異氟烷對人精子運(yùn)動(dòng)功能和頂體反應(yīng)影響研究

劉慶德++王志豐++虞利民

【摘要】目的：觀察異氟烷對人精子運(yùn)動(dòng)功能、體外獲能以及精子頂體反應(yīng)的影響，對有生育要求的男性提供臨床用藥依據(jù)。方法：收集我院男科門診就診的男性精子標(biāo)本，從中篩選出18份活力正常精子的精液作為標(biāo)本，每例精液均分成3份，分別放置于3個(gè)試管中，分別給予11%異氟烷（ISO1組）、22%異氟烷（ISO2組）和空氣作為對照組，把所有的有機(jī)玻璃箱放置于孵箱培養(yǎng)5h，對精子的運(yùn)動(dòng)、獲能、頂體反應(yīng)進(jìn)行評價(jià)。結(jié)果：11%和22%濃度的異氟烷作用于精子5h以后，與對照組相比，精子的運(yùn)動(dòng)活力、直線速度、曲線速度、平均速度均明顯下降，P<005，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，ISO1組和ISO2組比較，ISO2組的下降更為明顯，呈現(xiàn)劑量依賴關(guān)系，即隨著濃度的升高，精子的運(yùn)動(dòng)功能抑制越明顯。對于精子獲能的影響，與對照組比較，兩種濃度的異氟烷均明顯地抑制精子的體外獲能，P均<005，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，ISO1組和ISO2組比較無明顯差異，P>005。兩組精子發(fā)生頂體反應(yīng)的百分率均較處理前明顯增加，P<005，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。但是處理后兩組間比較無明顯差異。結(jié)論：異氟烷能夠抑制精子的運(yùn)動(dòng)和獲能，并且隨著濃度的增加，抑制作用增強(qiáng)；異氟烷對精子頂體反應(yīng)影響不明顯。

【關(guān)鍵詞】麻醉；異氟烷；精子運(yùn)動(dòng)；精子獲能；頂體反應(yīng)

【中圖分類號】R917+.2【文獻(xiàn)標(biāo)志碼】A

近些年來，隨著各種科技的發(fā)展，麻醉學(xué)也迅猛發(fā)展起來，全身麻醉藥在臨床治療中的應(yīng)用范圍也越來越廣，由于麻醉藥物副作用較多，社會和學(xué)術(shù)界目前對其安全性普遍關(guān)注。對于全身麻醉藥物的研究，多集中在神經(jīng)毒理學(xué)方面，已經(jīng)較為深入，但是其生殖毒性的研究尚有不足，其機(jī)制也尚不能完全闡釋清楚。目前臨床上吸入麻醉藥的應(yīng)用相當(dāng)廣泛，異氟烷是臨床非常常見的一種吸入性全身麻醉藥，相關(guān)報(bào)道認(rèn)為，異氟烷在細(xì)胞水平上不但可以影響細(xì)胞的分化，還會破壞染色體DNA結(jié)構(gòu)[1]。本研究觀察異氟烷對人精子運(yùn)動(dòng)功能、體外獲能以及精子頂體反應(yīng)的影響，對有生育要求男性提供臨床用藥依據(jù)。1材料與方法

11儀器與試劑

計(jì)算機(jī)輔助的精液分析儀（CASA）應(yīng)用由北京中科恒業(yè)科技有限公司生產(chǎn)的彩色精子自動(dòng)分析儀（型號：ZKPACS-E型），精子培養(yǎng)液HTF液應(yīng)用美國Irvine公司生產(chǎn)的產(chǎn)品，異氟烷（商品名活寧，國藥準(zhǔn)字H20059911，上海雅培制藥有限公司生產(chǎn)，規(guī)格100mL）。

12精子懸液制備

精子標(biāo)本來源于我院男科門診就診的男性，從中篩選出18份活力正常精子的精液作為標(biāo)本，本研究中，精子標(biāo)本精子活力均>80%，活率在90%以上，精子密度>50×106/mL，異常精子形態(tài)不足15%，其余指標(biāo)均符合WHO診斷標(biāo)準(zhǔn)。18份實(shí)驗(yàn)標(biāo)本提供者年齡在25～39歲，平均年齡（3119±405）歲，排除心、腎等系統(tǒng)嚴(yán)重疾病，禁欲3～ 5 d，取樣本前48h未服用可能會對精子產(chǎn)生影響的藥物或食物，如酒、咖啡等。取精的方式為手淫取精，在精液液化后，采用上游法進(jìn)行優(yōu)化，然后用HTF培養(yǎng)液把精子密度調(diào)節(jié)到（40～80）×106/mL。

13實(shí)驗(yàn)方法及分組

將18例正?；盍Φ木簶?biāo)本，每例精液均分成3份，分別放置于3個(gè)試管中，分別給予11%異氟烷（ISO1組）、22%異氟烷（ISO2組）和空氣作為對照組。將培養(yǎng)皿分別放在不同的有機(jī)玻璃箱內(nèi)，密閉玻璃箱，把含5%CO2、95%空氣的混合氣體作為載氣，調(diào)節(jié)揮發(fā)罐的刻度，異氟烷暴露濃度分別為11%、22%，把所有的有機(jī)玻璃箱放置于37℃的孵箱中，保持恒定溫度，培養(yǎng)5h[2]。

14精子運(yùn)動(dòng)功能的評價(jià)

對所有精子的活動(dòng)狀態(tài)進(jìn)行密切觀察，計(jì)算分析精子的各項(xiàng)運(yùn)動(dòng)參數(shù)，包括曲線速度（VCL）、精子運(yùn)動(dòng)活力（a+b）%、平均速度（VAP）、頭部側(cè)向運(yùn)動(dòng)平均振幅（ALH）、直線速度（VSL）。根據(jù)WHO（1999）的標(biāo)準(zhǔn)可以把精子的活力分成a、b、c、d 4個(gè)級別：a級代表精子的活動(dòng)非常好，能夠快速向前呈直線運(yùn)動(dòng)；b級代表精子活動(dòng)尚可，能夠向前直線運(yùn)動(dòng)；c級代表精子活動(dòng)力比較一般，不能向前直線運(yùn)動(dòng)，只能曲線運(yùn)動(dòng)；d級代表精子活動(dòng)能力比較差，不能做任何向前運(yùn)動(dòng)，只可以在原地蠕動(dòng)。臨床上一般以（a+b）%作為精子活動(dòng)力大小的指標(biāo)。

15精子獲能以及頂體反應(yīng)的評價(jià)

評價(jià)方法是根據(jù)精子和金霉素（CTC）熒光結(jié)合類型而定，共有三種結(jié)果，分為三型[3]：精子未能獲能，頂體仍然完整，為F型；精子雖然獲能，但是頂體后區(qū)無熒光或者僅僅有微弱的熒光，為B型；精子獲能，發(fā)生頂體反應(yīng)，頂體已經(jīng)不完整，為AR型。精子的獲能程度以B型和AR型合計(jì)數(shù)所占的比例來計(jì)算。

16統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS160軟件對所有數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，計(jì)量資料比較用t檢驗(yàn)，計(jì)數(shù)資料比較用卡方檢驗(yàn)，P<005認(rèn)為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2結(jié)果

21異氟烷對精子運(yùn)動(dòng)功能的影響

11%和22%濃度的異氟烷作用于精子5h以后，與對照組相比，精子的運(yùn)動(dòng)活力、直線速度、曲線速度、平均速度均明顯下降，P<005，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；ISO1組和ISO2組比較，ISO2組的下降更為明顯，呈現(xiàn)劑量依賴關(guān)系，即隨著濃度的升高，精子的運(yùn)動(dòng)功能抑制越明顯。和對照組相比，頭部側(cè)向運(yùn)動(dòng)平均振幅無明顯差異，P>005。見表1。

22異氟烷對精子體外獲能的影響

與對照組比較，兩種濃度的異氟烷均明顯地抑制精子的體外獲能，P均<005，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；ISO1組和ISO2組比較無明顯差異，P>005。見圖1。

23異氟烷對頂體反應(yīng)的影響

對22%的異氟烷和對照組已經(jīng)完全獲能的精子標(biāo)本急性暴露l個(gè)小時(shí)，應(yīng)用考馬斯亮藍(lán)染色法對精子頂體反應(yīng)進(jìn)行評價(jià)。結(jié)果顯示，兩組精子發(fā)生頂體反應(yīng)的百分率均較處理前明顯增加，P<005，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。但是處理后兩組間比較無明顯差異，P>005。見圖2。endprint

3討論

全身性麻醉藥物對生殖的毒性目前在國內(nèi)外都有部分的初步的研究，尤其是對吸入麻醉藥的研究更多更深入，但是結(jié)果仍然存在爭議，病理機(jī)制也未能完全闡釋，目前普遍認(rèn)為，吸入性麻醉藥發(fā)揮作用的一個(gè)主要靶點(diǎn)就是A型γ-氨基丁酸受體，能夠使其對的敏感性增加，導(dǎo)致鈣離子通道開放，細(xì)胞膜發(fā)生超級化，進(jìn)而抑制中樞發(fā)揮麻醉效果[4，5]。

相關(guān)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示[6，7]，雄性小鼠反復(fù)地吸入氟烷能夠?qū)е戮拥幕温拭黠@增多。精子的運(yùn)動(dòng)功能是精子功能的一種直觀的、綜合性的表現(xiàn)，是研究很多藥物的藥理學(xué)性質(zhì)的重要的指標(biāo)之一[8，9]。在正常生理狀態(tài)下，受精過程順利完全的基礎(chǔ)就是精子的正常運(yùn)動(dòng)，只有精子運(yùn)動(dòng)正常，才能使精子和卵細(xì)胞成功結(jié)合，從而完成受精。本文研究結(jié)果表明，11%和22%濃度的異氟烷作用于精子5h以后，與對照組相比，精子的運(yùn)動(dòng)活力、直線速度、曲線速度、平均速度均明顯下降，P<005；ISO1組和ISO2組比較，ISO2組的下降更為明顯，呈現(xiàn)劑量依賴關(guān)系，即隨著濃度的升高，精子的運(yùn)動(dòng)功能抑制越明顯。說明異氟烷能夠顯著地降低精子的運(yùn)動(dòng)功能，其對男性的生殖功能有負(fù)面的影響，這與大多數(shù)報(bào)道的實(shí)驗(yàn)結(jié)果是一致的。

哺乳動(dòng)物以及人的精子在離開雄性生殖道時(shí)，并不是立即就可以和卵子相互結(jié)合，而是必須在雌性的生殖道內(nèi)經(jīng)過一段成熟的過程，解除去獲能因子的作用，才可以獲得受精的能力，整個(gè)過程就是精子獲能[10，11]。精子獲能后，耗氧量會增加，運(yùn)動(dòng)的速度增快，當(dāng)獲能的精子進(jìn)入到卵子卵丘細(xì)胞以及細(xì)胞外基質(zhì)，或者是和透明帶結(jié)合的時(shí)候，精子的頭部就會發(fā)生頂體反應(yīng)[12，13]。頂體反應(yīng)的發(fā)生前提條件就是精子獲能，因此，精子獲能的比例決定著受精成功率的高低[14-16]。對于精子獲能的影響，與對照組比較，兩種濃度的異氟烷均明顯地抑制精子的體外獲能，P均<005，ISO1組和ISO2組比較無明顯差異，P>005。

關(guān)于麻醉藥物對精子頂體反應(yīng)的影響方面的研究不多，本研究對22%的異氟烷和對照組已經(jīng)完全獲能的精子標(biāo)本急性暴露1h，結(jié)果顯示，兩組精子發(fā)生頂體反應(yīng)的百分率均較處理前明顯增加，P<005，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。但是處理后兩組間比較無明顯差異，說明異氟烷對精子頂體反應(yīng)影響不明顯，原因可能是與麻醉藥物的暴露方式以及時(shí)間長短等有一定的關(guān)系。相關(guān)研究[17，18]指出γ-氨基丁酸能夠調(diào)節(jié)精子的頂體反應(yīng)。

綜上所述，異氟烷能夠抑制精子的運(yùn)動(dòng)和獲能，并且隨著濃度的增加，抑制作用增強(qiáng)；異氟烷對精子項(xiàng)體反應(yīng)影響不明顯，本研究結(jié)果對有生育要求的男性患者臨床應(yīng)用麻醉藥物有一定的指導(dǎo)意義。

參考文獻(xiàn)

[1]王麗君，汪小海，孫慧謹(jǐn)，等.吸入麻醉劑對人精子運(yùn)動(dòng)功能影響的體外研究.中華男科學(xué)雜志，2008，14（4）：338-342.

[2]許波，汪小海，王麗君.吸入麻醉藥對男（雄）性生殖的影響.藥學(xué)與臨床研究，2008，16（3）：202-203.

[3]黃美瓊， 李北坤， 陳贊鋼.精子形態(tài)學(xué)分析在診斷男性不育癥的應(yīng)用.檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)與臨床， 2011， 8（4）：422-423.

[4]張士琴，許波，汪小海.氯胺酮對體外人精子運(yùn)動(dòng)功能的影響.中華臨床醫(yī)師雜志（電子版）， 2012，6（8）：177-178.

[5]王蘭蘭，郭晶晶，林函，等.不同吸入麻醉藥對人精子運(yùn)動(dòng)功能和體外獲能的影響.中華麻醉學(xué)雜志，2010，30（9）：1065-1068.

[6]王蘭蘭.吸入麻醉藥急性暴露對人精子運(yùn)動(dòng)、體外獲能和頂體反應(yīng)的影響.溫州：溫州醫(yī)學(xué)院，2011.

[7]蔡放. 全身麻醉藥對人精子運(yùn)動(dòng)功能和頂體反應(yīng)的影響.武漢：華中科技大學(xué)， 2012.

[8]宋翼升，周國亮，由振強(qiáng)，等.戊巴比妥鈉處理后SD大鼠體內(nèi)外精子運(yùn)動(dòng)功能分析.中國藥理學(xué)與毒理學(xué)雜志，2013，27（5）：101-103.

[9]鄒乾興，陳雯，翁詩琦，等.丙烯酰胺對離體人成熟精子功能的影響.中國細(xì)胞生物學(xué)學(xué)報(bào)，2014， 36（11）：1478-1483.

[10]陳志林，馮美瑩，陳預(yù)明，等.精子功能相關(guān)的蛋白質(zhì)調(diào)控受精過程的研究進(jìn)展.遺傳，2014，36（8）：747-755.

[11]谷翊群， 陳振文， 于和鳴， 等譯. WHO 人類精液及精子-宮頸粘液相互作用實(shí)驗(yàn)室檢驗(yàn)手冊. 第6 版. 北京： 人民衛(wèi)生出版社， 2012： 53.

[12]雷啟發(fā)，雷啟峰，王愛俠.補(bǔ)腎強(qiáng)精湯及己酮可可堿治療弱精子癥320例療效對比觀察.中國性科學(xué)，2010，19（3）：33-34.

[13]秦文松，劉英，段金良.精子DNA碎片指數(shù)與精液參數(shù)的相關(guān)性研究.中國性科學(xué)，2014，23（4）：55-57.

[14]鄧云山.聚精湯對精子頂體酶異常不育癥的療效觀察.中國性科學(xué)，2012，21（12）：50-51，54.

[15]龔琴琴，張昌軍.活性氧與精子DNA損傷的保護(hù).中國性科學(xué)，2012，21（4）：3-6，10.

[16]Urra JA， Villaroel-Espíndola F， Covarrubias AA， et al. Presence and Function of Dopamine Transporter （DAT） in Stallion Sperm： Dopamine Modulates Sperm Motility and Acrosomal Integrity. PLoS One， 2014，9（11）：e112834.

[17]Van der Horst G，Maree L， Kotzé SH， et al. Sperm structure and motility in the eusocial naked mole-rat， Heterocephalus glaber： a case of degenerative orthogenesis in the absence of sperm competition？ BMC Evolutionary Biology， 2011，11：351.

[18]Bhandari B， Bansal P， Talwar P， et al. Delineation of downstream signalling components during acrosome reaction mediated by heat solubilized human zona pellucida. Reproductive Biology and Endocrinology， 2010，8：7

（收稿日期：2015-03-24）endprint