物濃度為0.2 mg/mL~1.2 mg/mL范圍內(nèi)，O2-·清除率隨提取物濃度的增加而升高，在60 %乙醇提取物濃度為1.2 mg/mL時清除率達到最大值60.28 %。

3.5 ABTS+·清除活性

連翹葉不同溶劑提取物的ABTS+·清除活性見圖4。

圖4連翹葉不同溶劑提取物的ABTS+·清除活性Fig.4 Comparison of the ABTS+·scavenging activities of Forsythia suspensa leaves extracts with different solvents

由圖4可以看出，連翹葉不同溶劑提取物均具有ABTS+·清除活性，在提取物濃度為0.1mg/mL~0.6mg/mL范圍內(nèi)，ABTS+·清除率隨提取物濃度的增加而升高，在無水乙醇提取物濃度為0.6 mg/mL時清除率達到最大值86.23 %。

3.6 FRAP法測定抗氧化活性

FeSO4濃度回歸方程：Y=0.832 1X+0.014 5，R2= 0.992。連翹葉不同溶劑提取物的鐵離子還原能力見圖5。

圖5連翹葉不同溶劑提取物的鐵離子還原能力Fig.5 Comparison of the ferric reducing antioxidant power of Forsythia suspensa leaves extracts with different solvents

由圖5可以看出，連翹葉不同溶劑提取物均具有良好的抗氧化活性，在0.2 mg/mL~1.2 mg/mL范圍內(nèi)，各提取物抗氧化活性隨提取物濃度的增加而升高，在80 %乙醇提取物濃度為1.2 mg/mL時抗氧化活性達到最大，F(xiàn)RAP值為154.28 %。

3.7連翹葉不同溶劑提取物中多糖、總酚、黃酮含量與抗氧化活性的相關(guān)性

連翹葉不同溶劑提取物中多糖、總酚、黃酮含量與抗氧化活性的相關(guān)系數(shù)見表2。

表2提取物中總酚、黃酮、多糖含量與抗氧化活性的相關(guān)性Table 2 The correlation between content of the polysaccharide，total phenols and flavonoids and the activity of different extracts from Forsythia suspensa leaves

從表2可以看出連翹葉不同溶劑提取物中總酚含量與·OH清除活性和鐵離子還原能力具有較高的相關(guān)性，黃酮含量與·OH、O2-·清除活性和鐵離子還原能力具有較高的相關(guān)性。

4結(jié)論與討論

本研究分別采用蒸餾水、60 %乙醇、80 %乙醇、乙酸乙酯和無水乙醇作為提取溶劑制備連翹葉提取物，然后采用DPPH·、·OH、O2-·、ABTS+·清除活性和FRAP 法5種方法評價連翹葉不同溶劑提取物的抗氧化活性，試驗結(jié)果表明連翹葉不同溶劑提取物均具有較強的抗氧化活性，均呈一定的量效關(guān)系，且不同溶劑提取物的抗氧化活性強弱順序隨評價方法的不同而不同。

多糖是生命有機體組成成分之一，是一類天然高分子化合物，近年來多糖已經(jīng)成為當(dāng)今醫(yī)藥領(lǐng)域的研究熱點，多項研究表明天然植物多糖具有較強的抗氧化活性[11-12]。黃酮類化合物在植物中分布廣泛，其抗氧化作用一直受到人們重視。另外，有相關(guān)研究報道酚類化合物是植物提取物具有抗氧化活性的物質(zhì)基礎(chǔ)，因此，本研究測定了連翹葉不同溶劑提取物中多糖、黃酮和總酚的含量，分析了黃酮和總酚的含量與抗氧化活性的相關(guān)性。結(jié)果表明總酚含量與·OH清除活性和鐵離子還原能力具有較高的相關(guān)性，黃酮含量與·OH、O2-·清除活性和總抗氧化能力具有較高的相關(guān)性。因只有水提取物和60 %乙醇提取物中含有多糖，若僅根據(jù)這兩種提取物中的多糖含量與這兩種提取物的抗氧化活性來分析兩者的相關(guān)性，則結(jié)果不具備代表性，因此本研究未對多糖含量與抗氧化活性的相關(guān)性進行分析。

當(dāng)今消費者越來越重視自身健康水平，追求天然養(yǎng)生保健，從植物中提取天然抗氧化劑是食品、醫(yī)藥保健和日化行業(yè)的發(fā)展趨勢。本研究表明連翹葉不同溶劑提取物有均有一定抗氧化活性，其中總酚和黃酮含量與其活性相關(guān)性較高，但仍有以下工作需要展開：①考察不同提取方法式對提取物活性的影響；②更換提取溶劑，研究提取物中多糖與其抗氧化活性的相關(guān)性；③測定提取物中其他活性成分，探討其與抗氧化活性的相關(guān)性；④研究各活性成分的相互作用，進一步探討抗氧化機理。

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Study on Antioxidant Activity of Different Solvents Extracts of Forsythia suspensa Leaves

JIA Dong-sheng，LI Rong-qiao，XIE Xiao-liang*，WEN Chun-xiu，CUI Shi-zhan，LIU Ming
（Centre of Medicinal Plant Research，Institute of Cash Crops of Hebei Academy of Agriculture and Forestry Sciences，Shijiazhuang 050051，Hebei，China）

Abstract：The objective of this study was to explore the antioxidant activities of different solvent extracts of Forsythia suspensa leaves. The Forsythia suspensa leaves were extracted with distilled water，ethanol，60 % ethanol，80 % ethanol，ethyl acetate，respectively.The contents of polysaccharide，total phenolics and flavonoids were detected by the phenol -sulphuric acid method，F(xiàn)olin -Ciocalie method and the aluminium trichloride colorimetry method；the antioxidant activity was investigated by DPPH·clearance rate，·OH clearance rate，O2-·clearance rate，ABTS+·clearance rate and FRAP assays with BHT as positive control；the correlation between the contents of the active compounds and antioxidant properties was analyzed. All the five extracts exhibited antioxidant capacities in a dose-dependent manner，the five extracts exhibited different antioxidant abilities as the assessment methods were different.The content of total phenolics and flavonoids both had a highly significant correlation with the·OH clearance rate and the ferric reducing antioxidant power，the content of flavonoids also had a highly significant correlation with the O2-·clearance rate. The extracts that extracted by 80 % ethanol and 60 % ethanol had realitively higher antioxidant activity.

Key words：Forsythia suspensa leaves；antioxidant activity；polysaccharide；total phenolics；flavonoids

收稿日期：2015-10-22

DOI：10.3969/j.issn.1005-6521.2016.02.004

*通信作者：謝曉亮（1962—），男（漢），研究員，博士，主要從事中藥資源、中藥加工研究。

作者簡介：賈東升（1982—），男（漢），碩士研究生，主要從事功能食品研究。

基金項目：河北省農(nóng)林科學(xué)院青年基金項目（A2015050101）；河北太行山區(qū)特色功能保健食品的開發(fā)研究（11231005D）；河北省中藥材產(chǎn)業(yè)體系項目（11232025D）