貴州煙田植物白粉病病原菌鑒定分析

陳興江　汪漢成　向立剛　崔夢(mèng)嬌　周浩　代園鳳　陳雪

摘? 要：為了解煙草白粉病菌在貴州煙區(qū)的寄主植物種類(lèi)，采集煙田植物白粉病樣品，基于真菌rDNA-ITS區(qū)的序列分析對(duì)其白粉病菌進(jìn)行分子生物學(xué)鑒定，采用柯赫氏法則回接驗(yàn)證。結(jié)果表明，貴州煙區(qū)共發(fā)現(xiàn)18科36種不同植物感染白粉病，其中菊科苣荬菜、向日葵、苦苣菜及大麗花，車(chē)前科車(chē)前草，及玄參科阿拉伯婆婆納的白粉病病原菌均為，與煙草白粉病病原菌（）相同，其余30種植物白粉病病原菌與煙草白粉病菌均不相同;接種后，阿拉伯婆婆納、車(chē)前草及苦苣菜在培養(yǎng)30 d內(nèi)均發(fā)生白粉病，苣荬菜、向日葵、大麗花等33種植物均未發(fā)病。因此，阿拉伯婆婆納、車(chē)前草及苦苣菜3種植物可明確為煙草白粉病菌在貴州煙區(qū)的寄主植物。

關(guān)鍵詞：二孢白粉菌;分子鑒定;煙草;寄主植物

中圖分類(lèi)號(hào)：S435.72????????? 文章編號(hào)：1007-5119（2019）03-0055-05????? DOI：10.13496/j.issn.1007-5119.2019.03.008

This study was conducted to investigate the host plants of the tobacco powdery mildew pathogen in Guizhou tobacco-growing field. Plant tissues with typical powdery mildew symptoms were sampled， pathogens of these hosts were identified by molecular method through analyzing the rDNA-ITS gene of the pathogens， and host plants of the? tobacco powdery mildew pathogen were identified by Koch's postulates. The results showed that a total of 36 plant species in 18 different families showed typical powdery mildew symptoms. Among them， the pathogens of powdery mildew in plant species Linn.， L.， L.， Cav.， and were all ， the powdery mildew pathogen? of ， which is not the pathogens of the other 30 plant species. After inoculating with on host plants， tobacco， ， and all showed typical powdery mildew symptoms during a 30 days’ incubation period， while the other 33 plant species did not. In summary， hosts of from tobacco in Guizhou tobacco-growing filed included ， and .

; molecular identification; tobacco; host plant

煙草（L.）是我國(guó)重要的經(jīng)濟(jì)作物，其在生產(chǎn)過(guò)程中極易受到煙草白粉病（tobacco powdery mildew）的危害。煙草白粉病是煙草生長(zhǎng)中后期普遍發(fā)生、且危害嚴(yán)重的葉部真菌病害，可侵染煙草葉片、莖、葉柄、花梗、蒴果等多個(gè)部位，導(dǎo)致煙葉失去烘烤價(jià)值，造成煙葉產(chǎn)量和質(zhì)量下降，給煙農(nóng)造成嚴(yán)重經(jīng)濟(jì)損失。了解煙草白粉病病原菌來(lái)源和寄主范圍，對(duì)指導(dǎo)煙草種植和煙草白粉病的防治均具有重要作用。

煙草白粉病屬于典型氣傳真菌性病害，喜中溫中濕環(huán)境，在烤煙生產(chǎn)季節(jié)，極易發(fā)生與流行。該病害由子囊菌亞門(mén)（Ascomycotina），核菌綱（Pyrenomycetes），白粉菌屬（）的二孢白粉菌（）引起。除危害煙草外，還能侵染菊科（Asteraceae）、葫蘆科（Cueurbitaceae）等多種作物。在貴州煙田周?chē)?，二孢白粉菌的寄主包括大麗花?Cav.）、苦苣菜（ L.）等。然而，局部煙區(qū)這些植物并不常見(jiàn)，而煙草白粉病依然頻繁發(fā)生。煙草白粉病菌的初侵染源除源自閉囊殼釋放的子囊孢子外，還可能來(lái)自其他植物上二孢白粉菌的粉孢子。據(jù)筆者調(diào)查發(fā)現(xiàn)，煙田周邊多種植物在煙草生育期前后也嚴(yán)重發(fā)生白粉病。這些植物是否為二孢白粉菌的轉(zhuǎn)主寄主目前還不清楚。為此，本文對(duì)煙田周邊植物白粉病病原菌進(jìn)行分子生物學(xué)鑒定，并對(duì)鑒定為二孢白粉菌的植物進(jìn)行煙草白粉菌回接驗(yàn)證，旨在明確煙草白粉病菌在貴州煙區(qū)的寄主范圍?，F(xiàn)將研究結(jié)果報(bào)道如下。

1? 材料與方法

1.1? 供試病原菌與試劑

煙草白粉病菌（）由貴州省煙草科學(xué)研究院微生物實(shí)驗(yàn)室提供，將其長(zhǎng)期保存于溫室大棚的活體煙草植株葉片上，溫度范圍為20～28 ℃，相對(duì)濕度大于70%，自然光照條件。保存品種為云煙87，該品種為當(dāng)?shù)乜緹熤髟云贩N。真菌基因組DNA提取試劑盒（Code：D304）、TaKaRa Ex Taq（Code：DRR001A）、DL2000TM DNA Maker（Code：B6301A），均購(gòu)自寶生物工程（大連）有限公司;真菌核糖體基因轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)（ITS）通用引物ITS1（5'-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3'）和ITS4（5'-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3'），均由上海生工生物工程技術(shù)有限公司合成。

1.2? 白粉病菌樣本采集

于2017年3—11月，采集貴州省畢節(jié)市、貴陽(yáng)市煙田及其周邊感染白粉病植物的葉片，將其分別裝于無(wú)菌采樣袋中，依次編號(hào)，4 ℃保存，并迅速帶回貴州省煙草科學(xué)研究院微生物實(shí)驗(yàn)室，用于分子生物學(xué)鑒定。

1.3? 白粉病菌分子生物學(xué)鑒定

選取1.2中植物感病葉片上白粉病的單個(gè)病斑，以其粉孢子為對(duì)象，參照寶生物工程（大連）有限公司試劑盒（Code：D304）的說(shuō)明裂解其粉孢子，獲得其基因組DNA。以各病原菌DNA為模板，采用引物ITS1和ITS4對(duì)各病原菌的rDNA-ITS區(qū)進(jìn)行PCR擴(kuò)增。擴(kuò)增條件為：94 ℃預(yù)變性5 min;94 ℃變性1 min，57 ℃退火1 min，72 ℃延伸1 min，共30個(gè)循環(huán);最終72 ℃延伸10 min。采用1.0%瓊脂糖電泳檢測(cè)PCR產(chǎn)物，并送上海生工生物工程技術(shù)有限公司測(cè)序。測(cè)序結(jié)果在GenBank（www.ncbi.nlm.nih.gov）數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行BLAST對(duì)比分析，并在NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中登錄各病原菌的基因序列信息。

1.4? 煙草白粉菌寄主植物鑒定

依據(jù)柯郝氏法則進(jìn)行回接鑒定。采集1.2中植物的健康葉片，將葉片從基部剪下，洗凈、晾干。用無(wú)菌水保濕的脫脂棉包住葉片莖基部，將植株葉片置于帶有瀝水板的保鮮盒內(nèi)（29 cm×15 cm×6 cm），在盒內(nèi)加入適量的無(wú)菌水保濕，采用孢子抖落接菌法接種煙草白粉病菌（），每種植物接種4張葉片。接菌后將植物葉片置于溫度范圍20～28 ℃、相對(duì)濕度大于70%、自然光照下的玻璃溫室中培養(yǎng)，9～30 d后觀(guān)察各植物葉片白粉病的發(fā)生情況，并參照1.3的方法采集發(fā)病葉片單個(gè)孢子堆白粉病菌樣品，進(jìn)行分子生物學(xué)鑒定。

2? 結(jié)? 果

2.1? 貴州煙田感染白粉病植物

煙草生長(zhǎng)季節(jié)前后，在貴州省畢節(jié)市和貴陽(yáng)市煙田發(fā)現(xiàn)36種植物感染白粉?。ū?），采集各植物白粉病單孢子堆樣品。其中，菊科植物14種，包括苣荬菜（ Linn.）、薇甘菊（ Kunth）、向日葵（ L.）、苦苣菜（）、小蓬草（ L.）、蒲公英（Hand.-Mazz.）、鱧腸（ L.）、牛膝菊（ Cav.）、豨薟草（L.）、大麗花（）等;葫蘆科植物4種，包括南瓜（ （Duch. ex Lam.） Duch. ex Poiret）、葫蘆（（Molina） Standl.）、甜瓜（ L.）;茄科植物2種，包括烤煙（ L.）和番茄（ Mill.）;小檗科植物2種，包括紫葉小檗（var. atropurpurea Chenault）和十大功勞（（Lindl.）Fedde）;豆科植物2種，包括三葉草（ L.）和黃豆（ （Linn.） Merr.）;其他植物13種，分別屬于車(chē)前科、鳳仙花科、薔薇科、大戟科、唇形科、旋花科、蓼科、傘形科、蘇木科、禾本科、玄參科、馬?？?、及杜鵑花科（表1）。

2.2? 白粉病菌分子生物學(xué)鑒定

煙田周邊植物白粉病菌rDNA-ITS區(qū)PCR擴(kuò)增均獲得500 bp左右的片段，經(jīng)GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)BLAST對(duì)比發(fā)現(xiàn)，除鐵莧草白粉病菌外，所有植物白粉病菌的同源性達(dá)93%以上。分子生物學(xué)鑒定結(jié)果表明，菊科植物鱧腸、牛膝菊、豨薟草、百日菊、翅果菊和藿香薊，及3種葫蘆科植物的白粉病病原菌均為;苣荬菜、向日葵、苦苣菜、大麗花、車(chē)前科植物車(chē)前草、及玄參科植物阿拉伯婆婆納的白粉病病原菌均為;小蓬草和蒲公英的白粉病病原菌均為;薇甘菊的白粉病病原菌為;金雞菊的為（表1）。其余植物白粉病菌的病原菌鑒定結(jié)果如表1所示。將各植物白粉病菌擴(kuò)增獲得的rDNA-ITS區(qū)序列提交NCBI，獲得基因登錄號(hào)如表1所示。

2.3? 二孢白粉菌（）寄主植物鑒定結(jié)果

煙田周邊36種植物葉片經(jīng)過(guò)煙草白粉病菌（）接菌培養(yǎng)結(jié)果表明，阿拉伯婆婆納、車(chē)前草、苦苣菜的葉片上均產(chǎn)生白色霉層，出現(xiàn)典型的白粉病癥狀;苣荬菜、大麗花及其余測(cè)試植物葉片上均未出現(xiàn)白粉病癥狀。挑取發(fā)病植物葉片上白粉病單個(gè)孢子堆，進(jìn)行分子生物學(xué)鑒定，結(jié)果表明，所鑒定病原菌均為。根據(jù)上述結(jié)果，確定阿拉伯婆婆納、車(chē)前草、苦苣菜3種植物為煙草白粉病菌的寄主植物。

3? 討? 論

煙草白粉病嚴(yán)重威脅著煙草的生產(chǎn)，生產(chǎn)上可采用多種殺菌劑進(jìn)行該病害的防治。本文通過(guò)系統(tǒng)調(diào)查、分子鑒定、回接驗(yàn)證等分析，初步明確了貴州煙區(qū)煙草白粉病寄主植物種類(lèi)，對(duì)了解煙草白粉病的初侵染來(lái)源和指導(dǎo)煙草白粉病的防治具有重要意義。

白粉病菌的鑒定通常需要結(jié)合病原菌的形態(tài)學(xué)和分子生物學(xué)特征，本文僅采用了分子生物學(xué)的手段對(duì)病原菌進(jìn)行了鑒定，下一步研究中，有待通過(guò)鏡檢完善煙田周邊植物白粉病菌的形態(tài)學(xué)特征。植物白粉病菌的分子生物學(xué)鑒定通?；谡婢颂求w基因轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)（ITS）的序列分析。本研究中，大部分植物白粉病菌被鑒定到種，包括、等;然而，部分病原菌所測(cè)ITS區(qū)與其近源種的同源性較低，如：、、等。這可能與這些植物的白粉病菌在ITS區(qū)的保守性較低有關(guān)。此外，本文對(duì)少部分植物白粉病菌基于ITS的鑒定結(jié)果與文獻(xiàn)報(bào)道的病原菌種類(lèi)并不完全一致，這可能與測(cè)序結(jié)果在進(jìn)行Blast同源性比較時(shí)結(jié)果的選擇有關(guān)，也可能是寄主植物存在其他新的未見(jiàn)報(bào)道的白粉病病原菌。隨著基因組學(xué)的發(fā)展，基于多基因的病原微生物的鑒定技術(shù)正在被開(kāi)發(fā)應(yīng)用，然而，

白粉病菌這方面的研究還未見(jiàn)報(bào)道，下一步有待篩選白粉病菌的特異性引物，將其用于多種植物白粉病的鑒定。

據(jù)報(bào)道，煙草白粉病菌除為害煙草外，還能侵染胡蘿卜科、茄科、菊科、薔薇科、豆科和旋花科等115個(gè)屬以上的植物，本研究?jī)H發(fā)現(xiàn)6種植物的白粉病菌與其相同，這可能與本地區(qū)感白粉病植物種類(lèi)的區(qū)域分布局限性有關(guān)，同時(shí)也可能與采樣時(shí)間有關(guān)，下一步有待增加采樣范圍和種類(lèi)，特別是采集煙草生長(zhǎng)季節(jié)之外時(shí)期感染白粉病植株樣品，并對(duì)其病原菌進(jìn)行鑒定。本文采集到的36種植物白粉病樣品中，大部分寄主屬菊科植物，發(fā)現(xiàn)菊科植物間的白粉病菌并不相同;此外，其余17科植物的白粉病菌間也存在較大差異。這可能與同一區(qū)域植物的白粉病菌在環(huán)境中存在著豐富的多樣性有關(guān)。研究發(fā)現(xiàn)菊科植物苣荬菜和苦苣菜的白粉病菌均被鑒定為，與煙草白粉病菌的病原菌相同，但柯赫氏法則回接驗(yàn)證時(shí)，苣荬菜在培養(yǎng)期內(nèi)并未發(fā)病，其原因目前并不清楚，有待下一步深入研究。大麗花和向日葵培養(yǎng)期內(nèi)未觀(guān)察到發(fā)病，可能與培養(yǎng)時(shí)間不夠有關(guān)，有待繼續(xù)觀(guān)察。此外，本研究發(fā)現(xiàn)3種植物為貴州煙區(qū)的煙草白粉病病原菌的寄主，在今后本地區(qū)煙草生產(chǎn)和煙草白粉病的防治過(guò)程中，需要關(guān)注煙田周邊植物車(chē)前草、阿拉伯婆婆納、苦苣菜上白粉病的發(fā)生時(shí)期，做好煙草白粉病發(fā)生的預(yù)測(cè)預(yù)報(bào)工作，同時(shí)對(duì)這些植物上的白粉病也應(yīng)進(jìn)行綜合防治。

4? 結(jié)? 論

貴州省畢節(jié)市、貴陽(yáng)市煙田及其周邊18科36種感染白粉病植物中，菊科苣荬菜、向日葵、苦苣菜及大麗花，車(chē)前科車(chē)前草，及玄參科阿拉伯婆婆納的白粉病病原菌均為，與煙草白粉病病原菌（）相同，其余30種植物白粉病病原菌與煙草白粉病菌均不相同;接種煙草白粉病菌后，阿拉伯婆婆納、車(chē)前草及苦

苣菜在培養(yǎng)30 d內(nèi)均發(fā)生白粉病，苣荬菜、向日葵、大麗花等33種植物均未發(fā)病。為此，阿拉伯婆婆納、車(chē)前草及苦苣菜3種植物可明確為煙草白粉病菌在貴州煙區(qū)的寄主植物。

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