多花筋骨草高頻再生體系的建立

趙佳佳,宇　佳,遲德富

(東北林業(yè)大學(xué)林學(xué)院，中國(guó) 哈爾濱　150040)

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多花筋骨草高頻再生體系的建立

趙佳佳,宇佳,遲德富*

(東北林業(yè)大學(xué)林學(xué)院，中國(guó) 哈爾濱150040)

摘要為了建立一個(gè)高效的多花筋骨草組織培養(yǎng)再生體系，以多花筋骨草嫩葉為外植體，進(jìn)行了不同激素配比對(duì)愈傷組織誘導(dǎo)，不定芽增殖及根誘導(dǎo)．結(jié)果表明：6-BA，KT及2,4-D組合從外植體誘導(dǎo)出愈傷；6-BA和NAA組合可從外植體誘導(dǎo)出苗；6-BA可誘導(dǎo)不定芽及不定芽增殖；IBA可誘導(dǎo)根系發(fā)生．

關(guān)鍵詞多花筋骨草；外植體；愈傷組織；不定芽；組織培養(yǎng)

Establishment of a Complete Plant Regeneration System onAjugaMultiflora

ZHAOJia-jia,YUJia,CHIDe-fu*

(College of Forestry, Northeast Forestry University, Harbin 150040, China)

AbstractTender leaves ofAjugamultiflorawere used to study the effect of different concentration ratios of hormones on the callus induction, adventitious bud multiplication, root genesis and development differentiation. The results showed that callus was induced from explants on the medium with different concentration ratios of 6-BA, KT and 2,4-D. Plant developments are induced by explants on the medium with 6-BA, as well as with NAA.The best hormone for adventitious bud induction and adventitious bud multiplication is 6-BA. Root induction occurs on the medium with IBA.The goal of this research is to establish an effective regeneration system forAjugamultiflora.

Key wordsAjugamultifloraBunge; explant; callus; adventive bud; tissue culture

多花筋骨草(AjugamultifloraBunge)是唇形科(Lamiaceae)筋骨草屬(AjugaL.)常綠多年生草本植物．株高25~30 cm，輪傘花序，花冠藍(lán)紫色或藍(lán)色，較集中開放時(shí)間為4~5月，種子成熟期在5~6月[1]．該植物具有清肺止咳、緩解咽喉腫痛、清熱解毒之功效，可用于治療肝炎、腹瀉、外傷出血等病癥，對(duì)多種細(xì)菌性病癥有抑制功能[2]．近來研究發(fā)現(xiàn)該屬植物具有收縮血管、抗腫瘤、抑菌等藥理活性[3]．服用筋骨草以后，臨床檢測(cè)到的白細(xì)胞數(shù)值增加，血清中谷丙轉(zhuǎn)氨酶的活力顯著下降，表明其對(duì)病毒性疾病及腫瘤確有一定療效[4]．目前已從該屬中分離提取出甾體類、苷類、黃酮類、二萜類及多糖類等活性物質(zhì)，研究表明該植物所含的蛻皮甾酮能調(diào)節(jié)核糖體中蛋白的合成，影響核酸mRNA的合成速率，并在一定程度上調(diào)節(jié)動(dòng)物體內(nèi)的血糖血脂，降低膽固醇[5-6]．其所含的β-蛻皮甾酮是一種能調(diào)控昆蟲生長(zhǎng)發(fā)育的天然化合物，因此具有較高的潛在應(yīng)用價(jià)值．一些學(xué)者希望利用蛻皮甾酮來影響昆蟲的生長(zhǎng)發(fā)育或其生理機(jī)能，抑制昆蟲的生活力和發(fā)育速度，從而達(dá)到長(zhǎng)期有效地控制有害生物種群的目的[7-8]．

國(guó)內(nèi)外對(duì)筋骨草成分的提取和分離主要以天然植物資源為主，然而許多種類資源有限，數(shù)量急劇減少，日漸處于瀕危狀態(tài)．現(xiàn)在多花筋骨草多采用分株繁殖，無(wú)法滿足實(shí)際生產(chǎn)需要．植物離體繁殖不受地理氣候條件限制，且能降低成本、縮短生長(zhǎng)周期、節(jié)省土地，還可保證材料來源一致、遺傳背景均一、重復(fù)性好．同時(shí)，離體保存的材料不易受各種病蟲害及雜菌的侵染，有利于種質(zhì)資源的地區(qū)間及國(guó)際間的交換[9]．世界上已建成許多年產(chǎn)百萬(wàn)苗木的組織培養(yǎng)工廠，繁育了許多種組培苗，組培苗市場(chǎng)已經(jīng)國(guó)際化[10]．目前有關(guān)多花筋骨草組織培養(yǎng)方面的研究尚未見報(bào)道．本研究以多花筋骨草為試驗(yàn)材料，首先通過高效液相法分別測(cè)得其根、莖、葉的蛻皮激素含量，發(fā)現(xiàn)以葉片中最多，莖次之，根中最少．因此對(duì)多花筋骨草葉片進(jìn)行離體培養(yǎng)，脫分化獲得愈傷組織，利用細(xì)胞全能性進(jìn)行再分化，以器官發(fā)生型形成完整植株．同時(shí)通過葉片離體培養(yǎng)，不經(jīng)過愈傷組織階段，直接誘導(dǎo)分化不定芽，研究并得到其高頻再生的最適培養(yǎng)基，建立了再生頻率高達(dá)90%以上的多花筋骨草離體快繁體系．為多花筋骨草的大規(guī)模生產(chǎn)、基因轉(zhuǎn)化以及遺傳、生理、生化和病理學(xué)的研究奠定一定基礎(chǔ)．

1材料與方法

1.1試驗(yàn)材料

本試驗(yàn)材料采自遼寧省沈陽(yáng)福陵森林公園，移栽至東北林業(yè)大學(xué)林學(xué)院實(shí)驗(yàn)室．經(jīng)東北林業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院植物教研室鄭寶江副教授鑒定為多花筋骨草．

1.2試驗(yàn)方法

1.2.1外植體處理將葉片于流動(dòng)自來水下沖洗20 min；在超凈工作臺(tái)上用體積分?jǐn)?shù)(下同)為70%的酒精消毒30 s；無(wú)菌水沖洗3次；加入適量的2.5%的NaClO溶液，置100 r/min搖床上8 min；去除NaClO溶液后，再用無(wú)菌水徹底沖洗殘留的NaClO溶液，約5~6次；最后用無(wú)菌濾紙吸去外植體表面的水分；用解剖刀切去葉片邊緣，再將其切成1 cm2大小葉片，正面朝上接種于誘導(dǎo)培養(yǎng)基上．

1.2.2培養(yǎng)基及培養(yǎng)條件愈傷誘導(dǎo)培養(yǎng)基：MS+0.2 mg/L 6-BA+0.2mg/L KT+(0，0.2，0.4，0.6，0.8，1.0)mg/L 2,4-D；胚性愈傷誘導(dǎo)培養(yǎng)基：MS+1.0 mg/L 6-BA+0.2 mg/L 2,4-D；不定芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基：MS+(0.5，1.0，1.5，2.0) mg/L 6-BA；生根培養(yǎng)基：MS+(0.3，0.6，0.9) mg/L IBA；直接誘導(dǎo)不定芽培養(yǎng)基：MS+0.05 mg/L NAA+(0.5，1.0，1.5，2.0) mg/L 6-BA， 以上培養(yǎng)基均加入20 g/L 蔗糖，5.5~7.0 g/L 瓊脂，將pH值調(diào)至6.2~6.4．培養(yǎng)條件為溫度25 ℃，光照強(qiáng)度2 000 lx，光/暗周期為16 h/8 h．

1.2.3葉片愈傷組織及不定芽的誘導(dǎo)以MS為基本培養(yǎng)基，采用0.2 mg/L 6-BA+0.2 mg/L KT與(0，0.2，0.4，0.6，0.8，1.0 ) mg/L 2,4-D的激素組合對(duì)葉片進(jìn)行愈傷組織誘導(dǎo)，每種培養(yǎng)基接種20瓶，培養(yǎng)25 d，重復(fù)3次．將愈傷繼代于MS+1 mg/L 6-BA+0.2 mg/L 2,4-D的培養(yǎng)基上，進(jìn)行多花筋骨草胚性愈傷組織的誘導(dǎo)．將質(zhì)量較好的胚性愈傷組織轉(zhuǎn)接至MS+(0.5，1.0，1.5，2.0 ) mg/L 6-BA的培養(yǎng)基上，進(jìn)行不定芽的誘導(dǎo)，培養(yǎng)條件為溫度25 ℃，光照強(qiáng)度2 000 lx，光/暗周期為16 h/8 h． 觀察不定芽的誘導(dǎo)情況．

1.2.4不定芽的增殖培養(yǎng)用不定芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基誘導(dǎo)出密集的不定芽后，切成1 cm2大小的方塊進(jìn)行繼代培養(yǎng)，繼代培養(yǎng)基與誘導(dǎo)培養(yǎng)基相同，25 d后統(tǒng)計(jì)外植體分化情況．

1.2.5叢生芽的生根培養(yǎng)及移栽將誘導(dǎo)的高于4 cm的健壯幼苗轉(zhuǎn)接到生根培養(yǎng)基中．生根培養(yǎng)基為MS+(0.3，0.6，0.9)mg/L IBA，培養(yǎng)25 d后統(tǒng)計(jì)生根情況．將形成完整根系的植株移栽到已消毒的蛭石：腐殖土為1∶1的栽培基質(zhì)中，移栽前要先煉苗5~6 d，即對(duì)試管苗提高光強(qiáng)鍛煉，同時(shí)將瓶口包扎物打開，使其慢慢適應(yīng)外界環(huán)境，增強(qiáng)小苗體質(zhì)以提高移苗成活率．

1.2.6不經(jīng)愈傷階段直接獲得不定芽采用MS(蔗糖20 g/L，瓊脂5.5~7 g/L，pH值6.2~6.4)培養(yǎng)基，附加(0.5，1.0，1.5，2.0) mg/L 6-BA和 0.05 mg/L NAA的激素組合，研究直接誘導(dǎo)不定芽的高頻最佳激素組合．

1.2.7數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)25 d后進(jìn)行外植體誘導(dǎo)率的統(tǒng)計(jì)，同時(shí)觀察愈傷組織、不定芽及根的生長(zhǎng)狀況．

誘導(dǎo)率=(誘導(dǎo)出的愈傷或不定芽個(gè)數(shù)/未污染的外植體個(gè)數(shù))×100%.

2結(jié)果與分析

2.16-BA,KT與2,4-D組合對(duì)多花筋骨草愈傷誘導(dǎo)的影響

外植體培養(yǎng)8 d時(shí)葉片膨大、卷曲，15 d開始出愈傷，并且葉片由深綠變?yōu)闇\綠，愈傷(圖1A)由緊致變得疏散．培養(yǎng)25 d時(shí)植物激素 0.2 mg/L 6-BA,0.2 mg/L KT 與不同濃度2,4-D組合對(duì)多花筋骨草愈傷組織誘導(dǎo)結(jié)果見表1．由表1可見，不添加2,4-D時(shí)外植體僅僅膨大卷曲而無(wú)愈傷組織；2,4-D為 0.2 mg/L時(shí)僅在葉片傷口貼合培養(yǎng)基處有少量愈傷組織并且質(zhì)地較硬，深綠色；2,4-D為 0.4 mg/L時(shí)整個(gè)外植體被愈傷覆蓋，愈傷組織為疏松顆粒狀，黃綠色；0.8 mg/L，1.0 mg/L 的2,4-D培養(yǎng)時(shí)整個(gè)外植體被愈傷覆蓋但愈傷水澤狀部分褐化，顏色為乳白色．因此，一定范圍內(nèi)較高濃度的2,4-D有利于多花筋骨草良好愈傷組織的誘導(dǎo)；超過這一濃度范圍誘導(dǎo)出的愈傷開始出現(xiàn)水澤狀，呈乳白色，并且褐化現(xiàn)象也相對(duì)明顯；濃度較低時(shí)誘導(dǎo)的愈傷較硬、量少、顏色深．若從進(jìn)一步提高植株再生率來考慮，以0.2 mg/L 6-BA， 0.2 mg/L KT與0.4 mg/L 2,4-D激素組合誘導(dǎo)的愈傷組織為最佳．圖1B為植物激素組合誘導(dǎo)的多次繼代的松散愈傷.

表1　0.2 mg/L 6-BA，0.2 mg/L KT 與不同質(zhì)量濃度2,4-D 配比的培養(yǎng)基中愈傷誘導(dǎo)情況

2.2愈傷組織再分化的比較

先將愈傷組織接到胚性愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基內(nèi)進(jìn)行胚性誘導(dǎo)，再轉(zhuǎn)接到只含 6-BA的MS培養(yǎng)基中進(jìn)行芽誘導(dǎo)，到第7 d時(shí)部分愈傷褐化，無(wú)褐化部分愈傷變綠并伴有膨大生長(zhǎng)，25 d誘導(dǎo)出芽，但多數(shù)芽表現(xiàn)出玻璃化現(xiàn)象(圖1C)，僅有16.7%的芽正常．對(duì)愈傷組織在不同濃度6-BA中不定芽的分化率情況進(jìn)行比較，分化率結(jié)果見表2．由表2可知，6-BA為0.5 mg/L時(shí)不能誘導(dǎo)出不定芽，6-BA質(zhì)量濃度超過1.0 mg/L后即可分化出不定芽，但濃度越高玻璃化率越嚴(yán)重，僅1.0 mg/L 的6-BA能分化出少量正常苗．

表2　6-BA不同配比培養(yǎng)基中愈傷組織再分化情況

A.葉片誘導(dǎo)愈傷;B.多次繼代愈傷;C.再生芽點(diǎn);D.叢生芽;E.叢生芽;F.不定根誘導(dǎo)A.The callus induced by leaf; B.Multiple transgenerational callus; C.regeneration buds; D.bud clumps; E.bud clumps; F. induction of adventitious root圖1　多花筋骨草再生過程不同時(shí)期的生長(zhǎng)狀態(tài)Fig.1　Growth state of Ajuga multiflora Bunge in different regeneration periods

2.36-BA與NAA組合直接誘導(dǎo)不定芽

根據(jù)Stamp[11]等和von Adventivknospen[12]等研究結(jié)果，設(shè)計(jì)了NAA與6-BA激素不同配比的誘導(dǎo)不定芽試驗(yàn)．結(jié)果表明，較低濃度NAA配合低濃度的6-BA有利于多花筋骨草外植體直接誘導(dǎo)不定芽發(fā)生．除MS+0.5 mg/L 6-BA+0.05 mg/L NAA組合培養(yǎng)的葉片僅表現(xiàn)出卷曲膨大但無(wú)芽點(diǎn)無(wú)愈傷外，其他各組合均在培養(yǎng)12 d后僅切口處膨大或微有愈傷組織，之后開始顯現(xiàn)芽點(diǎn)，20 d后已有多數(shù)芽點(diǎn)，分化出小苗．表明6-BA質(zhì)量濃度在1 mg/L 以上時(shí)均可誘導(dǎo)出不定芽．而且以1 mg/L誘導(dǎo)效果最好，其他質(zhì)量濃度均有不同程度的玻璃化現(xiàn)象發(fā)生，6-BA為1.5 mg/L時(shí)玻璃化率為20%，6-BA為2.0 mg/L時(shí)玻璃化率為42%．對(duì)葉片外植體在不同質(zhì)量濃度6-BA與NAA激素組合中不定芽的分化情況對(duì)比，分化率結(jié)果見表3．

表3　6-BA 和 NAA 不同配比培養(yǎng)基中不定芽誘導(dǎo)情況

2.46-BA對(duì)多花筋骨草葉芽增殖誘導(dǎo)的影響

誘導(dǎo)出的優(yōu)質(zhì)小苗轉(zhuǎn)接到增殖培養(yǎng)基中進(jìn)行繼代，觀察葉芽增殖情況，見表4．由表4可知，不添加6-BA時(shí)，葉芽平均增殖數(shù)只有3.33個(gè)，隨6-BA質(zhì)量濃度升高葉芽增殖個(gè)數(shù)先迅速增加后平穩(wěn)升高，1.0 mg/L的 6-BA誘導(dǎo)的葉芽平均增殖數(shù)達(dá)到10個(gè)左右且無(wú)玻璃化現(xiàn)象,平均植株高度為1.1 cm，6-BA為1.5 mg/L時(shí)葉芽平均誘導(dǎo)數(shù)仍近10個(gè)，但出現(xiàn)17%的玻璃化率并且植株高度下降為0.73 cm，6-BA為2.0 mg/L時(shí)玻璃化率達(dá)到47%，植株平均高度為0.66 cm．因此，6-BA為1 mg/L時(shí)對(duì)多花筋骨草葉芽增殖誘導(dǎo)效果最佳．

表4　 6-BA不同配比培養(yǎng)基中葉芽增殖的情況

2.5完整植株的誘導(dǎo)

將長(zhǎng)度大約為2 cm的無(wú)根苗接種在MS+(0.3,0.6,0.9)mg/L IBA 的培養(yǎng)基(pH 6.2~6.4)上培養(yǎng)，2~3周后即可誘導(dǎo)出根，形成完整的植株(圖1F)．3個(gè)濃度的IBA均可誘導(dǎo)出發(fā)達(dá)的根系(表5)，IBA為1 mg/L時(shí)根長(zhǎng)可達(dá)8.0 cm，然而此根系太長(zhǎng)不利于移栽操作；0.3和0.6 mg/L的IBA有利于誘導(dǎo)良好的根系發(fā)生，即根系發(fā)達(dá)，有一定程度木質(zhì)化且長(zhǎng)度適宜.為節(jié)約材料，選擇0.3 mg/L IBA進(jìn)行根系誘導(dǎo)．

表5　 不同培養(yǎng)基中誘導(dǎo)不定芽的生根情況

2.6植株移栽成活率

選擇具有完整根系的多花筋骨草植株，除去其培養(yǎng)瓶的包扎物，在自然光照條件下煉苗5~6 d，然后洗凈根系上殘留的瓊脂，移栽于V(蛭石)∶V(腐殖土)為1∶1的栽培基質(zhì)中培養(yǎng)，并用遮陰網(wǎng)遮陰，保證所需濕度，2~3 d澆一次營(yíng)養(yǎng)液．移栽成活率可達(dá)90%以上．由此可見具有發(fā)達(dá)且一定木質(zhì)化的根系，是獲得高成活率試管苗移栽的關(guān)鍵．

3討論

本試驗(yàn)以多花筋骨草嫩葉為外植體，MS+0.2 mg/L 6-BA+0.2 mg/LKT+0.4 mg/L 2,4-D 誘導(dǎo)愈傷組織較好，所得愈傷組織質(zhì)地松脆，呈黃綠色，大多數(shù)為顆粒狀．MS+1 mg/L 6-BA可誘導(dǎo)莖芽，但用愈傷誘導(dǎo)的葉芽常伴有玻璃化現(xiàn)象，而MS+1 mg/L 6-BA+0.05 mg/L NAA有利于葉片直接分化不定芽，并且誘導(dǎo)時(shí)間較短，玻璃化現(xiàn)象相對(duì)較輕，長(zhǎng)勢(shì)良好，更適于葉芽增殖．MS+0.3 mg/L IBA適于生根培養(yǎng)，所得根系發(fā)達(dá)，有一定程度木質(zhì)化，移栽宜成活．有研究表明：植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)物質(zhì)對(duì)植物離體培養(yǎng)中的細(xì)胞脫分化、再分化及形態(tài)建成起著重要的調(diào)節(jié)作用．一般來說，2,4-D誘導(dǎo)的愈傷不能分化出芽，需轉(zhuǎn)入含有細(xì)胞分裂素的分化培養(yǎng)基中培養(yǎng)2-3代才能出芽[13-14]．研究報(bào)道6-BA促進(jìn)愈傷組織不定芽的發(fā)生，長(zhǎng)勢(shì)和成芽數(shù)量隨其濃度升高而降低，這與本試驗(yàn)結(jié)果一致[15]．因此，可將愈傷組織用高濃度6-BA誘導(dǎo)后再轉(zhuǎn)入低濃度增殖，從而獲得較好的分化率．高濃度的6-BA會(huì)導(dǎo)致嚴(yán)重的玻璃化現(xiàn)象，這與高紅兵[16]等研究一致．高濃度6-BA影響誘導(dǎo)的組培苗內(nèi)源激素失衡，從而導(dǎo)致了玻璃化現(xiàn)象的發(fā)生．

本研究初步建立了多花筋骨草離體快速繁殖體系，在短時(shí)間內(nèi)可以獲得大量無(wú)菌苗，縮短生長(zhǎng)周期、節(jié)省土地、降低成本、并且不受地理氣候條件限制．目前，有關(guān)多花筋骨草快速繁殖及組織培養(yǎng)方面的研究尚未見報(bào)道．本體系的建立為多花筋骨草次生代謝產(chǎn)物的大規(guī)模生產(chǎn)及基因轉(zhuǎn)化研究奠定了基礎(chǔ)．

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中圖分類號(hào)Q813.1+2

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼A

文章編號(hào)1000-2537(2016)01-0030-05

*通訊作者,E-mail：chidefu@126.com

基金項(xiàng)目：國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(31370649)

收稿日期：2015-04-04

DOI:10.7612/j.issn.1000-2537.2016.01.006