新疆野蘋果幼苗對鹽脅迫的生理響應

于瑋瑋,曹　波,龍　鴻,李　慧,李　愛,閻國榮

(天津農學院 園藝園林學院,天津　300384)

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新疆野蘋果幼苗對鹽脅迫的生理響應

于瑋瑋,曹波,龍鴻,李慧,李愛,閻國榮

(天津農學院 園藝園林學院,天津300384)

摘要：為了解新疆野蘋果鹽脅迫下的生理特性,以新疆野蘋果實生幼苗為試材,設置6個NaCl梯度(0,0.2%,0.4%,0.6%,0.8%,1.0%)處理4 h和0.4%NaCl 溶液處理7個時間梯度(0,4,8,12,16,20,24 h),采樣測定其葉片中脯氨酸(Pro) 、丙二醛(MDA)、葉綠素(Chl)和可溶性糖含量以及超氧化物歧化酶(SOD)和過氧化物酶(POD)活性的變化。結果表明:葉片中脯氨酸的含量在NaCl濃度為0.6%時和NaCl濃度為0.4%處理12 h時,達到峰值,分別比對照提高了63.1%和27.0%。隨著鹽濃度的升高和鹽脅迫時間的延長,丙二醛的含量呈現(xiàn)出逐漸增加的趨勢。葉綠素變化呈現(xiàn)出先降低后升高再降低的趨勢,所有處理中,葉綠素含量均低于正常水平?？扇苄蕴呛?、SOD和POD的活性均呈現(xiàn)先上升到達峰值后再下降的趨勢。新疆野蘋果幼苗在鹽脅迫下可通過積累脯氨酸和可溶性糖,提高SOD和POD的活性,以減緩鹽脅迫對植株的傷害且具有一定的耐鹽性。

關鍵詞：新疆野蘋果;鹽脅迫;抗氧化酶;生理響應

土壤鹽漬化是植物在自然界中遭受的非生物脅迫之一,它影響植物的分布、生長和發(fā)育[1]。據(jù)聯(lián)合國糧食與農業(yè)組織評估,世界上約有6%的鹽漬土壤,鹽脅迫是植物生長的主要限制因子之一。土壤鹽分過高影響植物生長原因有兩方面,一是土壤中的鹽分降低了植物根系的吸水能力,導致植物體內水分虧缺;二是通過蒸騰作用,過多的鹽離子進入植物體內,引起細胞離子毒害[2]。植物體可通過改變自身的形態(tài)結構、細胞結構及一系列生理變化來適應鹽脅迫[3],如產生多元醇、脯氨酸、季胺類化合物及叔胺類化合物等滲透保護物質,以保證植物逆境條件下的水分正常供應[4]。脯氨酸是植物細胞質中一種游離氨基酸,具有很高的水溶性,它可以保護細胞膜系統(tǒng),降低植物葉片細胞的滲透勢以防止細胞脫水[5]。葉綠素是一類與光合作用有關的最重要色素,鹽脅迫下,葉綠體是最敏感的細胞器之一,葉綠體片層結構逐漸降解,光合反應效率下降,從而使葉綠素含量下降[6],葉綠素含量的高低成為衡量植物耐鹽性的一個重要指標。鹽分能夠增加膜的透性,加強膜質過氧化,丙二醛是其產物之一,丙二醛的多少常作為衡量膜損傷程度的指標?？扇苄蕴鞘橇硪活悵B透調節(jié)物質,包括蔗糖、葡萄糖、果糖、半乳糖等,逆境條件下,促進淀粉降解為葡萄糖等可溶性糖。超氧化物歧化酶(SOD)和過氧化物酶(POD),是植物體內重要的抗氧化酶,具有清除活性氧自由基,保護膜系統(tǒng)的功能,常被作為判斷植物抗逆性強弱的指標[7]。

新疆野蘋果(Malussieversii(Ldb.) Roem.) 又稱塞威氏蘋果,是薔薇科蘋果屬多年生喬木,屬珍稀的第三紀殘遺植物[8],系現(xiàn)在栽培蘋果的祖先種[9]。它在長期的進化過程中形成抗寒、抗旱、抗病等優(yōu)良性狀,為果樹生產和遺傳育種提供了重要的砧木類型和基因資源。目前對新疆野蘋果耐鹽性的研究較少,本研究以新疆野蘋果實生苗為材料,對其進行鹽梯度處理,測定其葉片中脯氨酸、丙二醛、葉綠素和可溶性糖含量以及超氧化物歧化酶和超氧化物酶的活性,以期為研究新疆野蘋果的耐鹽性奠定基礎理論,為其進一步開發(fā)利用提供科學依據(jù)。

1材料和方法

1.1試驗材料

試驗采用新疆野蘋果種子層積后培育出的實生苗,種子于2012年采自新疆伊犁地區(qū)新疆野蘋果天山野果林保護區(qū)內。試驗設在2012年12月至2013年5月進行。

1.2試驗方法

1.2.1育苗新疆野蘋果種子用高錳酸鉀進行消毒,河沙經高溫滅菌(120 ℃,121.59 kPa,20 min),將種子與河沙按3∶1混勻,裝入編織袋中,于12月中旬土壤封凍前,選擇地勢高、背陰干燥處,挖層積溝,進行室外低溫層積處理,溫度2～7 ℃。翌年2月下旬,取出層積后的種子,播于蛭石∶黑炭土=3∶1混勻的基質中,待幼苗呈六葉一心時進行鹽脅迫處理。

1.2.2鹽脅迫處理選長勢一致、生長良好、無病蟲害的幼苗帶土坨連根拔起,將土輕輕拍掉,用自來水將根上基質輕輕洗干凈,保證不傷及幼根。試驗分為2組:

不同濃度NaCl溶液處理:試驗設置6個NaCl濃度梯度,分別為0,0.2%,0.4%,0.6%,0.8%,1.0%,將新疆野蘋果幼苗根部完全浸泡在不同濃度的NaCl溶液中處理4 h,蒸餾水處理(0)作為對照。

不同時間NaCl溶液處理:試驗采用NaCl溶液濃度為0.4%,試驗設置7個時間梯度,分別為0,4,8,12,16,24 h,處理方法同上,處理0 h作為對照。

每個處理30株幼苗,分別取樣測定每個處理的葉綠素含量、MDA含量、脯氨酸含量、可溶性糖含量、SOD活性及POD活性6個生理生化指標。

1.2.3測定方法每處理每個指標隨機稱取0.5 g 葉片,用液氮迅速冷凍15 min,放入-20 ℃冰箱內保存?zhèn)溆?3次重復。葉綠素含量測定采用分光光度法,MDA 含量測定采用硫代巴比妥酸(TBA)法,脯氨酸含量測定采用磺基水楊酸法,可溶性糖含量測定采用蒽酮比色法,SOD活性測定采用氮藍四唑法,POD活性測定采用愈創(chuàng)木酚法[10]。

2結果與分析

2.1鹽脅迫對新疆野蘋果幼苗脯氨酸含量的影響

植物中脯氨酸含量是抗逆研究的常用指標。在低濃度(0.2%～0.4%)鹽脅迫下,新疆野蘋果幼苗葉片中脯氨酸含量略有下降,但基本維持在正常水平。隨著鹽溶液濃度的升高,脯氨酸含量迅速升高,在NaCl 濃度為0.6%時達到峰值(10.349 μg/g),比對照提高了63.1%,隨后呈下降趨勢(圖1-A)。在0.4% NaCl溶液處理下,隨著處理時間的延長,新疆野蘋果幼苗葉片中的脯氨酸變化總體趨勢與不同濃度的處理相似。處理前期,脯氨酸濃度總體維持在正常水平,在處理12 h時達到峰值8.063 μg/g,相比對照提高了27.0%。16 h后脯氨酸含量下降幅度較為明顯(圖1-B)。

2.2鹽脅迫對新疆野蘋果幼苗丙二醛含量的影響

新疆野蘋果幼苗隨著鹽濃度的升高或脅迫時間的延長,葉片中丙二醛含量逐漸升高(圖2)。在低濃度鹽溶液處理或鹽脅迫初期,丙二醛含量增高幅度相對較小,隨著NaCl濃度的升高或鹽處理時間的延長,丙二醛含量升高幅度變大。說明低濃度鹽脅迫下或鹽脅迫初期,膜質過氧化程度較低,幼苗生長正常,表明對鹽脅迫有一定的抵御能力。

2.3鹽脅迫對新疆野蘋果幼苗葉綠素含量的影響

葉綠素含量是影響植物光合作用的重要指標之一。隨著鹽脅迫濃度的增加,葉片中葉綠素的含量呈現(xiàn)先降低后升高再降低的趨勢,但均低于對照(1.998 mg/g)(圖3-A)。NaCl濃度為0.2%時,葉綠素含量急劇下降,僅為0.764mg/g,比對照下降了61.76%。隨后,葉綠素水平又開始上升,當NaCl濃度為0.6%時恢復到1.995 mg/g后呈現(xiàn)急速下降的趨勢。

圖1　鹽脅迫對新疆野蘋果幼苗葉片中脯氨酸含量的影響

圖2　鹽脅迫對新疆野蘋果幼苗葉片中丙二醛含量的影響

NaCl濃度為0.4%時,隨著鹽脅迫處理時間的延長,新疆野蘋果幼苗葉綠素含量變化趨勢同樣呈現(xiàn)出先降低后升高再降低的變化趨勢(圖3-B)。0.4%NaCl處理4 h時,其葉綠素含量僅為1.084 mg/g,比對照降低了45.7%。隨之,葉綠素含量又逐漸升高,至12 h時,含量達到1.689 mg/g,之后葉綠素含量呈下降趨勢,24 h時,葉綠素含量降到0.991 mg/g。這說明鹽脅迫使新疆野蘋果幼苗葉綠素含量有不同程度的降低,而降低后又會逐漸升高,說明其對鹽脅迫有一定的適應能力。

圖3　鹽脅迫對新疆野蘋果幼苗葉片中葉綠素含量的影響

2.4鹽脅迫對新疆野蘋果幼苗可溶性糖含量的影響

經鹽脅迫處理后,新疆野蘋果可溶性糖含量隨鹽濃度的升高逐漸緩慢上升,當NaCl濃度為0.8%時達到最高峰,從處理前的0.168 mg/g上升到0.561 mg/g,增加了約2.3倍,隨后可溶性糖含量開始急劇下降(圖4-A)。在NaCl濃度為0.4%的情況下,隨著脅迫時間的延長,可溶性糖含量呈現(xiàn)增高趨勢,至12 h達到峰值(0.827 mg/g),比處理前增加了3.7倍(圖4-B)。這說明鹽脅迫下,新疆野蘋果幼苗可以在一定程度上積累可溶性糖,增加組織液濃度,提高滲透壓,為植物體正常生長進行氧化供能,從而緩解鹽脅迫對其產生的傷害。

圖4　鹽脅迫對新疆野蘋果幼苗葉片中可溶性糖含量的影響

由圖5可知,SOD活性(以鮮質量計)隨著NaCl溶液濃度的升高呈現(xiàn)出先升高后降低的趨勢,在濃度為0.6%時,SOD活性最高,較處理前增加了2.2倍(圖5-A)。當NaCl 濃度為0.4%時,SOD活性隨著鹽脅迫時間的延長先增加,到16 h時,活性最高,由處理前的20.122 U/g上升到60.976 U/g,提高了約2倍,隨后急速下降(圖5-B)。鹽脅迫下,新疆野蘋果SOD活性增加,有助于清除鹽脅迫造成的細胞內的自由基積累,從而保護植物的細胞膜系統(tǒng)。

圖5　鹽脅迫對新疆野蘋果幼苗葉片SOD活性的影響

2.6鹽脅迫對新疆野蘋果幼苗POD活性的影響

POD活性(以鮮質量計)隨著NaCl溶液濃度的升高呈現(xiàn)出先升高后降低的趨勢,在濃度為0.6%時,POD活性最高,由處理前的13.719 U/(g·min)上升到32.439 U/(g·min)。鹽濃度為0.4%時,POD的活性隨著鹽處理時間的延長呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢,在處理16 h時達到峰值,隨后急速下降。鹽脅迫下,新疆野蘋果幼苗可以通過提高POD活性,消除積累的大量超氧陰離子自由基、活性氧,減輕鹽脅迫對植物細胞產生的傷害(圖6)。

圖6　鹽脅迫對新疆野蘋果幼苗葉片POD活性的影響

3結論與討論

鹽脅迫能抑制植物的生長與發(fā)育,并引起一系列的代謝紊亂。植物體內脯氨酸含量是抗逆研究的常用指標,它具有調節(jié)滲透及保護細胞膜結構穩(wěn)定的作用。但脯氨酸在鹽脅迫植物體內的生理作用存在較大爭議。Sawahe等[11]研究表明,遭受鹽脅迫的植株中脯氨酸大量累積,并通過維持滲透調節(jié),穩(wěn)定蛋白質,保護細胞膜及胞質酶等在植物耐鹽性中發(fā)揮作用[12]。但張亞冰等[13]對鹽脅迫下不同耐鹽性葡萄砧木丙二醛和脯氨酸含量變化的研究認為,脯氨酸不宜作為葡萄耐鹽性鑒定的指標。本試驗中,在鹽脅迫處理前期,隨著鹽濃度升高或處理時間的延長,脯氨酸含量增加,說明新疆野蘋果遭受鹽脅迫后,能夠及時產生脯氨酸,降低葉片細胞的滲透勢,防止細胞脫水,隨著鹽濃度的升高或鹽脅迫時間的延長,其機體內受到損害,脯氨酸產量降低,這說明在一定的鹽度下,新疆野蘋果具有耐鹽性。

丙二醛是膜質過氧化產物之一,其含量水平代表膜受損害程度,它又可與細胞膜上的蛋白質、酶等結合,引起蛋白質分子內和分子間的交聯(lián),從而使蛋白失活,破壞了生物膜的結構與功能[14]。許多學者研究認為隨著鹽濃度的增加或鹽脅迫時間延長,丙二醛含量增加[14-15],這一觀點與本研究結果一致。本試驗中丙二醛含量隨著鹽處理的升高而升高,低濃度時,丙二醛含量增加比較緩慢,隨著鹽脅迫時間的延長或濃度的增加,丙二醛含量逐漸上升,可能是在短時間內,鹽離子對新疆野蘋果幼苗細胞膜的傷害小,植株能夠通過動員自身的酶類和非酶類防御系統(tǒng)保護細胞免受氧化損傷,而隨著時間的延長,鹽離子對幼苗的傷害已經超過了幼苗自身的調節(jié)能力,細胞膜被嚴重損傷,造成丙二醛含量大量積累。

鹽脅迫可提高葉綠素酶的活性,加速葉綠素降解,同時抑制葉綠素的合成[16]。本試驗中,新疆野蘋果葉片中葉綠素含量均有不同程度的降低。低鹽或鹽脅迫初期葉綠素迅速下降,之后隨著NaCl濃度的增加或鹽脅迫時間的延長,葉綠素含量恢復到接近正常水平的峰值,這可能與新疆野蘋果葉綠體對鹽脅迫較為敏感有關。然而,隨著機體內抗氧化酶及滲透調節(jié)物質在體內大量積累,修復損傷,葉綠素含量升高。Alberte等[17]認為,鹽分脅迫下,玉米葉綠素含量降低的主要原因是葉綠體片層中捕光Chla/b-pro復合體合成受抑制,隨著鹽濃度的增高,植株代謝嚴重紊亂,生長受到不可恢復的抑制,植株開始衰亡,葉片葉綠素與葉綠素蛋白間的結合變得松弛,葉綠素易被提取,引起處理后期葉綠素含量相對升高。

可溶性糖作為重要滲透調節(jié)物質,主要來源于淀粉等碳水化合物的分解以及光合產物。逆境條件下,可加速淀粉向可溶性糖的轉化,使植物體積累大量的可溶性糖,從而增加組織液濃度和滲透壓。植物細胞的滲透調節(jié)作用是植物適應環(huán)境、增強抗逆性的基礎,也是植物對鹽分脅迫的重要手段之一[18]。本試驗中,隨著鹽濃度的升高,新疆野蘋果的可溶性糖含量逐漸升高,當NaCl濃度超過0.8%時,葉片中可溶性糖含量開始下降。這說明在鹽脅迫條件下,新疆野蘋果可將體內貯存的淀粉迅速轉化為可溶性糖,對抗鹽脅迫做出積極的響應。

SOD、POD作為植物體內抗氧化酶系統(tǒng)的重要組成部分,在清除自由基方面發(fā)揮重要作用。植物體中,兩者在逆境條件下有著重要的協(xié)同作用[19]。駱建霞等[20]研究表明,多種植物在鹽脅迫下,植物體中的SOD和POD活性會升高,而高濃度的鹽脅迫下其酶活性會降低。本試驗中,在鹽脅迫最初一段時間內或低濃度的NaCl溶液下(低于0.6%),新疆野蘋果葉片中的SOD和POD活性呈上升趨勢,隨著鹽脅迫時間的延長或鹽濃度升高,SOD與POD活性下降,說明新疆野蘋果在鹽脅迫的最初階段或中低鹽濃度條件下,做出了應激的反應,表現(xiàn)為SOD和POD活性增加,消除活性氧自由基能力增加,但隨著鹽脅迫持續(xù)處理,植物體受損,從而導致SOD和POD活性呈下降趨勢。

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Physiological Responses ofMalussieversiiSeedling Under Salinity Stress

YU Weiwei,CAO Bo,LONG Hong,LI Hui,LI Ai,YAN Guorong

(College of Horticulture and Landscape,Tianjin Agricultural University,Tianjin300384,China)

Abstract：To explore the physiological response of Malus sieversii to salinity stress,Malus sieversii seedlings were cheared with six salinity levels (0,0.2%,0.4%,0.6%,0.8% and 1.0% NaCl) for 4 hours and seven time levels (0,4,8,12,16,20 and 24 hours) in 0.4% NaCl.Contents of proline,MDA,chlorophyll,and soluble sugar in leaves and activity of SOD and POD were mensurated.The results showed that proline content got the peak when NaCl concentration was 0.6% or 12 h in 0.4% NaCl,increasing 63.1% and 27.0% compared to control respectively.Increasing salt concentration and time resulted in higher levels for malondialdehyde content.Chlorophyll content was decreased first,subseguently increased and decreased once more.Among all treatment they were lower than control.Soluble sugar content and the activity of SOD and POD were increased first,then decreased.The results indicated that Malus sieversii could reduce the damage to the plant by accumulating more proline and soluble sugar and increasing the activity of SOD and POD.It was adapted to salinity stress to some extent.

Key words:Malus sieversii;Salinity stress;Antioxidant enzymes;Physiological responses

doi:10.7668/hbnxb.2016.01.027

中圖分類號：S5661.01

文獻標識碼：A

文章編號：1000-7091(2016)01-0170-05

作者簡介：于瑋瑋(1980-),女,山東即墨人,實驗師,碩士，主要從事植物種質資源利用及生理生化研究。于瑋瑋、曹波為同等貢獻作者。通訊作者：閻國榮(1957-),男,新疆哈密人,教授,博士，碩士生導師,主要從事植物種質資源利用及逆境生理研究。

基金項目：國家自然科學基金青年項目 (31300564);新疆維吾爾自治區(qū)財政林業(yè)科技專項(400173);天津市科技特派員項目(14JCTPJC00497)

收稿日期：2015-09-08