牛病毒性腹瀉防制

夏秀麗，姜 濤，李成波，馮 凱，任 銳，王 楠，邵洪澤*

1.榆樹市農(nóng)業(yè)綜合執(zhí)法大隊(duì)，吉林榆樹 130400；2.農(nóng)安縣農(nóng)業(yè)綜合執(zhí)法大隊(duì)，吉林農(nóng)安 130200；3.農(nóng)安縣黃魚圈鄉(xiāng)綜合服務(wù)中心，吉林農(nóng)安 130200；4.吉林省畜牧獸醫(yī)科學(xué)研究院 吉林長春 130062

牛病毒性腹瀉是危害肉牛養(yǎng)殖的主要病毒傳染病之一，國際獸疫局（OIE）將其定為B類傳染病，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部畜牧獸醫(yī)局關(guān)于公開征求《一二三類動(dòng)物疫病病種名錄（修訂征求意見稿）》擬將其列為二類動(dòng)物疫病，受到管理部門和肉牛養(yǎng)殖場戶日益重視。

1 流行狀況

牛病毒性腹瀉（BVD）又稱黏膜?。∕D），是由牛病毒性腹瀉病毒（BVDV）引起的，臨床癥狀與牛的腸炎等癥狀類似，通常表現(xiàn)為腹瀉、發(fā)熱、孕母畜流產(chǎn)等。該病最早發(fā)現(xiàn)于1946年的美國紐約，因與1953年發(fā)現(xiàn)的黏膜病病例為同一病原，1971年美國獸醫(yī)協(xié)會(huì)命名為牛病毒性腹瀉/粘膜病（BVD/MD）。目前，隨著肉牛國際貿(mào)易流通，該病已在中國、日本、韓國、智利、巴西、加拿大、美國、德國等許多國家發(fā)生成為世界各地牛群中常見病之一，其傳播速度較快，常呈地方性流行，給美國、加拿大等畜牧業(yè)發(fā)達(dá)國家?guī)砹藝?yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。

2 病原

牛病毒性腹瀉病毒（BVDV）為黃病毒科瘟病毒屬成員。病毒直徑約40～60 nm，有囊膜。根據(jù)觀察培養(yǎng)細(xì)胞的變化，可將BVDV分成引起致細(xì)胞病變和非細(xì)胞病變的兩種生物類型。從牛群中分離到的最常見生物型是非細(xì)胞病變型。根據(jù)病毒基因組5'非翻譯區(qū)的差異，分為經(jīng)典的BVDV分離株（BVDV1）和非典型BVDV分離株（BVDV2）兩種基因型，現(xiàn)有研究認(rèn)為可能是兩個(gè)獨(dú)立的種。細(xì)胞病變型產(chǎn)生于非細(xì)胞病變型，是基因重組的結(jié)果。細(xì)胞病變型毒株與相應(yīng)的非細(xì)胞病變型毒株有明顯不同，包括宿主RNA的利用及病毒NS2-3基因的復(fù)制，后者導(dǎo)致NS2-3的剪切及增加NS3表達(dá)量，可連續(xù)產(chǎn)生80000道爾頓的非結(jié)構(gòu)蛋白（NS3），這是NS2-3基因產(chǎn)物發(fā)生剪切的結(jié)果。目前NS3的致病作用尚不清楚，但致細(xì)胞病變株引起的細(xì)胞損傷似乎是細(xì)胞凋亡的結(jié)果。病牛感染非細(xì)胞病變型病毒，可在其白細(xì)胞和其他組織中檢測到NS3蛋白，這就解釋了一些持續(xù)感染的動(dòng)物免疫活性下降、發(fā)育不良及出現(xiàn)呼吸道癥狀的原因。細(xì)胞病變型毒株對(duì)腸道相關(guān)淋巴組織具有偏嗜性。病毒有4個(gè)結(jié)構(gòu)蛋白，包括衣殼蛋白和Erns、E1、E2三種囊膜糖蛋白。其中，E2是病毒囊膜上糖蛋白，免疫原性強(qiáng)，可誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生中和抗體。

3 流行病學(xué)

病畜和隱性帶毒者是該病的傳染源，病毒通過發(fā)病動(dòng)物分泌物和排泄物不斷向外界擴(kuò)散。牛、牦牛、鹿、羊等易感動(dòng)物主要通過呼吸道及消化道感染，垂直傳播也是傳播途徑之一。多數(shù)易感動(dòng)物感染后癥狀不明顯，其中犢牛易感性最高，癥狀相對(duì)明顯，且發(fā)病率和病死率都較高。動(dòng)物感染初期能在很短時(shí)間內(nèi)排毒并將病毒傳播給其它動(dòng)物，持續(xù)感染的動(dòng)物通過分泌物及排泄物排毒則是危害最嚴(yán)重的傳染源。在東北地區(qū)，該病一般在春季和冬末較為高發(fā)，對(duì)于一些老疫區(qū)隱性感染率約在50%，且與新疫區(qū)相比急性病例較少。環(huán)境濕度大、飼養(yǎng)密度大、衛(wèi)生條件差時(shí)易發(fā)病，常與其他病原菌或病毒繼發(fā)或混合感染，易造成較大損失。

4 臨床癥狀

根據(jù)臨床表現(xiàn)可分為急性型和慢性型。急性型病例多見于犢牛。典型癥狀表現(xiàn)為腹瀉，呈水樣，糞帶惡臭，有時(shí)稀便中含有黏液或血液，體溫一般為39.2～42 ℃，可持續(xù)2～3 d。表現(xiàn)精神萎靡不振，口腔黏膜（唇內(nèi)、齒齦或硬腭）和鼻黏膜糜爛或潰瘍，病牛大量流涎。懷孕母牛發(fā)生流產(chǎn)或產(chǎn)畸形胎兒，新生犢牛體質(zhì)弱易感染其他疾病。慢性型較少見，病程2～6個(gè)月，甚至1年。病畜間歇性腹瀉伴隨體溫波動(dòng)，糞便中可見帶血或有黏膜?？谇弧⒈晴R黏膜糜爛，蹄部皮膚糜爛或壞死導(dǎo)致跛行。

5 病理變化

急性型發(fā)病牛在消化道如口腔（黏膜、齒齦、舌和硬腭）、咽部可見不規(guī)則潰瘍或爛斑，個(gè)別牛在鼻鏡處也有類似癥狀。病牛分泌膿性鼻汁，眼角膜呈現(xiàn)炎性水腫、出血。剖檢可見小腸內(nèi)壁變厚、腸腺出血壞死，淋巴結(jié)腫大。慢性型表現(xiàn)不明顯，初期口腔黏膜炎癥，少有糜爛，癥狀加重后出現(xiàn)潰瘍、糜爛，逐漸和鼻鏡連成一片。母牛產(chǎn)奶量下降，最終衰竭死亡。

6 診斷

根據(jù)病牛臨床癥狀和剖檢變化可以初步診斷。但在實(shí)際工作中，確診則需進(jìn)行實(shí)驗(yàn)室診斷。

6.1 病毒的分離鑒定

多種牛源單層細(xì)胞（如腎、肺、睪丸或鼻甲細(xì)胞）可用于分離病毒，兩種生物型病毒皆可在細(xì)胞上生長良好?？赏ㄟ^電鏡觀察病毒粒子，也可通過分子生物學(xué)方法檢測鑒定病毒，該方法是最傳統(tǒng)方法，對(duì)儀器等要求比較高，周期較長。

6.2 酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)

酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）是一種依據(jù)抗原抗體的產(chǎn)生特異性反應(yīng)原理建立的方法，是最常用的血清學(xué)檢測方法，具有低成本、敏感性高、特異性強(qiáng)等特點(diǎn)。目前除了單純用于檢測抗原的ELISA方法外，檢測BVDV抗體的檢測方法也在臨床上被廣泛應(yīng)用，并已有不少商品化試劑盒問世。劉勃興等利用E.coli原核表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)了Erns蛋白，以該蛋白為包被抗原，通過優(yōu)化各反應(yīng)條件，成功建立了間接ELISA方法。該方法操作簡便，可實(shí)現(xiàn)在養(yǎng)殖場及屠宰場等基層的大批量檢測，但耗時(shí)較長，且在具體檢測過程中也應(yīng)注意假陽性的出現(xiàn)。

6.3 聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)

PCR是一種在生物體外進(jìn)行的DNA復(fù)制方法，該方法可大量擴(kuò)增特定目的片段，是對(duì)病毒、細(xì)菌等病原體進(jìn)行快速檢測和鑒定的生物學(xué)方法。隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展和新設(shè)備研發(fā)，衍生出的不同的分子生物學(xué)檢測方法，不斷提高病原檢測的敏感性、特異性，逐步減少人員操作環(huán)節(jié)，提高自動(dòng)化水平，操作更加簡便快捷。

6.3.1 RT-PCR技術(shù)

該技術(shù)可用于診斷BVD病毒RNA，將病毒RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA后用特定引物將目標(biāo)基因片段大量擴(kuò)增后進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，將得到的結(jié)果放在紫外光下觀察擴(kuò)增條帶是否與目的基因大小一致，從而對(duì)樣品的陰陽性進(jìn)行鑒定。陳姍等根據(jù)BVDV的保守序列設(shè)計(jì)了一對(duì)特異性引物，建立了一步法RT-PCR檢測方法，該方法具有快速、靈敏、特異的優(yōu)點(diǎn)，避免中間反轉(zhuǎn)錄操作環(huán)節(jié)的污染，減少假陽的出現(xiàn)。顧蓓蓓等建立套式PCR也用于該病毒的檢測，原理是設(shè)計(jì)兩對(duì)特異性引物，一對(duì)引物擴(kuò)增片段中含有另外一對(duì)引物，該方法可明顯提高檢測靈敏度，為生物制品中檢測BVDV污染提供了簡單、快速的方法。而隨著科研的進(jìn)步，常規(guī)PCR逐漸被敏感性更高，更快速的實(shí)時(shí)熒光PCR代替。

6.3.2 RT-qPCR技術(shù)

實(shí)時(shí)熒光PCR是基于定性PCR技術(shù)基礎(chǔ)上開發(fā)的新技術(shù)，目前常用的熒光定量PCR方法通常分為熒光染料法（SYB GreenⅠ）和熒光探針法（TaqMan熒光探針）兩種。其原理都是將熒光基團(tuán)加入到反應(yīng)過程中，利用熒光PCR儀采集熒光信號(hào)，通過熒光信號(hào)的積累實(shí)時(shí)監(jiān)測整個(gè)反應(yīng)過程，最后通過標(biāo)準(zhǔn)曲線分析樣品中病毒基因組的含量。該技術(shù)不僅可以實(shí)現(xiàn)對(duì)核酸模板的實(shí)時(shí)監(jiān)測，而且具有靈敏度高、特異性強(qiáng)、可靠性強(qiáng)、自動(dòng)化程度高等優(yōu)點(diǎn)。

相較于熒光染料法而言，熒光探針法的特異性和敏感性更高，并且可以進(jìn)行多重檢測，是分子生物學(xué)診斷的常用方法。彭雪松等根據(jù)GenBank中BVDV的3種基因型5′端非翻譯區(qū)（UTR）設(shè)計(jì)了2對(duì)特異性引物和3個(gè)探針，建立了BVDV基因分型三重實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR法。熒光探針法還可用于多種不同病毒的檢測。如宋爽等建立可同時(shí)檢測口蹄疫、牛病毒性腹瀉和牛傳染性鼻氣管炎三種病原的方法。候佩莉等建立可同時(shí)檢測牛病毒性腹瀉病毒、牛冠狀病毒和牛腸道病毒的方法。

6.3.3 逆轉(zhuǎn)錄-環(huán)介導(dǎo)增溫技術(shù)

該方法與PCR原理相似，是通過識(shí)別靶序列的6～8個(gè)特異區(qū)域的引物和選擇特殊功能的BstDNA聚合酶，可在恒溫條件下完成目的基因的大量擴(kuò)增，在反應(yīng)體系中加入熒光染料，不需要PCR儀等儀器，在紫外燈下或者用肉眼就可以判定結(jié)果。段進(jìn)剛等建立了針對(duì)BVDV Oregon C24V基因的RT-LAMP快速檢測的方法，可方便、快速完成檢測任務(wù)。

7 防制

病毒病沒有有效的治療藥物，因此，疫苗接種是預(yù)防和控制牛病毒性腹瀉最有效和經(jīng)濟(jì)的手段?，F(xiàn)在市場上已有滅活疫苗可用，同時(shí)為了減少牛、羊的先天性缺陷，該病流行地區(qū)應(yīng)在繁殖季節(jié)前用淘汰感染動(dòng)物的方式消滅感染源。但由于BVD大多數(shù)是隱性持續(xù)感染和免疫耐受而沒有嚴(yán)重的臨床癥狀，并不受重視，因未能及時(shí)采取積極有效的防制措施而導(dǎo)致該病不斷蔓延。陳銳等分析2014～2015年采集的內(nèi)蒙、新疆、甘肅和云南四地散養(yǎng)牛血清樣品，內(nèi)蒙和新疆牛病毒性腹瀉血清陽性率高達(dá)71.43%和57.69%，云南血清陽性率最低，也達(dá)到10%。王懷禹等在四川南充檢測結(jié)果，牛病毒性腹瀉血清陽性率18.53%。謝春芳等2014在上海也分離到牛病毒性腹瀉病毒。上述研究表明，牛病毒性腹瀉在我國的感染情況比較嚴(yán)重，已經(jīng)成為威脅養(yǎng)牛業(yè)的主要疫病之一。因此，應(yīng)通過嚴(yán)格引進(jìn)檢疫、堅(jiān)持定期監(jiān)測、加強(qiáng)飼養(yǎng)管理和環(huán)境消毒，并結(jié)合養(yǎng)殖場實(shí)際，制定科學(xué)的免疫程序，加強(qiáng)生物安全措施，實(shí)施由穩(wěn)定控制到逐步凈化的防制策略。