厚樸冷浸液對白色念珠菌生物膜作用的體外研究

向曉波，周艷萌，馮琳穎，董　華

(1.遵義醫(yī)學(xué)院附屬口腔醫(yī)院 口腔外科,貴州 遵義　563099；2.遵義醫(yī)學(xué)院 微生物與免疫學(xué)教研室，貴州 遵義　563099；3.遵義醫(yī)學(xué)院 醫(yī)學(xué)與科技學(xué)院，貴州 遵義　563099)

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臨床醫(yī)學(xué)研究

厚樸冷浸液對白色念珠菌生物膜作用的體外研究

向曉波1，周艷萌2，馮琳穎3，董華3

(1.遵義醫(yī)學(xué)院附屬口腔醫(yī)院 口腔外科,貴州 遵義563099；2.遵義醫(yī)學(xué)院 微生物與免疫學(xué)教研室，貴州 遵義563099；3.遵義醫(yī)學(xué)院 醫(yī)學(xué)與科技學(xué)院，貴州 遵義563099)

[摘要]目的 觀察厚樸冷浸液對白色念珠菌(Candida albicans)黏附性及生物膜形成的影響，以探討其能否用于治療白色念珠菌相關(guān)齲病。方法 運(yùn)用微孔板法復(fù)制白色念珠菌體外黏附及生物膜模型，采用XTT減低法評價(jià)不同濃度厚樸冷浸液對白色念珠菌黏附、生物膜形成的影響；光鏡下觀察生物膜內(nèi)白色念珠菌形態(tài)學(xué)變化。結(jié)果 厚樸冷浸液對白色念珠菌的黏附具有抑制作用，在同一時(shí)間點(diǎn)其抑制作用具有濃度依賴性，但是隨著時(shí)間延長，各組藥物對白色念珠菌的黏附作用均減弱；厚樸冷浸液對白色念珠菌形成的生物膜具有抑制作用，其作用具有濃度依賴性，除7.80 mg/L濃度組外，其余各組與陰性對照組相比均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P< 0.05),125.00 mg/L濃度組對生物膜的抑制率達(dá)到60.27%；厚樸冷浸液使生物膜內(nèi)白色念珠菌脫落，芽管形成受抑制。結(jié)論 厚樸冷浸液對白色念珠菌早期黏附和中期生物膜形成有抑制作用。

[關(guān)鍵詞]厚樸；白色念珠菌；黏附；生物膜；齲病

齲病(dental caries)俗稱蟲牙、蛀牙，是多種因素作用下發(fā)生于口腔硬組織的慢性細(xì)菌性疾病，是口腔常見疾病，也是人類最普遍的疾病之一。齲洞中的微生物都是以牙菌斑生物膜的形式定植在齲洞中[1]，然而在齲洞中主要的致齲菌除了變形鏈球菌、乳酸桿菌、放線菌等，還存在一定數(shù)量的真菌，其中白色念珠菌(C.albicas)占優(yōu)勢[2]，尤其在幼兒齲及無齲牙菌斑中白色念珠菌的檢出率較高[3]，中老年人齲洞中的白色念珠菌檢出率也很高[4]。同時(shí)，白色念珠菌也是再治療根管中檢出率最高的真菌[5]。厚樸為木蘭科植物厚樸和凹葉厚樸的干燥樹皮、根皮及枝皮，具有廣譜抗菌、抗腫瘤、抗病毒、抗?jié)円约翱鼓茸饔肹6]。田玉珠等[7]研究發(fā)現(xiàn)厚樸活性成分之一的和厚樸酚對根管內(nèi)白色念珠菌生物膜有抑制作用，但是厚樸對白色念珠菌有沒有抑制作用未見報(bào)道。本試驗(yàn)擬通過微孔板法探討厚樸冷浸液對白色念珠菌黏附、生物膜形成的影響，為厚樸冷浸液用于口腔治療白色念珠菌相關(guān)齲病提供基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1材料與方法

1.1菌種白色念珠菌(C.albicas)標(biāo)準(zhǔn)株ATCC10231由遵義醫(yī)學(xué)院醫(yī)學(xué)微生物學(xué)與免疫學(xué)實(shí)驗(yàn)室饋贈。

1.2藥物與試劑厚樸購于遵義醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院中藥局。RPMI1640培養(yǎng)基(GIBCO公司), 酵母蛋白胨葡萄糖(YPD)液體培養(yǎng)基依據(jù)文獻(xiàn)配制[8]。XTT(sigma公司)，二甲基亞砜(DMSO，sigma公司，分析純)。

1.3儀器96孔培養(yǎng)板(美國康寧公司)，DHP-9162型電熱恒溫培養(yǎng)箱(上海一恒科技有限公司)，MK3酶標(biāo)儀(美國，Thermo公司)。

1.4方法

1.4.1C.albicas菌懸液的制備菌種先接種于沙氏培養(yǎng)基復(fù)蘇、分離純化，然后挑取單個(gè)菌落轉(zhuǎn)種于YPD液體培養(yǎng)基中，30 ℃搖床培養(yǎng)過夜后，用PBS清洗3次，再用RPMI1640培養(yǎng)基稀釋，麥?zhǔn)媳葷峁苷{(diào)整菌液濃度至1×106個(gè)細(xì)胞/mL。

1.4.2厚樸冷浸液(相當(dāng)于生藥濃度為1 g/mL)的制備秤取厚樸粉末10 g，加三蒸水10 mL放4 ℃冰箱浸泡15 d，濾紙過濾除去不溶物質(zhì)，用無菌濾器過濾，分裝后放入-20 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩Ｊ褂脮r(shí)用RPMI1640培養(yǎng)液按二倍稀釋法將厚樸冷浸液稀釋成以下濃度: 125.00、62.50、31.25、15.63和7.81 mg/L。

1.4.3藥物抗白色念珠菌黏附作用的測定將菌液調(diào)整為1×106個(gè)細(xì)胞/mL濃度，按照100μL/孔的量接種于96孔板中，37 ℃分別培養(yǎng)1、2和3 h，吸棄培養(yǎng)基，PBS洗去未黏附的菌，加入上述各濃度藥液100 μL/孔，每組設(shè)8個(gè)復(fù)孔，同時(shí)設(shè)陰性對照孔(僅含菌液)，37 ℃再培養(yǎng)24 h，XTT法檢測490 nm時(shí)各孔的吸光度值(A值)，重復(fù)3次，取平均值。

1.4.4藥物抗24 h白色念珠菌生物膜的測定將菌液調(diào)整為1×106個(gè)細(xì)胞/mL濃度，96孔板第2～10孔接種100 μL/孔，第11孔加入RPMI1640培養(yǎng)液100 μL，37℃培養(yǎng)24 h后，棄去培養(yǎng)基及浮菌，用PBS沖洗3次，于第2～9孔加入上述各濃度藥液100 μL/孔，第10～11孔各加RPMI1640培養(yǎng)液100 μL(第10孔為陰性對照孔、11孔為空白對照孔)。繼續(xù)培養(yǎng)24 h，XTT法檢測波長490 nm處各孔吸光度(A值)。每個(gè)濃度組均設(shè)8個(gè)復(fù)孔，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，計(jì)算抑菌率。抑制率=(陰性對照孔A值-實(shí)驗(yàn)組A值)/(陰性對照孔A值-空白對照孔A值)×100(%)[5]。

1.4.5厚樸冷浸液對生物膜型白色念珠菌形態(tài)結(jié)構(gòu)的影響將上述濃度菌液加入24孔板內(nèi)蓋玻片上，37 ℃培養(yǎng)24 h，構(gòu)建24 h白色念珠菌生物膜。24 h后棄去培養(yǎng)基及浮菌，用PBS沖洗3次，加入125.00 mg/L厚樸冷浸液1 mL/孔，陰性對照孔加入RPMI1640培養(yǎng)液1 mL/孔，37 ℃再培養(yǎng)24 h，光學(xué)顯微鏡直接觀察生物膜型白色念珠菌形態(tài)結(jié)構(gòu)的變化。

2結(jié)果

2.1不同濃度厚樸冷浸液對白色念珠菌黏附的影響厚樸冷浸液對白色念珠菌的黏附有抑制作用，在同一時(shí)間點(diǎn)其抑制作用具有濃度依賴性，但是隨著時(shí)間延長，各組藥物對白色念珠菌的黏附作用均減弱(見表1)。125 mg/L濃度組在各個(gè)時(shí)間點(diǎn)對白色念珠菌黏附均有明顯抑制作用，與陰性對照組相比有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。而其余各濃度組僅在1 h時(shí)對白色念珠菌黏附均有明顯抑制作用，與陰性對照組相比有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

組別厚樸冷浸液濃度(mg/L)厚樸冷浸液處理時(shí)間(h)1A值抑制率(%)2A值抑制率(%)3A值抑制率(%)陰性對照組00.38±0.04—0.35±0.06—0.45±0.05—厚樸冷浸液組125.000.22±0.03*42.370.27±0.06*23.850.37±0.05*16.8362.500.24±0.04*30.420.29±0.0517.320.40±0.0811.7131.250.25±0.03*33.200.30±0.0314.960.40±0.0512.0015.630.27±0.07*30.220.31±0.0612.750.42±0.036.137.810.30±0.09*19.920.33±0.055.930.42±0.026.50

*與陰性對照組比較，P< 0.05。

2.2不同濃度厚樸冷浸液對白色念珠菌生物膜形成的影響厚樸冷浸液對白色念珠菌形成的生物膜具有抑制作用，其作用具有濃度依賴性，除7.8 mg/L濃度組外，其余各組與陰性對照組相比均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，見表2)。

藥物濃度(mg/L)A值抑制率(%)00.37±0.05—125.000.15±0.02*60.2762.500.23±0.06*38.5831.250.22±0.04*40.7815.630.23±0.04*38.457.810.30±0.0518.95

*與陰性對照組比較，P<0.05。

2.3厚樸冷浸液對生物膜型白色念珠菌形態(tài)結(jié)構(gòu)的影響光鏡下，真菌對照組形成良好的生物膜，膜內(nèi)白色念珠菌主要表現(xiàn)為菌絲相，形態(tài)規(guī)則，假菌絲交織成網(wǎng)狀(見圖1A)。厚樸冷浸液組生物膜結(jié)構(gòu)受到破壞，一些區(qū)域的白色念珠菌已經(jīng)脫落，膜內(nèi)白色念珠菌的數(shù)量明顯減少，芽管、假菌絲形成較對照組明顯減少，芽管形態(tài)不規(guī)則(見圖1B)。

A：真菌對照組；B：厚樸冷浸液組。圖1　不同組別的生物膜型白色念珠菌形態(tài)結(jié)構(gòu)(×400)

3討論

白色念珠菌是臨床最常見的條件致病真菌，調(diào)查結(jié)果顯示念珠菌感染占真菌感染的73.4%，其中白念珠菌感染最常見[9]。目前國內(nèi)治療白色念珠菌感染的常用藥物包括氟康唑、制霉菌素等，但是由于臨床上長期應(yīng)用，白色念珠菌的耐藥菌株不斷出現(xiàn)。大量研究表明，中藥在抗真菌感染中具有一定優(yōu)勢[10]。許多學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)單味中藥、中藥方劑、中藥有效成分如牡丹皮[11]、黃連解毒湯[12]、紫檀芪[8]等對白色念珠菌生物膜均具有抑制作用。生物膜的形成經(jīng)歷了黏附、微菌落形成、微菌落融合、生物膜形成與生物膜成熟等階段，其中黏附是生物膜形成至關(guān)重要的一步，故抑制黏附是抗白色念珠菌生物膜感染的關(guān)鍵措施[13]。而白色念珠菌的酵母態(tài)和菌絲態(tài)間的可逆轉(zhuǎn)換對其致病性及生物膜的形成過程也起著重要作用，菌絲態(tài)對于維持成熟生物膜結(jié)構(gòu)的完整性和維持多層體系是非常重要的[14]。

本試驗(yàn)采用微孔板法觀察不同濃度的厚樸冷浸液對白色念珠菌黏附的影響，發(fā)現(xiàn)實(shí)驗(yàn)所取5個(gè)濃度組在1 h抗黏附試驗(yàn)中對白色念珠菌的黏附均有明顯抑制作用(P<0.05)，并且作用具有濃度依賴性。但是隨著時(shí)間延長，作用減弱。試驗(yàn)采用微孔板法復(fù)制生物膜體外模型，觀察不同濃度的厚樸冷浸液對白色念珠菌24 h生物膜的影響，發(fā)現(xiàn)實(shí)驗(yàn)所選5個(gè)濃度對白色念珠菌的生物膜均有抑制作用，最高濃度125 mg/L組對白色念珠菌生物膜的抑制率達(dá)到了60.27%。同時(shí)光鏡下觀察到對照組形成良好的白色念珠菌生物膜，膜內(nèi)白色念珠菌主要表現(xiàn)為菌絲相，這是白色念珠菌成膜的關(guān)鍵。厚樸冷浸液組生物膜結(jié)構(gòu)受到破壞，膜內(nèi)白色念珠菌出現(xiàn)脫落，菌量明顯減少，芽管、假菌絲形成較對照組明顯減少，芽管形態(tài)不規(guī)則。本實(shí)驗(yàn)證明了厚樸冷浸液能夠抑制白色念珠菌早期的黏附和其芽管的形成，從而影響生物膜形成，但其通過哪些機(jī)制影響?zhàn)じ胶脱抗苄纬蛇€需進(jìn)一步證實(shí)。

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[收稿2015-11-11;修回2015-12-14]

(編輯：王福軍)

Effects ofmagnoliaecortexquenching liquid oncandidaalbicansbiofilm

XiangXiaobo1,ZhouYanmeng2,FengLinying3,DongHua3

(1.Department of Stomatological Surgery,The Affiliated Stomatology Hospital of Zunyi Medical University, Zunyi Guizhou 563099, China; 2.Department of Microbiology and Immunology, Zunyi Medical University, Zunyi Guizhou 563099, China; 3.Medicine&Technology School, Zunyi Medical University,Zunyi Guizhou 563099, China)

[Abstract]Objective To observe the impact of Magnoliae cortex quenching liquidon Candida albicans adhesion and biofilm formation in order to assess its anti-caries effect.Methods The 96-well microtiter plates were used to produce C. albicans in vitro adhesion and biofilm model, XTT reduction assay was applied to evaluate the effect of the different concentrations of Magnoliae cortex quenching liquid on C. albicans adhesion and biofilm formation. Light microscope was employed to observe the morphological changes of Candida albicans in biofilm. Results Magnoliae cortex quenching liquid had inhibitory effect on C. albicans adhesion, its action was concentration-dependent at the same time point. However, with the time prolonged, the drug for C. albicans adhesion effect weakened. Magnoliae cortex quenching liquid had inhibitory effect on C. albicans biofilm formation; its action was concentration dependent.Compared with negative control group had statistical significance (P﹤0.05) in addition to the concentration of 7.8 mg/l group. Concentration of 125.00 mg/l group of inhibition rate reached 60.27 %. Magnoliae cortex quenching liquid led to C. albicansin the biofilm shedding and inhibited germ tubes formation. Conclusion Magnoliae cortex quenching liquid has inhibitory effect on C. albicans early adhesion and middle of biofilm formation.

[Key words]magnoliae cortex; candida albicans; adhesion; biofilm; dental caries

[中圖法分類號]R379.4

[文獻(xiàn)標(biāo)志碼]A

[文章編號]1000-2715(2016)01-0051-03

[基金項(xiàng)目]貴州省中醫(yī)藥管理局資助項(xiàng)目(NO：ky2015-9)。