5-烯去甲斑蝥素氧代單乙酸及其鹽的合成和抗肝癌活性

賈　佳，高　磊，王先恒，胡喬喬，馬佳慧，徐昆侖，趙長闊

(遵義醫(yī)學(xué)院 藥學(xué)院，貴州 遵義　563099)

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基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究

5-烯去甲斑蝥素氧代單乙酸及其鹽的合成和抗肝癌活性

賈佳，高磊，王先恒，胡喬喬，馬佳慧，徐昆侖，趙長闊

(遵義醫(yī)學(xué)院 藥學(xué)院，貴州 遵義563099)

[摘要]目的 為降低斑蝥素毒副作用并改善其水溶性，設(shè)計(jì)合成新型斑蝥素的衍生物及其鹽。方法 以呋喃為原料，與順丁烯二酸酐在有機(jī)溶劑中反應(yīng)得到5-烯去甲斑蝥素，此產(chǎn)物在有機(jī)溶劑中經(jīng)LiAlH4還原反應(yīng)得到5-烯去甲斑蝥素二醇，后者與溴乙酸乙酯反應(yīng)得到5-烯去甲斑蝥素氧代單乙酸乙酯，該酯在堿性條件下水解生成相應(yīng)的去甲斑蝥素氧代單乙酸及其鹽。用磺酰羅丹明(sulforhodamine B，SRB)染色法對最終產(chǎn)物進(jìn)行抗肝癌活性測試。結(jié)果 新型斑蝥素的衍生物——5-烯去甲斑蝥素氧代單乙酸及其鹽抗肝癌活性測試的結(jié)果表明，5-烯去甲斑蝥素氧代單乙酸及其鹽的濃度5 μg/mL對人肝癌細(xì)胞Hep G2具有一定抑制效果，抑制率分別為50%和65%。結(jié)論 本研究方法制得的5-烯去甲斑蝥素氧代單乙酸及其鹽具有一定的抗肝癌效果。

[關(guān)鍵詞]斑蝥素；5-烯去甲斑蝥素；合成；抗肝癌活性

斑蝥素(cantharidin，C10H12O4)是從昆蟲斑蝥體內(nèi)提取的抗癌物質(zhì)，對肝癌、卵巢癌、食道癌等有良好療效，與其他常用抗腫瘤藥物相比，有許多優(yōu)點(diǎn)，如斑蝥素和它的類似物不抑制人體的免疫功能，并可提升人體白細(xì)胞數(shù)量等[1]。斑蝥素是通過改變腫瘤細(xì)胞蛋白質(zhì)活性，抗腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移，引起細(xì)胞周期阻滯，抑制腫瘤生長，從而使其死亡[1-2]。其抗腫瘤機(jī)制為通過減少癌細(xì)胞對氨基酸的攝取，抑制蛋白質(zhì)的合成，刺激淋巴細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、多形核細(xì)胞產(chǎn)生白細(xì)胞介素，從而提高機(jī)體免疫力，同時(shí)殺傷腫瘤細(xì)胞而達(dá)到治療目的。但斑蝥素對泌尿系統(tǒng)和腸胃系統(tǒng)有較大毒副作用，斑蝥素既是抗腫瘤的活性成分，同時(shí)也是毒性的主要成分。對其進(jìn)行恰當(dāng)?shù)慕Y(jié)構(gòu)修飾，會(huì)在保留其抗腫瘤活性的基礎(chǔ)上，大大降低對機(jī)體的毒副作用[1-3]。

近年來，對斑蝥素進(jìn)行結(jié)構(gòu)修飾后用于治療癌癥的衍生物被陸續(xù)報(bào)道，并開始運(yùn)用于臨床治療。如去甲斑蝥素，比斑蝥素少了2個(gè)甲基，其毒性明顯降低，而治療作用卻優(yōu)于斑蝥素[4]。另外還有斑蝥素鈉、去甲斑蝥素鈉、甲基斑蝥胺等[4-6]，這些經(jīng)結(jié)構(gòu)改造的藥物雖然各有優(yōu)點(diǎn)，但卻有其共同的缺陷，主要表現(xiàn)在水溶性較差，生物利用度不高。目前用于臨床治療的斑蝥素藥物(如斑蝥素鈉、去甲斑蝥素鈉等)中，均以開環(huán)方式存在，從化學(xué)結(jié)構(gòu)上看，開環(huán)化合物的溶解度較大，其體內(nèi)生物利用度也高。因此對斑蝥素的結(jié)構(gòu)進(jìn)行修飾，尋找高效低毒的斑蝥素抗腫瘤藥物，具有重要的工業(yè)應(yīng)用價(jià)值和廣泛的市場前景。本研究擬設(shè)計(jì)合成一種新型水溶性去甲斑蝥素衍生物，期望在其結(jié)構(gòu)中引入水溶性基團(tuán)，增加其生物利用度，達(dá)到增加治療效果的目的。

1試劑與儀器

1.1試劑順丁烯二酸酐、呋喃、LiAlH4、NaH(分析純，國藥集團(tuán))；石油醚、溴代乙酸乙酯、乙醚、乙酸乙酯、四氫呋喃(分析純，成都科龍化工)；NaOH(分析純，上海化學(xué)試劑廠)。

1.2儀器81-2型暗箱三用紫外分析儀(上海司樂儀器有限公司)；Varian 400MHz核磁共振波譜儀(安捷倫科技有限公司)。

2方法與結(jié)果

2.15-烯去甲斑蝥素氧代單乙酸及其鹽的合成5-烯去甲斑蝥素氧代單乙酸及其鹽的合成路線(見圖1)。

圖1　5-烯去甲斑蝥素氧代單乙酸鈉鹽合成

2.1.1中間體A(5-烯去甲斑蝥素)的制備[7-8]

先將順丁烯二酸酐用研缽研細(xì)，再稱取12.02 g研細(xì)的順丁烯二酸酐并置于三口瓶中，逐漸加入90 mL乙醚至研細(xì)的順丁烯二酸酐完全溶解，再于13 min內(nèi)緩慢滴加13 mL 呋喃。滴畢，控制溫度38 ℃下反應(yīng)1 h,有白色沉淀生成，繼續(xù)反應(yīng)24 h后，抽濾，得白色固體17.46 g，收率為85.75%。熔點(diǎn)：122~123 ℃，Rf(保留因子)：0.52 (展開劑為：石油醚∶乙酸乙酯=3∶1)；1HNMR(400 MHz, CDCl3) δ: 3.18 (s, 2H), 5.47 (s, 2H), 6.58 (s, 2H)(見圖2)。

2.1.2中間體B(5-烯去甲斑蝥素二醇)的制備[9-10]

稱取已生成的中間體A 2.0 g于燒瓶中并加入25 mL除去水的THF(四氫呋喃)，冰浴攪拌至溶液澄清。分4批緩慢加入LiAlH4(689 mg)，反應(yīng)24 h。加乙酸乙酯、水淬滅反應(yīng)，反應(yīng)穩(wěn)定后抽濾，用乙酸乙酯、水反復(fù)濾洗3次，合并濾液并旋干，得5-烯去甲斑蝥素二醇(中間體B)的粗品2.05 g，收率>100%。Rf：0.21 (展開劑為乙酸乙酯)；1HNMR(400 MHz, CDCl3) δ: 6.39 (s, 2H), 4.68 (s, 2H), 3.76~3.83 (m, 4H), 1.95 (t, 2H)(見圖3)。

2.1.3中間體C(5-烯去甲斑蝥素氧代單乙酸乙酯)的制備取1.3 g上述中間體B粗品于燒瓶中并加25 mL除去水的THF，冰浴攪拌，再加入NaH (60%, 513 mg)和溴乙酸乙酯(1.4 mL)，反應(yīng)24 h，抽濾，旋干，得粗品1.7 g。利用柱色譜層析原理將粗品通過硅膠柱進(jìn)行分離，得到中間體C 0.45 g，收率為45%。Rf：0.67 (展開劑為石油醚：乙酸乙酯= 5:1)；1HNMR(400 MHz, CDCl3) δ: 6.37~6.42 (m, 2H), 4.76~4.77 (t, 2H),4.21 (m, 2H), 4.09 (m, 2H), 3.78 (m, 2H), 3.63~3.65 (m, 2H), 1.93~2.08 (m, 2H), 1.27~1.31 (t,3H)(見圖4)。

2.1.4化合物D(5-烯去甲斑蝥素氧代單乙酸)的制備取中間體C 0.45 g于燒瓶中，加入9 mL水，攪拌，再加入NaOH 148 mg，反應(yīng)24 h 。加10% HCl調(diào) pH 4~5，旋干。通過硅膠柱分離得化合物D 0.31 g，收率為78%。Rf：0.25(乙酸乙酯∶乙醇=5∶1)；1HNMR(400MHz, D2O) δ: 6.35 (s, 2H), 4.68~4.76 (d, 2H), 3.56~4.05 (m, 6H), 1.88~2.01 (m, 2H)(見圖5)。

2.1.5化合物E(5-烯去甲斑蝥素氧代單乙酸鈉鹽)的制備取化合物D 0.50 g溶于5 mL甲醇和1 mL水中，加入NaOH 160 mg，溶劑旋干，通過硅膠柱分離可得化合物D的鈉鹽，即化合物E 0.52 g，收率為95%。1HNMR(400 MHz, D2O) δ: 6.30 (s, 2H), 4.75~4.79 (d, 2H), 3.32~3.81 (m, 6H), 1.77~1.90 (m, 2H);13CNMR(100 MHz, D2O) δ: 177.70, 135.23, 80.75, 80.51, 70.08, 69.68, 60.59, 41.17, 38.83(見圖6、7)。

2.2抗肝癌活性測試

2.2.1抗肝癌活性測試方法磺酰羅丹明(sulforhodamine B, SRB)染色法：接種細(xì)胞時(shí)，每種細(xì)胞平行接種2塊96孔板，一塊為對照板，另一塊為實(shí)驗(yàn)板。CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)20 h后，將對照板取出，用50%三氯乙酸(TCA)固定，待測。實(shí)驗(yàn)板中加入待測化合物(終濃度分別為5、2.5、1.25、0.625、0.313 μg/mL)，并設(shè)陽性對照組、實(shí)驗(yàn)組和溶劑對照組。每組設(shè)5個(gè)復(fù)孔，繼續(xù)培養(yǎng)48 h后取出培養(yǎng)板，以預(yù)冷50% TCA固定(終濃度為10%)，4 ℃冰箱放置1 h后，以去離子水沖洗，自然晾干，用100 μL 0.4%的SRB染色，10 min后用0.1%乙酸沖洗、晾干，最后用200 μL 10 mmol/L的緩沖Tris堿液(pH 10.5)溶解，在酶標(biāo)儀上選擇530 nm處測吸光度值(OD值)，按照下列公式計(jì)算生長抑制率(inhibition ratio，IR)。

腫瘤細(xì)胞生長抑制率=

2.2.2抗肝癌活性測試結(jié)果以斑蟊素為陽性對照，5-烯去甲斑蝥素氧代單乙酸(D)及其鈉鹽(E)對人肝癌細(xì)胞Hep G2的抑制活性為，當(dāng)濃度c=5 μg/mL時(shí), 化合物D和E對人肝癌細(xì)胞Hep G2的抑制率分別為50%和65%(見表1)。

表1各化合物對人肝癌細(xì)胞Hep G2的抑制率(%)

指標(biāo) 化合物斑蟊素5-烯去甲斑蝥素氧代單乙酸(D)5-烯去甲斑蝥素氧代單乙酸鈉鹽(E)抑制率855065

3討論

本文通過藥物設(shè)計(jì)并合成得到了一類新型水溶性去甲斑蝥素衍生物D及其鈉鹽E。合成共分4步反應(yīng)，每步反應(yīng)均采用全合成的方法，制備簡單，可操作性強(qiáng)，使用的原料價(jià)格便宜。單步收率分別為：85.75%、100%、45%和78%，綜合收率在30%以上。通過核磁共振氫譜、碳譜對其結(jié)構(gòu)進(jìn)行了表征，結(jié)果與預(yù)期結(jié)構(gòu)相吻合。證實(shí)了目標(biāo)化合物的成功制備。

結(jié)果發(fā)現(xiàn)，由于其結(jié)構(gòu)中引入水溶性基團(tuán)(-COOH)，因此增加了其在水中的溶解性。同時(shí)對反應(yīng)產(chǎn)物D及其鹽E進(jìn)行了抗肝癌活性測試，當(dāng)濃度c=5 μg/mL時(shí), 化合物D和E對人肝癌細(xì)胞Hep G2的抑制率分別為50%和65%，說明所設(shè)計(jì)的5-烯去甲斑蝥素氧代單乙酸及其鈉鹽對人肝癌細(xì)胞Hep G2具有一定的抑制效果。然而其抑制作用比斑蝥素弱，提示斑蝥素結(jié)構(gòu)中的羰基或?yàn)楸仨毜乃幮Щ鶊F(tuán)，這為以后的結(jié)構(gòu)修飾指明了方向。

[參考文獻(xiàn)]

[1] 婁田田，杜鵑，陳祥盛，等. 斑蝥素及其衍生物抗腫瘤機(jī)制的研究進(jìn)展[J]. 亞太傳統(tǒng)醫(yī)藥, 2012, 8(10): 205-207.

[2] 安中原，王正，趙越. 斑蝥素及其衍生物的抗腫瘤進(jìn)展[J]. 亞太傳統(tǒng)醫(yī)藥, 2009, 5(1):128-130.

[3] 楊石康,蔡興華,林心舜. 斑蝥素瘤體注射治療原發(fā)性肝癌的療效觀察[J].福建中醫(yī)藥, 1994, 25(4): 8.

[4] 董環(huán)文，劉超美，李科. 新型去甲斑蝥素衍生物的設(shè)計(jì)合成及體外抗腫瘤活性[J]. 第二軍醫(yī)大學(xué)藥學(xué)學(xué)報(bào), 2008, 29(12): 1470-1474.

[5] 鄧麗萍. 1.3-偶極環(huán)加成: 去甲斑蝥素衍生物的合成和構(gòu)效關(guān)系[D]. 杭州: 浙江大學(xué), 2007.

[6] 董環(huán)文，劉超美，李科，等. 新型去甲斑蝥素衍生物的設(shè)計(jì)合成及體外抗腫瘤活性[J]. 第二軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報(bào), 2008, 29(12): 1470-1474.

[7] 張沛，趙長闊，張志軍, 等. 5,6-二氫去甲斑蝥素氧代單乙酸鈉的合成方法和抗肝癌活性[P]. 中國發(fā)明專利: CN201510476728.6 (2015).

[8] Deng L, Chen Y G, Tian S K. Catalytic asymmetric desymmetrization of prochiral and meso compounds[P]. United States Patent: 7053236 (2004).

[9] Scott B, Wolfgang D, Paul R H, et al. Copper-catalysed meso-bislactone ring opening using Grignard and mixed triorganozinc reagents[J]. Tetrahedron Letters, 2006, 47(40): 7205-7208.

[10]Vo-Quang Y, Carniato D, Vo-Quang L, et al. A convenient one-pot synthesis of polyenic enol ethers[J]. J Chem Soc Chem Commun, 1983, 24(24): 1505-1506.

[收稿2015-12-01;修回2016-01-09]

(編輯：王靜)

The synthesis and anti-hepatoma activity of 5-en-norcantharidin oxo-mono-acetic acid and its salt

JiaJia,GaoLei，WangXianheng,HuQiaoqiao，MaJiahui，XuKunlun，ZhaoChangkuo

(Department of Pharmacy，Zunyi Medical University，Zunyi Guizhou 563099，China)

[Abstract]Objective A new type of norcantharidin derivatives and its salt were designed and synthesized to reduce the toxicity and improve the water solubility of the cantharidin. Methods Furan reacted with maleic anhydride to generate 5-en-norcantharidin in organic solvent In. the following, 5-en-norcantharidin was reduced by lithium aluminium hydride (LiAlH4) to afford 5-en-norcantharidin glycol; Then, using tetrahydrofuran as the solvent, 5-en-norcantharidin glycol was reacted with ethyl bromoacetate in the catalysis of sodium hydride to produce 5-en-norcantharidin oxo-mono-acetate. Finally the oxo-mono-acetate was hydrolyzed in alkaline condition, to generate the target compound oxo-mono-acetic acid and its salt. Anti hepatoma activity was tested by sulforhodamine B staining method. Results The result of anti-hepatoma activity showed that the 5-en-norcantharidin oxo-mono-acetic acid and its salt had shown 50% and 65% inhibition on hepatoma HepG2 cells respectively when its concentration of 5 μg/ml. Conclusion The 5-en-norcantharidin oxo-mono-acetic acid and its salt showed a moderate inhibition on Hep G2 cells, which can be used as a kind of high efficiency and low toxicity of cantharidin antitumor drug candidate.

[Key words]Cantharidin；5-en-norcantharidin；synthesis；anti-hepatoma activity

[中圖法分類號(hào)]R914

[文獻(xiàn)標(biāo)志碼]A

[文章編號(hào)]1000-2715(2016)01-0026-04

[通信作者]趙長闊，男，博士，副教授，研究方向：新藥研發(fā)及化學(xué)仿制藥工藝研發(fā)，E-mail:zck7103@hotmail.com。

[基金項(xiàng)目]貴州省科技廳聯(lián)合基金資助項(xiàng)目(NO：黔科合LH字[2014]7545)。