柚皮苷對(duì)大鼠蛛網(wǎng)膜下腔出血腦血管痙攣及神經(jīng)元凋亡的影響

蘇靜緣，李曉明

沈陽(yáng)軍區(qū)總醫(yī)院神經(jīng)外科，沈陽(yáng) 110016

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柚皮苷對(duì)大鼠蛛網(wǎng)膜下腔出血腦血管痙攣及神經(jīng)元凋亡的影響

蘇靜緣，李曉明*

沈陽(yáng)軍區(qū)總醫(yī)院神經(jīng)外科，沈陽(yáng) 110016

[摘要]目的研究柚皮苷對(duì)蛛網(wǎng)膜下腔出血(SAH)引起的腦血管痙攣以及神經(jīng)元凋亡的影響，并分析其潛在機(jī)制。方法60只SD大鼠隨機(jī)分為假手術(shù)組(Sham組)、SAH模型組(SAH組)、柚皮苷治療組(Nar組，80 mg/kg)，每組20只。各組10只大鼠取患側(cè)大腦皮質(zhì)勻漿液，檢測(cè)MDA含量；另10只大鼠斷頭取腦，固定后常規(guī)包埋后切片，HE染色測(cè)基底動(dòng)脈內(nèi)徑周長(zhǎng)。TUNEL和NEUN免疫熒光雙染檢測(cè)大鼠腦皮質(zhì)神經(jīng)元凋亡。結(jié)果與模型組比較，柚皮苷能明顯降低SAH氧化應(yīng)激指標(biāo)MDA的水平(P<0.01)；并顯著抑制腦基底動(dòng)脈血管痙攣(P<0.01)；免疫熒光結(jié)果顯示，柚皮苷能顯著減少SAH大腦皮質(zhì)神經(jīng)元凋亡的數(shù)量(P<0.01)。結(jié)論柚皮苷可以減輕大鼠SAH后早期腦血管痙攣，減少大腦皮質(zhì)神經(jīng)元凋亡的功能，其機(jī)制可能與抑制SAH后氧化應(yīng)激有關(guān)。

[關(guān)鍵詞]蛛網(wǎng)膜下腔出血；柚皮苷；血管痙攣；凋亡；氧化應(yīng)激

0引言

蛛網(wǎng)膜下腔出血(Subarachnoid hemorrhage，SAH)是最常見(jiàn)的腦血管疾病之一，而腦血管痙攣(Cerebral vasospasm，CVS)作為其嚴(yán)重和常見(jiàn)的并發(fā)癥，是其致死、致殘的重要原因。有研究表明，氧化應(yīng)激是蛛網(wǎng)膜下腔出血發(fā)生腦血管痙攣的重要原因[1]。因此，尋找新的抗氧化劑對(duì)CVS進(jìn)行早期干預(yù)對(duì)治療SAH具有重要意義。

柚皮苷(Naringin)是中草藥骨碎補(bǔ)、枳實(shí)、枳殼、橘紅的主要有效成分，是目前研究、開發(fā)、利用廣泛的天然藥物植物活性成分，具有抗氧化、抗炎、抗突變等多種活性藥理效能，其神經(jīng)保護(hù)作用在腦缺血[2]、癲疒間[1]等疾病中得到驗(yàn)證。但有關(guān)柚皮苷在SAH治療中的應(yīng)用目前尚未見(jiàn)報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)對(duì)SAH模型大鼠進(jìn)行腹腔注射柚皮苷，觀察柚皮苷對(duì)SAH引起的腦血管痙攣以及神經(jīng)元凋亡的影響，旨在為柚皮苷在SAH中的應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1材料與方法

1.1主要試劑藥物柚皮苷購(gòu)自天津士蘭科技有限公司；TUNEL試劑盒和DAPI染液購(gòu)自武漢博士德試劑公司；兔單克隆NEUN購(gòu)自santa公司；熒光二抗試劑購(gòu)自北京中杉金橋公司；MDA檢測(cè)試劑盒購(gòu)自南京建成科技有限公司。

1.2實(shí)驗(yàn)動(dòng)物和大鼠蛛網(wǎng)膜下腔出血模型的制備清潔健康雄性SD大鼠，體重210~260 g，由沈陽(yáng)軍區(qū)總醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。術(shù)前12 h禁食，自由飲水。10%水合氯醛(0.35 mL/100 g)腹腔麻醉，仰臥位固定于手術(shù)臺(tái)上，頸部正中縱向切口，暴露右側(cè)頸總動(dòng)脈、頸外動(dòng)脈、頸內(nèi)動(dòng)脈，分離右側(cè)頸總動(dòng)脈，在靠近頸外動(dòng)脈根部結(jié)扎頸外動(dòng)脈并剪斷，分離頸動(dòng)脈分叉部；夾閉頸總動(dòng)脈、頸內(nèi)動(dòng)脈。將單絲尼龍線自頸外動(dòng)脈剪口處插入，松開頸內(nèi)動(dòng)脈血管夾，通過(guò)頸內(nèi)動(dòng)脈到大腦中動(dòng)脈開口處，至有阻力感后再插入2 mm左右刺破willis環(huán)造成SAH，迅速將尼龍線拔出，整個(gè)過(guò)程不超過(guò)30 s。假手術(shù)組除不進(jìn)線外，其余過(guò)程同SAH組。正常組不干預(yù)。以大鼠有明確的SAH或血凝塊而無(wú)腦實(shí)質(zhì)損害作為建模成功標(biāo)準(zhǔn)。

1.3大鼠分組與給藥將60只SD大鼠隨機(jī)分為3組：假手術(shù)組(Sham組，20只)，SAH模型組(SAH組，20只)，柚皮苷治療組(Nar組，20只)。給藥組柚皮苷用生理鹽水稀釋后，于SAH后0.5 h和23 h時(shí)腹腔注射，濃度80 mg/kg；SAH組給予等體積生理鹽水。

1.4各組MDA活性的檢測(cè)各組10只大鼠過(guò)量麻醉致死，取腦患側(cè)皮質(zhì)組織勻漿液，根據(jù)試劑盒標(biāo)準(zhǔn)步驟以硫代巴比妥酸鈉法檢測(cè)MDA含量，以考馬斯亮藍(lán)法檢測(cè)勻漿液中蛋白含量。

1.5取材及切片各組另10只大鼠過(guò)量麻醉致死后，打開顱骨，剖取基底動(dòng)脈與其附著的腦干和整個(gè)大腦，分離腦干和基底動(dòng)脈，取包含腦干的基底動(dòng)脈上1/2段做標(biāo)本，將基底動(dòng)脈置于4%中性甲醛固定，取材時(shí)保持管壁斷面和血管壁垂直，常規(guī)脫水、透明、石蠟包埋和切片。

1.6基底動(dòng)脈測(cè)量每個(gè)基底動(dòng)脈連續(xù)取3個(gè)切片，層厚4 μm，蘇木素-伊紅(HE)染色。在光鏡下觀察，并利用Image Pro-Plus 6.0軟件系統(tǒng)測(cè)量每個(gè)基底動(dòng)脈的內(nèi)徑周長(zhǎng)，作為評(píng)價(jià)CVS程度的指標(biāo)。

1.7TUNEL和NEUN免疫熒光雙染石蠟切片常規(guī)脫蠟至水，PBS水洗后，Proteinase K 37 ℃消化15 min，PBS水洗，每張切片滴加TDT+DIG-UTP混合液，37 ℃孵育2 h，PBS水洗，滴加封閉液室溫30 min，甩去不洗，滴加抗地高辛抗體+neun抗體混合液，4 ℃過(guò)夜。PBS水洗后滴加熒光二抗(TUNEL-FITC+NEUN+TRITC)37 ℃孵育30 min。最后用DAPI復(fù)染細(xì)胞核，于熒光顯微鏡下觀察。每例大鼠隨機(jī)取6張切片，在出血側(cè)大腦皮質(zhì)區(qū)隨機(jī)選取10個(gè)不重疊高倍鏡視野(×400)，計(jì)數(shù)TUNEL和NEUN陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)。

2結(jié)果

2.1柚皮苷治療對(duì)SAH后大腦皮質(zhì)MDA含量的影響與Sham組比較，SAH組腦樣本MDA含量明顯升高(P<0.01)；與SAH組比較，Nar組的腦樣本MDA含量明顯降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。見(jiàn)表1。

表1　柚皮苷治療對(duì)SAH大腦皮質(zhì)MDA含量的影響

注：*與Sham組比較，#與SAH組比較，P<0.01

2.2柚皮苷治療對(duì)SAH基底動(dòng)脈血管痙攣的影響與Sham組比較，SAH組和Nar組基底動(dòng)脈管徑及橫截面積均明顯變小，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；管壁明顯攣縮增厚。而Nar組基底動(dòng)脈的管徑及橫截面積均較SAH組增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；血管壁的皺縮及增厚程度也較SAH組有所減輕。見(jiàn)圖1、表2。

圖1　柚皮苷治療對(duì)SAH基底動(dòng)脈血管痙攣的影響(HE染色，×100)

組別只數(shù)基底動(dòng)脈內(nèi)徑周長(zhǎng)(μm)Sham組10295.67±78.45SAH組10205.92±45.14*Nar組10245.78±35.67*#

注：*與Sham組比較，#與SAH組比較，P<0.01

2.3柚皮苷治療對(duì)SAH大腦皮質(zhì)神經(jīng)元凋亡的影響TUNEL和NEUN免疫熒光雙染結(jié)果顯示：Sham組中，TUNEL陽(yáng)性細(xì)胞較少，幾乎沒(méi)有；SAH組TUNEL陽(yáng)性細(xì)胞表達(dá)數(shù)量高于Sham組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，并且部分TUNEL陽(yáng)性細(xì)胞與NEUN共定位，說(shuō)明凋亡細(xì)胞為神經(jīng)元。Nar組的TUNEL陽(yáng)性的凋亡細(xì)胞數(shù)較SAH組明顯減少，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。見(jiàn)圖2、表3。

圖2　柚皮苷治療對(duì)SAH大腦皮質(zhì)神經(jīng)元凋亡的影響(熒光雙染，×400)

3討論

本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用大腦中動(dòng)脈穿刺法制備大鼠SAH模型，模擬人類SAH損傷，在SAH后立即給予柚皮苷進(jìn)行干預(yù)治療，經(jīng)生化水平檢測(cè)，柚皮苷能減弱SAH引起的氧化應(yīng)激指標(biāo)MDA水平的升高；

表3　柚皮苷治療對(duì)SAH大腦皮質(zhì)神經(jīng)元

注：*與Sham組比較，#與SAH組比較，P<0.01

運(yùn)用HE染色定量基底動(dòng)脈內(nèi)徑周長(zhǎng)以評(píng)估動(dòng)脈痙攣情況，結(jié)果顯示，柚皮苷能抑制腦基底動(dòng)脈血管痙攣；免疫熒光雙染技術(shù)檢測(cè)大腦皮質(zhì)神經(jīng)元凋亡情況，發(fā)現(xiàn)柚皮苷能有效抑制SAH大鼠皮質(zhì)神經(jīng)元的凋亡。

動(dòng)脈瘤破裂引起的SAH是高致死率、致殘率的神經(jīng)外科疾病，嚴(yán)重威脅人類健康[3]。首先，SAH引起的氧化應(yīng)激反應(yīng)在SAH后早期CVS的發(fā)生發(fā)展過(guò)程起重要作用[4]。SAH后早期，蛛網(wǎng)膜下腔紅細(xì)胞崩解釋放大量的氧自由基，包括超氧化物、氫氧根、過(guò)氧化氫、一氧化氮和過(guò)氧亞硝酸根等；并且還伴隨線粒體呼吸鏈、NADPH酶和抗氧化防御系統(tǒng)的破壞，降低活性氧增加量[1]。血管壁炎癥反應(yīng)誘導(dǎo)血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡，血管屏障破壞，最終引起CVS[5]。氧自由基還可導(dǎo)致共價(jià)鍵的改變，誘導(dǎo)產(chǎn)生多種縮血管物質(zhì)，如內(nèi)皮素、血栓素A2、前列腺素H2等，并拮抗NO的舒血管作用，促進(jìn)CVS發(fā)展。其次，SAH后產(chǎn)生的過(guò)量氧自由基可以直接作用于神經(jīng)細(xì)胞膜上的不飽和脂肪酸，破壞神經(jīng)細(xì)胞膜的完整性，引起神經(jīng)細(xì)胞壞死，還可以直接攻擊神經(jīng)細(xì)胞內(nèi)的線粒體，通過(guò)促進(jìn)脂質(zhì)過(guò)氧化、蛋白質(zhì)變性、鈣超載、DNA損傷等引起神經(jīng)元損傷凋亡[6]。腦組織本身對(duì)自由基損傷缺乏足夠抵抗力，需要外源性抗氧化劑來(lái)清除自由基。因此，有效的抗氧化劑有可能改善CVS和腦神經(jīng)元凋亡，進(jìn)而改善SAH。

柚皮苷是一種來(lái)自于葡萄柚的類黃酮化合物，在心肌梗死的研究中，應(yīng)用柚皮苷能有效改善線粒體脂質(zhì)過(guò)氧化和線粒體功能障礙，這說(shuō)明柚皮苷有抗氧化作用[7-8]。也有研究應(yīng)用柚皮苷治療紅藻氨酸(Kainic acid)引起的大鼠癲疒間，發(fā)現(xiàn)柚皮苷能穿過(guò)血腦屏障，發(fā)揮抗氧化、抗炎的神經(jīng)保護(hù)作用[9]。在缺氧引起的腦損傷中，應(yīng)用柚皮苷可以明顯減少HIF-1α、VEGF和Caspase-3蛋白的表達(dá)，提示柚皮苷在缺氧引起的腦功能障礙中具有神經(jīng)保護(hù)作用[10]。我們應(yīng)用柚皮苷治療SAH，發(fā)現(xiàn)其同樣能抑制氧化應(yīng)激，緩解腦血管痙攣和神經(jīng)元凋亡。

綜上所述，柚皮苷具有減輕大鼠SAH后早期CVS，減少大腦皮質(zhì)神經(jīng)元凋亡的功能，其機(jī)制可能與抑制SAH后氧化應(yīng)激有關(guān)。然而，柚皮苷對(duì)SAH后神經(jīng)炎癥反應(yīng)是否有影響目前知之甚少。因此，我們將進(jìn)一步研究柚皮苷對(duì)SAH后神經(jīng)炎癥的影響。

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Effects of naringin on cerebral vasospasm and apoptosis after subarachnoid hemorrhage in ratsSU Jing-yuan,LI Xiao-ming*(Institute of Neurology,General Hospital of Shenyang Military Command,Shenyang 110016,China)

[Abstract]ObjectiveTo study the effect of naringin on cerebral vasospasm and neuronal apoptosis induced by subarachnoid hemorrhage in rats,and analyze the potential mechanisms.MethodsSixty SD rats were randomly divided into sham operation group (Sham group),SAH group,and naringin group (Nar group,80 mg/kg),20 rats in each group. Among 10 rats in each group,ipsilateral hemispheres of brains were homogenized to detect the MDA level. Another 10 rats’ brains were dissected and fixed-embedded sections,HE staining was conducted to detect the basilar artery diameter. The neuronal apoptosis was detected by immunofluorescent double staining with TUNEL and NEUN antibody.ResultsCompared with SAH group,naringin significantly attenuated the level of MDA-an oxidative stress marker (P<0.01),and inhibited cerebral vasospasm (P<0.01). The result of immunofluorescent double staining showed that naringin significantly attenuated the neuron apoptosis in brain cortex (P<0.01).ConclusionNaringin can attenuate cerebral vasospasm and decrease the number of neuron apoptosis in brain cortex in rats after SAH,the potential mechanism may be related with anti-oxidant after SAH.

Key words：Subarachnoid hemorrhage;Naringin;Cerebral vasospasm;Apoptosis;Oxidative stress

DOI:10.14053/j.cnki.ppcr.201601002

*通信作者

收稿日期：2015-06-15