呋塞米對(duì)心衰大鼠心功能及心肌纖維化的影響

羅經(jīng)宏，李　玲

惠州市中心人民醫(yī)院a.老年病區(qū)，b.腫瘤放療科，廣東 惠州 516001

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呋塞米對(duì)心衰大鼠心功能及心肌纖維化的影響

羅經(jīng)宏a*，李玲b

惠州市中心人民醫(yī)院a.老年病區(qū)，b.腫瘤放療科，廣東 惠州 516001

[摘要]目的探討呋塞米對(duì)心肌梗死后心力衰竭大鼠心功能及心肌纖維化的影響。方法采用結(jié)扎冠狀動(dòng)脈左前降支構(gòu)建心肌梗死后心力衰竭大鼠模型。術(shù)后2周將34只大鼠隨機(jī)分為3組：假手術(shù)組(10只，生理鹽水)、心衰對(duì)照組(12只，生理鹽水)及呋塞米組[12只，20 mg/(kg·d)]。藥物干預(yù)4周后分別行超聲心動(dòng)圖、血流動(dòng)力學(xué)、心肌Masson染色，測(cè)定膠原容積分?jǐn)?shù)(CVF)、血漿血管緊張素Ⅱ(AngⅡ)、醛固酮以及心肌轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β1(TGF-β1)和膠原纖維Ⅲ(Collagen Ⅲ)mRNA的表達(dá)。結(jié)果與心衰對(duì)照組比較，呋塞米組的左室舒張末期壓(LVEDP)明顯升高(P<0.05)，而射血分?jǐn)?shù)(EF)升高不明顯。呋塞米組的AngⅡ、醛固酮、CVF及TGF-β1和Collagen Ⅲ mRNA的表達(dá)均顯著升高(P<0.05)。結(jié)論呋塞米能進(jìn)一步激活心衰大鼠的腎素-血管緊張素-醛固酮系統(tǒng)(RAAS)，進(jìn)而升高TGF-β水平，促進(jìn)心肌纖維化重構(gòu)，最終加劇心功能的惡化。

[關(guān)鍵詞]心力衰竭；呋塞米；心功能；纖維化重構(gòu)

0引言

心力衰竭(Heart failure，HF)為最常見(jiàn)的心血管疾病之一，其發(fā)生率隨著人口老齡化的增長(zhǎng)呈不斷升高的趨勢(shì)[1-2]。利尿劑作為唯一能減輕心衰患者液體潴留的藥物，是心衰藥物治療的基石。但由于缺乏大規(guī)模的隨機(jī)對(duì)照臨床試驗(yàn)的評(píng)價(jià)，目前利尿劑對(duì)心衰患者心功能及預(yù)后的影響仍無(wú)確定性的結(jié)論[3-4]。短、中期臨床研究結(jié)果顯示，利尿劑能改善心衰患者的心功能，減輕癥狀，增加運(yùn)動(dòng)耐量[5]，終止利尿劑的治療，心衰患者再住院及死亡發(fā)生的風(fēng)險(xiǎn)增加[6]。Eshaghian等[7]進(jìn)行的一項(xiàng)長(zhǎng)期隨機(jī)對(duì)照研究表明，使用利尿劑可以增加HF患者的死亡危險(xiǎn)，且袢利尿劑與HF死亡率呈劑量依賴(lài)關(guān)系，隨著每日呋塞米劑量增加，患者的生存率逐漸下降。心肌纖維化重構(gòu)是心衰發(fā)生發(fā)展的病理學(xué)基礎(chǔ)，而轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β(Transforming growth factor，TGF-β)能夠促進(jìn)心肌纖維化，在心衰病理性重構(gòu)中發(fā)揮重要的作用。本研究通過(guò)構(gòu)建心肌梗死后心力衰竭大鼠模型，進(jìn)一步評(píng)估呋塞米對(duì)心功能及心衰纖維化重構(gòu)的影響，現(xiàn)報(bào)道如下。

1材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物健康雄性Sprague-Dawley(SD)大鼠40只，體重(210±20)g，購(gòu)于中山大學(xué)醫(yī)學(xué)部實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。

1.2心力衰竭動(dòng)物模型的構(gòu)建大鼠稱(chēng)重后，大腿肌肉注射戊巴比妥鈉(30 mg/kg)麻醉，仰臥固定于手術(shù)臺(tái)上，氣管插管及連接小動(dòng)物呼吸機(jī)(成都泰盟科技有限公司，HX-300)給予正壓通氣(潮氣量7 mL/次，呼吸頻率70次/min，呼/吸為1/1)。左側(cè)胸部備皮及消毒后開(kāi)胸暴露心臟，用7/0帶線(xiàn)縫合針結(jié)扎冠狀動(dòng)脈左前降支，其后逐層縫合胸壁，關(guān)胸后繼續(xù)機(jī)械通氣20~30 min，待動(dòng)物蘇醒可自行翻身后拔除氣管導(dǎo)管。其中10只不結(jié)扎冠狀動(dòng)脈，其余步驟與上述相同。

1.3實(shí)驗(yàn)分組及藥物干預(yù)術(shù)后2周10只不結(jié)扎冠狀動(dòng)脈大鼠全部存活，歸入假手術(shù)組(10只)。30只建模大鼠存活24只，隨機(jī)分為2組，心衰對(duì)照組(12只)及呋塞米組(12只)。假手術(shù)組及心衰對(duì)照組采用生理鹽水，呋塞米組采用20 mg/(kg·d)呋塞米灌胃干預(yù)4周。

1.4超聲心動(dòng)圖評(píng)估心功能藥物干預(yù)4周后，行超聲心動(dòng)圖檢測(cè)，以評(píng)估大鼠的心功能。大鼠稱(chēng)重麻醉后，用ATL-HDI5000型多功能超聲診斷儀(S12探頭，頻率10 MHz)測(cè)量左室射血分?jǐn)?shù)(Ejection fraction，EF)。

1.5血流動(dòng)力學(xué)檢測(cè)行超聲心動(dòng)圖檢查后，進(jìn)一步行血流動(dòng)力學(xué)檢測(cè)評(píng)估大鼠心功能。將大鼠固定在手術(shù)臺(tái)上，剪開(kāi)頸部皮膚，分離頸部肌肉，暴露右側(cè)頸總動(dòng)脈，插入2F聚乙烯導(dǎo)管，肝素鈉生理鹽水(3 g/L)抗凝，將壓力傳感器與BIOPAC生物信號(hào)采集與處理系統(tǒng)連接，將導(dǎo)管逐漸從右頸動(dòng)脈推送至左心室，測(cè)量并記錄左室舒張末期壓(Left ventricular end-diastolic pressure，LVEDP)。

1.6血漿血管緊張素Ⅱ(AngiotensinⅡ，AngⅡ)和醛固酮濃度的測(cè)定完成血流動(dòng)力學(xué)測(cè)定后，通過(guò)腹主動(dòng)脈留取5 mL動(dòng)脈血置于含有肝素鈉的抗凝管，4 ℃下以1 610×g離心10 min，吸取上清，分裝保存于-80 ℃冰箱中備用。應(yīng)用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)對(duì)血漿AngⅡ和醛固酮進(jìn)行濃度測(cè)定。ELISA試劑盒購(gòu)自廣州速聚生物科技有限公司，并嚴(yán)格按照說(shuō)明書(shū)操作步驟進(jìn)行測(cè)定。

1.7Masson染色及膠原容積分?jǐn)?shù)測(cè)定將大鼠開(kāi)胸留取心臟標(biāo)本，在冰生理鹽水下清除心腔內(nèi)殘存血，并去除心臟大血管根部及心房，分離左右心室，用濾紙吸干后在左心室中部橫向切開(kāi)，切取約1 mm厚的心臟標(biāo)本浸泡于福爾馬林溶液(100 g/L)中固定24 h，以留待病理切片Masson染色(由中山一院病理科協(xié)助完成)，其余心臟標(biāo)本分裝保存于-80 ℃冰箱中備用。經(jīng)顯微攝像系統(tǒng)，在放大200倍情況下，隨機(jī)選取Masson染色切片中非梗死區(qū)域的5個(gè)視野輸入計(jì)算機(jī)彩色病理圖像分析系統(tǒng)(Image-Pro Plus 4.1，NIH)定量分析心肌膠原容積分?jǐn)?shù)(Collagen volume fraction，CVF)。CVF=非梗死區(qū)膠原面積/全視野面積(其中膠原面積不含血管周?chē)娣e)。

1.8心肌組織中TGF-β1、CollagenⅢ mRNA的檢測(cè)收集大鼠心肌勻漿，采用Trizol試劑抽提總RNA，測(cè)定純度、濃度后進(jìn)行實(shí)時(shí)定量熒光PCR半定量測(cè)定。各分子的引物序列見(jiàn)表1。以β-actin為內(nèi)參照，PCR反應(yīng)條件：95 ℃ 2 min，95 ℃ 15 s，60 ℃ 32 s，共40個(gè)循環(huán)。PCR產(chǎn)物于2%瓊脂糖凝膠電泳，采用Image tools凝膠分析系統(tǒng)對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行定量分析，以β-actin相對(duì)值記錄結(jié)果。

表1　TGF-β1、Collagen Ⅲ及內(nèi)參引物序列

2結(jié)果

2.1三組左室射血分?jǐn)?shù)變化與假手術(shù)組比較，心衰對(duì)照組及呋塞米組的EF明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。呋塞米組EF高于心衰對(duì)照組，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見(jiàn)圖1。

2.2三組血流動(dòng)力學(xué)變化與假手術(shù)組比較，心衰對(duì)照組和呋塞米組的LVEDP明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。呋塞米組的LVEDP高于心衰對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)圖2。

2.3三組膠原容積分?jǐn)?shù)比較Masson染色在光鏡下心肌呈紅色，膠原纖維呈藍(lán)色，細(xì)胞核呈黑色。通過(guò)計(jì)算機(jī)彩色病理圖像分析系統(tǒng)半定量分析心肌的CVF。結(jié)果顯示，與假手術(shù)組比較，心衰對(duì)照組及呋塞米組的CVF明顯升高,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。而與心衰對(duì)照組比較，呋塞米組的CVF明顯升高(P<0.05)。見(jiàn)圖3。

圖1　左室射血分?jǐn)?shù)變化

圖2　血流動(dòng)力學(xué)變化

圖3　心肌膠原容積分?jǐn)?shù)

2.4血漿AngⅡ及醛固酮結(jié)果與假手術(shù)組比較，心衰對(duì)照組的AngⅡ及醛固酮水平顯著升高(P<0.05)。而與心衰對(duì)照組比較，呋塞米組的血漿AngⅡ及醛固酮水平明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)圖4。

圖4　血漿AngⅡ及醛固酮水平

2.5心肌組織TGF-β1及CollagenⅢ mRNA表達(dá)與假手術(shù)組比較，心衰對(duì)照組TGF-β1及CollagenⅢ mRNA表達(dá)水平明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。而與心衰對(duì)照組比較，呋塞米組的TGF-β1及CollagenⅢ mRNA表達(dá)顯著升高(P<0.05)。見(jiàn)圖5。

圖5　TGF-β1及CollagenⅢ mRNA表達(dá)

3討論

利尿劑作為唯一能緩解心衰患者水鈉潴留的藥物，是心衰治療的基石。袢利尿劑作為心衰治療的老藥，國(guó)內(nèi)外有多項(xiàng)關(guān)于袢利尿劑治療心力衰竭的研究，因研究年代多較早，研究方法不完善，樣本量偏小，所以至今無(wú)法全面評(píng)估袢利尿劑在心力衰竭治療中的獲益及風(fēng)險(xiǎn)。

在目前的心衰治療中，利尿劑往往不單獨(dú)用來(lái)控制心衰的癥狀，多是在應(yīng)用利尿劑基礎(chǔ)上，加用β受體阻滯劑、ACEI或ARB及醛固酮受體阻滯劑等藥物改善心功能及心臟重構(gòu)，進(jìn)而改善心衰患者的預(yù)后。一般認(rèn)為，利尿劑短期應(yīng)用能減輕心衰患者水鈉潴留及氣促的癥狀，進(jìn)而改善生活質(zhì)量及減少再住院率。而長(zhǎng)期大劑量應(yīng)用則由于存在利尿劑抵抗，對(duì)水電解質(zhì)平衡、代謝及腎功能的影響，可能對(duì)心功能有不利的影響，增加心衰患者的死亡率。本研究應(yīng)用呋塞米4周后，心衰大鼠的EF無(wú)明顯的升高，而LVEDP較心衰對(duì)照組升高。結(jié)果表明，應(yīng)用呋塞米4周不能很好地改善心衰大鼠的心功能，甚至有加劇心功能惡化的作用。此結(jié)果與之前的研究結(jié)果相符。

RAAS及交感神經(jīng)系統(tǒng)等神經(jīng)內(nèi)分泌因素的激活在心衰的發(fā)生發(fā)展中起重要作用。心衰患者長(zhǎng)期大劑量應(yīng)用利尿劑能進(jìn)一步激活RAAS，可使血漿腎素、血管緊張素及醛固酮水平上升[8]。本研究結(jié)果顯示，應(yīng)用呋塞米4周后，血漿Ang Ⅱ及醛固酮的水平顯著升高，表明即使是較小劑量的呋塞米，在短期應(yīng)用后也能進(jìn)一步激活RAAS，不利于心功能的好轉(zhuǎn)及心衰預(yù)后的改善。

在心肌損傷部位及相鄰心肌發(fā)生纖維化是心肌僵硬度增加及心臟收縮功能不全的病理基礎(chǔ)[9]。而長(zhǎng)期應(yīng)用呋塞米對(duì)心肌纖維化的影響仍不明確。本研究結(jié)果表明，呋塞米能促進(jìn)心肌梗死后心力衰竭大鼠的心肌纖維化。TGF-β是多功能的細(xì)胞因子，廣泛參與炎癥、細(xì)胞外基質(zhì)沉積、細(xì)胞增殖、分化和生長(zhǎng)等多種細(xì)胞功能的調(diào)節(jié)。

TGF-β能夠促進(jìn)心血管和腎組織的纖維化[10]，在結(jié)構(gòu)性心臟病心肌組織中表達(dá)明顯上調(diào)[11]。本研究結(jié)果顯示，呋塞米組心肌TGF-β mRNA的水平較心衰對(duì)照組明顯上升，表明呋塞米可能通過(guò)激活TGF-β，進(jìn)而促進(jìn)心衰的纖維化重構(gòu)。

綜上所述，呋塞米能進(jìn)一步激活心力衰竭的RAAS，進(jìn)而激活下游的TGF-β水平，促進(jìn)心肌纖維化重構(gòu)，最終加劇心肌梗死后心力衰竭大鼠的心功能惡化。

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Effect of furosemide on cardiac function and myocardial fibrosis in heart failure ratsLUO Jing-honga*,LI Lingb(a.Department of Geriatrics,b.Department of Radiation,Huizhou Municipal Central Hospital,Huizhou 516001,China)

[Abstract]ObjectiveTo explore the effect of furosemide on cardiac function and myocardial fibrosis in rats with heart failure after myocardial infarction.MethodsHeart failure was produced by ligation of the left anterior descending coronary artery in rats. Two weeks after the ligation,34 rats were randomly divided into 3 groups:Sham operation group (n=10),heart failure group (n=12) and furosemide group (n=12). Echocardiography,hemodynamic measurements,Masson’s trichrome staining and collagen volume fraction,plasma angiotensin Ⅱ and aldosterone levels,the mRNA expression of TGF-β and Collagen Ⅲ in the myocardium were detected at four weeks after drug intervention.ResultsCompared with the heart failure group,the left ventricular end diastolic pressure (LVEDP) in furosemide group was significantly higher (P<0.05),but no significant difference was found in ejection fraction (EF). In addition,plasma angiotensin Ⅱ and aldosterone levels,myocardial collagen volume fraction and the mRNA expression of TGF-β and Collagen Ⅲ increased significantly(P<0.05).ConclusionFurosemide can further activate the heart failure RAAS,and increase TGF-β level,promote the reconstruction of myocardial fibrosis,ultimately exacerbate the deterioration of cardiac function.

Key words：Heart failure;Furosemide;Cardiac function;Myocardial fibrosis

DOI:10.14053/j.cnki.ppcr.201601005

*通信作者

收稿日期：2015-05-22