金釵石斛總生物堿對Aβ25-35所致大鼠海馬組織Aβ含量的影響

張明輝，李　菲，張　瑋，吳　芹，石京山

(遵義醫(yī)學院 藥理學教研室暨基礎藥理省部共建教育部重點實驗室，貴州 遵義　563099)

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基礎醫(yī)學研究

金釵石斛總生物堿對Aβ25-35所致大鼠海馬組織Aβ含量的影響

張明輝，李菲，張瑋，吳芹，石京山

(遵義醫(yī)學院 藥理學教研室暨基礎藥理省部共建教育部重點實驗室，貴州 遵義563099)

[摘要]目的 觀察金釵石斛總生物堿(Dendrobium nobil Lindl. Alkaloids, DNLA)對β-淀粉樣蛋白(Aβ25-35)誘導的大鼠癡呆模型海馬組織Aβ含量的影響。方法 雄性Sprague-Dawley大鼠隨機分為4組：假手術組、模型組、DNLA低劑量(40 mg/kg/d)及高劑量組(80 mg/kg/d)。預給藥7 d后，雙側海馬注射 Aβ25-35(1 μg/μL, 5 μL)，假手術組注射同體積生理鹽水，術后繼續(xù)灌胃14 d，Morris水迷宮檢查大鼠空間學習成績， Western blot法檢測海馬組織Aβ1-42含量，β淀粉樣前體蛋白(APP)和β淀粉樣蛋白前體蛋白裂解酶1(BACE1)的蛋白表達。結果 雙側海馬注射Aβ25-35后，模型組大鼠空間學習成績明顯比假手術組差，給予DNLA后可改善大鼠空間學習成績；模型組大鼠海馬Aβ1-42、APP和BACE1蛋白量均明顯高于假手術組；與模型組比較，DNLA給藥可明顯減少海馬組織Aβ1-42的含量，降低APP和BACE1蛋白在海馬組織的表達(P<0.05)。結論 DNLA具有改善Aβ25-35所致大鼠癡呆模型的作用，可能與減少海馬組織Aβ1-42產(chǎn)生有關。

[關鍵詞]金釵石斛總生物堿；β-淀粉樣蛋白；β淀粉樣前體蛋白；β淀粉樣蛋白前體蛋白裂解酶1；大鼠

阿爾茨海默病(Alzheimer’s disease, AD)是一種進行性中樞神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病，主要病理學特征為細胞外β淀粉樣蛋白(β-amyloid, Aβ)沉積、細胞內(nèi)tau蛋白過度磷酸化等[1]。減少AD患者腦中Aβ含量一直是AD治療學的研究重點和熱點。

我國名貴中藥材金釵石斛(DendrobiumnobilLindl.)具有“壯筋骨，補腎益力”等功效，其主要化學成分包括生物堿、多糖、酚類、揮發(fā)油等[2-3]。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)金釵石斛總生物堿(DendrobiumnobilLindl. Alkaloids, DNLA)具有降低AD模型大鼠海馬神經(jīng)元內(nèi)tau蛋白異常磷酸化的作用[4]，然而是否能夠降低AD腦中Aβ的含量仍不清楚，故本研究擬采用Aβ25-35誘導AD大鼠模型，觀察DNLA對該模型大鼠空間學習的作用及腦內(nèi)Aβ產(chǎn)生的影響。

1材料與方法

1.1實驗動物SPF級Sprague-Dawley (SD)大鼠，雄性，體重250~300 g購自第三軍醫(yī)大學大坪實驗動物中心[合格證號：SCXK(渝)2012-0005]。

1.2主要試劑及儀器設備金釵石斛總生物堿采用醇提毛細管氣象色譜法分析，根據(jù)對應的標準離子色譜峰檢測生物堿的百分比，總生物堿純度71.2%，其中主要為石斛堿(90.7%)，石斛次堿次之。

Aβ25-35：美國Sigma公司；APP抗體：美國Abcam公司；Aβ1-42、BACE1、β-actin抗體：life sciences公司；BCA蛋白含量測定試劑盒：上海捷瑞生物工程有限公司；ECL發(fā)光劑：江蘇碧云天生物技術研究所；大鼠腦立體定位儀：深圳瑞沃德生命科技有限公司；全自動凝膠圖像分析儀：美國BIO-RAD公司。

1.3動物分組及處理SD大鼠40只隨機分為4組，分別為假手術組、模型組、DNLA低劑量組和DNLA高劑量組。假手術組及模型組灌胃生理鹽水10 mL/kg/d、DNLA低、高劑量治療組分別灌胃DNLA(40、80 mg/kg/d)，預給藥1周后制模。采用7%水合氯醛(5 mL/kg)腹腔注射麻醉后固定于大鼠腦立體定位儀上，常規(guī)皮膚消毒切開頭部皮膚，海馬進針坐標為：前囟后3.5 mm，中線旁2.0 mm，硬腦膜下3.5 mm(根據(jù)大鼠腦立體定位圖譜確定)。定位后用牙科鉆鉆開顱骨，微量注射器垂直進針，雙側海馬緩慢注入5 μL Aβ25-35(1 μg/μL，無菌生理鹽水配制，37 ℃孵育7 d使成聚集態(tài))，留針5 min，緩慢退出注射器后縫合皮膚切口，假手術組注入等體積無菌生理鹽水，制模后繼續(xù)給藥2周。

1.4Morris水迷宮檢測大鼠空間學習能力給藥結束前4 d，行Morris水迷宮實驗。該系統(tǒng)由水池、攝像頭和電腦3部分組成，水池直徑120 cm，水深為平臺上2 cm。固定水下平臺的位置，記錄大鼠從不同入水點至找到平臺所需時間(即逃避潛伏期)，以比較各組大鼠空間學習的能力，每天4次，連續(xù)4 d。

1.5Western blot法檢測蛋白含量行為學實驗結束后，各組大鼠麻醉后斷頭于冰上迅速分離海馬組織，提取組織總蛋白，BCA法測定蛋白濃度?？偟鞍捉?jīng)PAGE凝膠電泳分離后轉至PVDF膜上，孵育Aβ1-42、APP、BDNF抗體，ECL發(fā)光，凝膠成像系統(tǒng)拍照分析。

2結果

2.1DNLA對大鼠空間學習能力的影響各組大鼠的學習成績隨著訓練天數(shù)逐漸變好，訓練至第3~4天各組數(shù)據(jù)出現(xiàn)差異，模型組大鼠逃避潛伏期明顯長于假手術組，而給予DNLA后可縮短逃避潛伏期(P<0.05,見圖1)。

。圖1　金釵石斛總生物堿對大鼠空間學習的影響

2.2DNLA對大鼠海馬組織Aβ1-42含量的影響雙側海馬注射聚集態(tài)Aβ25-352周后大鼠海馬組織內(nèi)Aβ1-42的含量顯著增加(P<0.05)。給予DNLA 3周可明顯降低模型大鼠海馬組織內(nèi)Aβ1-42的含量(P<0.05，見圖2)。

2.3DNLA對大鼠海馬組織APP和BACE1蛋白表達的影響為分析DNLA降低模型大鼠海馬組織Aβ含量的機制，本研究觀察了淀粉樣前體蛋白(amyloid precursor protein, APP)及與Aβ產(chǎn)生密切相關的酶BACE1的蛋白表達水平。結果表明，模型大鼠海馬組織內(nèi)APP和BACE1蛋白表達水平均高于假手術組(P<0.05)，而給予DNLA后均可降低其蛋白的表達水平(P<0.05)，提示DNLA可通過減少Aβ的產(chǎn)生從而降低海馬組織中Aβ1-42的含量(見圖3)。

±s,n=9; *:P<0.05 vs Sham; #: P<0.05 vs Model?！　D2　金釵石斛總生物堿對大鼠海馬組織Aβ1-42含量的影響

±s, n=9; *:P<0.05 vs Sham; #: P<0.05 vs Model。圖3　金釵石斛總生物堿對大鼠海馬組織APP和BACE1蛋白表達的影響

3討論

研究發(fā)現(xiàn)，Aβ25-35聚集可激活膠質(zhì)細胞產(chǎn)生大量炎癥因子，導致神經(jīng)細胞損傷甚至死亡[5-6]。采用海馬內(nèi)注射聚集態(tài)Aβ25-35，誘發(fā)腦內(nèi)炎癥[7]及神經(jīng)細胞損傷[8]模擬AD的動物模型已廣泛用于AD的研究。在AD病理情況下，APP主要經(jīng)β-分泌酶和γ-分泌酶剪切產(chǎn)生39-43個氨基酸的Aβ片段[9-10]，其中Aβ1-42聚集性最強，最具神經(jīng)細胞毒性。Aβ1-42聚集與AD 患者腦中神經(jīng)元的變性密切相關，因此抑制Aβ1-42產(chǎn)生與聚集可防止AD的發(fā)生。本實驗結果顯示，大鼠雙側海馬注射聚集態(tài)的Aβ25-35后2周，大鼠空間學習能力下降，同時海馬組織中Aβ1-42和APP水平明顯高于對照組，給予DNLA后，明顯改善模型大鼠的空間學習成績，并降低模型大鼠海馬Aβ1-42和APP的蛋白水平。

β-分泌酶是Aβ產(chǎn)生的關鍵限速酶，體內(nèi)主要的β分泌酶是β淀粉樣前體蛋白裂解酶1(β-site APP cleaving enzyme, BACE1)。其活性的高低對Aβ的產(chǎn)生有重要作用[11-13]。研究發(fā)現(xiàn)，在過度表達BACE1的APP轉基因動物模型中，Aβ的產(chǎn)生顯著增多[14]；而在敲除BACE1基因的動物模型中Aβ幾乎完全消失[15]。通過抑制BACE1以降低腦內(nèi)Aβ水平，被認為是防治AD的一個有效靶點。本實驗結果顯示模型組大鼠海馬組織內(nèi)的BACE1蛋白水平明顯高于假手術組，各DNLA給藥組大鼠海馬內(nèi)BACE1的蛋白表達量均顯著低于模型組，提示DNLA具有抑制BACE1蛋白高表達的作用。

我們先前的研究發(fā)現(xiàn)DNLA能減輕AD的兩大特征性病理變化：減輕AD樣炎癥模型大鼠海馬tau蛋白磷酸化、抑制海馬周圍神經(jīng)細胞凋亡[4]；本次結果提示DNLA改善Aβ25-35誘導的大鼠空間學習能力，減少模型大鼠海馬組織Aβ1-42的含量，揭示DNLA極有可能是防治AD的中藥有效成分，為深入研究DNLA抗AD提供了基礎。

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[收稿2015-11-23;修回2015-12-29]

Effect ofDendrobiumnobilLindl. Alkaloids on the product of Aβ in hippocampus of rats induced by Aβ25-35

ZhangMinghui，LiFei，ZhangWei，WuQin，ShiJingshan

(Department of Pharmacology, Key Laboratory for Basic Pharmacology of Ministry of Education, Zunyi Medical University, Zunyi Guizhou 563099, China)

[Abstract]Objective To observe the effect of Dendrobium nobil Lindl. Alkaloids (DNLA) on the production of β-amyloid (Aβ1-42) in hippocampus of rats induced by Aβ25-35. Methods Forty Sprague-Dawley rats were randomed into four groups: sham, model, DNLA 40 mg/kg/d and 80 mg/kg/d groups. Rats were orally pre-treated with different doses of DNLA for 1 week, and then model rats were injected 5 μl Aβ25-35(1 μg/μl) into the lateral hippocampus, sham rats were injected equal volume of normal saline instead of Aβ. After operation rats were given DNLA or distill water for another 2 weeks. Morris water maze was used to test the spatial learning performance of rats; the content of Aβ1-42and the protein expression of β-amyloid precursor protein (APP) and β-site amyloid precursor protein-cleaving enzyme 1 (BACE1) in hippocampi were assayed by western blot. Results After injecting Aβ25-35into hippocampus, model rats decreased the spatial learning capability compared with sham rats, rats treated with DNLA significantly improved the performance. The content of Aβ1-42and the protein expression of APP and BACE1 in hippocampus of model rats were significantly increased. However, the content of Aβ1-42and the protein expression of APP and BACE1 were reduced in the hippocampi of DNLA-treated rats. Conclusion DNLA could ameliorate the spatial learning performance of Aβ25-35induced AD rat model, and this effect may be related to decreases in generation of Aβ1-42.

[Key words]Dendrobium nobil Lindl. Alkaloids; β-amyloid; β-amyloid precursor protein; β-site amyloid precursor protein-cleaving enzyme 1; rats

[中圖法分類號]R285.5

[文獻標志碼]A

[文章編號]1000-2715(2016)01-0018-04

[通信作者]石京山，男，博士，教授，博士生導師，研究方向：神經(jīng)藥理學，E-mail:shijs@zmc.edu.cn。

[基金項目]國家自然科學基金資助項目(NO：30660208)；貴州省科技基金資助項目(NO：黔科合JZ字[2014]2016)；貴州省教育廳自科項目(NO:黔教科2010043)；遵義醫(yī)學院院招標課題基金項目(NO: F-612)。