基于TLR4/MyD88/NF-κB通路研究愈瘍膠囊抗中耳炎的作用

羅倫才，童 妍，張興國(guó)，陳 礴，鐘振東(.涼山彝族自治州第二人民醫(yī)院，西昌 65000；.西南交通大學(xué)生命科學(xué)與工程學(xué)院藥學(xué)系，成都 600；．四川省醫(yī)學(xué)科學(xué)院,四川省人民醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究所，成都 60000)

中耳炎(OM)是兒童常見(jiàn)的上呼吸道細(xì)菌感染疾病，也是導(dǎo)致傳導(dǎo)性聽(tīng)力損失的主要原因[1-2]。OM是慢性炎癥，表現(xiàn)為中耳裂處黏液性積液的積累。愈瘍膠囊是涼山彝族自治州第二人民醫(yī)院(以下簡(jiǎn)稱我院)特色制劑，該制劑對(duì)OM、鼻竇炎、術(shù)后感染和竇道等外科感染性疾病均具有顯著療效。本研究擬使用愈瘍膠囊對(duì)細(xì)菌感染性O(shè)M進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，探討其體內(nèi)外抗菌抗炎效果及相關(guān)機(jī)制，為尋找治療OM的藥物做基礎(chǔ)研究。

1 儀器與材料

1.1儀器 DSX-30型手提式高壓蒸汽滅菌器(上海申安醫(yī)療器械廠)；W-CJ-2F型凈化工作臺(tái)(蘇州博萊爾凈化設(shè)備有限公司)；BA400 Digital型數(shù)碼三目攝像顯微鏡(麥克奧迪實(shí)業(yè)集團(tuán)有限公司)；Image-Pro Plus 6.0型圖像分析軟件(美國(guó)Media Cybernetics公司)；Spectra MAX Plus384型酶標(biāo)儀(美谷分子儀器有限公司)。

1.2試藥 愈瘍膠囊(批號(hào)190901，規(guī)格：0.45 g·粒-1，1 g藥粉相當(dāng)于原生藥1.5 g)，我院自制；左氧氟沙星(批號(hào)DW15201，規(guī)格：0.5 g·片-1)，購(gòu)自第一三共制藥(北京)有限公司；MH培養(yǎng)基(批號(hào)028040)，購(gòu)自廣州環(huán)凱微生物科技有限公司；白細(xì)胞介素-1β(IL-1β)、白細(xì)胞介素-6(IL-6)、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、免疫球蛋白A(IgA)和免疫球蛋白G(IgG)的Elisa試劑盒(批號(hào)：ZC-36391，ZC-36404，ZC-37624，ZC-37000，ZC-37002)，均購(gòu)于上海茁彩生物科技有限公司。Toll-樣受體4抗體(TLR4，批號(hào)A5258)和β-actin抗體(批號(hào)AC026)，購(gòu)于武漢愛(ài)博泰克生物科技有限公司；髓樣分化蛋白-88抗體(MyD88,批號(hào)ab2064)，p-NF-κB抗體(批號(hào)ab86299)和生物素化山羊抗兔IgG(批號(hào)ab6721)，均購(gòu)于英國(guó)艾博抗(上海)貿(mào)易有限公司。

1.3動(dòng)物 SPF級(jí)SD大鼠，雌雄各半，體質(zhì)量為(230±20)g，由成都達(dá)碩實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司提供，許可證號(hào)：SCXK(川)2015-030。

2 方法

2.1菌懸液的制備 將肺炎鏈球菌置于MH培養(yǎng)基中培養(yǎng)12～18 h，待細(xì)菌處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期后使用無(wú)菌生理鹽水制備菌懸液，調(diào)整為0.5個(gè)麥?zhǔn)媳葷岫群髮舛认♂尀?06cfu·mL-1，在30 min內(nèi)完成接種。

2.2受試藥液的制備 取愈瘍膠囊微粉10 g，溶于100 mL無(wú)菌生理鹽水中，即為最高濃度，依次往下倍比稀釋8個(gè)濃度，備用。

2.3最低抑菌質(zhì)量濃度(MIC)和最低殺菌質(zhì)量濃度(MBC)的測(cè)定 取2.2項(xiàng)下制備的各濃度受試藥液，加入96孔無(wú)菌板中，每孔180 μL，各濃度3個(gè)復(fù)孔。將稀釋好的菌懸液每孔20 μL加入孔中。另設(shè)陽(yáng)性對(duì)照孔(20 μL菌懸液)、陰性對(duì)照孔(MH培養(yǎng)基)與空白對(duì)照孔(無(wú)菌生理鹽水)。將96孔板在37 ℃培養(yǎng)18 h，取出，以肉眼觀察無(wú)明顯細(xì)菌生長(zhǎng)的孔所對(duì)應(yīng)的稀釋度為MIC。取有效抑菌質(zhì)量濃度的培養(yǎng)液0.1 mL移種至不含藥物的牛肉膏蛋白胨瓊脂平皿上，置于37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)18 h，肉眼觀察細(xì)菌生長(zhǎng)程度，以培養(yǎng)皿中菌落計(jì)數(shù)少于5個(gè)菌落所對(duì)應(yīng)的藥物質(zhì)量濃度作為MBC。

2.4分組構(gòu)建大鼠化膿性O(shè)M模型及藥物干預(yù) 將50只大鼠隨機(jī)分成模型組、陽(yáng)性對(duì)照組(左氧氟沙星20 mg·kg-1)以及愈瘍膠囊高、中和低劑量組(600，300，150 mg·kg-1)，每組10只。造模條件：各組大鼠腹腔注射戊巴比妥鈉(0.6 g·kg-1)麻醉，用乙醇消毒左側(cè)外耳道。用1 mL無(wú)菌注射器抽取菌液，向左耳鼓室內(nèi)注射肺炎鏈球菌懸液(1×108cfu·mL-1)50 μL，即造模完畢，大鼠蘇醒后全部在安靜條件下飼養(yǎng)。除模型組外，各組每日灌胃對(duì)應(yīng)藥物(20 mL·kg-1)，模型組灌胃等劑量無(wú)菌生理鹽水，每日1次，持續(xù)14 d。

2.5鼓膜觀察 造模后第7天和第14天于手術(shù)顯微鏡下觀察大鼠鼓膜色澤、形狀及有無(wú)穿孔、積液等情況，評(píng)估后進(jìn)行鼓膜評(píng)分。鼓膜炎癥評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)：鼓膜正常，無(wú)炎癥表現(xiàn)，為0分；鼓膜輕度充血，伴輕度內(nèi)陷，為1分；鼓膜中度充血，伴中度內(nèi)陷或凸起，并有輕度中耳積液，為2分；鼓膜重度充血和內(nèi)陷，并有中到重度的中耳積液，為3分；鼓膜穿孔并流膿，為4分。

2.6樣本采集 第7天和第14天將大鼠麻醉后進(jìn)行眼眶靜脈叢采血，收集血清，在-80 ℃保存，備用；第14 天采血完成后處死大鼠，取左側(cè)中耳鼓室，分離部分組織加入40 mL·L-1的多聚甲醛，剩余組織在20 mL·L-1的戊二醛中固定，備用，分別用于病理觀察與電鏡觀察。

2.7大鼠血清中IL-1β、IL-6和TNF-α的含量測(cè)定 將采集好的血清按照試劑盒說(shuō)明書(shū)測(cè)定IL-1β、IL-6和TNF-α的含量。

2.8大鼠血清中免疫球蛋白IgG和IgA的含量測(cè)定 將采集好的血清按照試劑盒說(shuō)明書(shū)測(cè)定IgG和IgA含量。

2.9大鼠鼓室組織形態(tài)學(xué)觀察 將固定好的鼓室組織進(jìn)行包埋切片，使用蘇木精-伊紅(HE)染料進(jìn)行染色，在光學(xué)顯微鏡下觀察切片，觀察鼓室感染情況。

2.10大鼠鼓室組織超微結(jié)構(gòu)觀察 取固定好的鼓室組織，使用掃描電鏡觀察是否出現(xiàn)細(xì)菌樣大小及形態(tài)的物質(zhì)、是否出現(xiàn)無(wú)定形物質(zhì)(為細(xì)胞外多糖構(gòu)成)包繞細(xì)菌以及上述物質(zhì)是否黏附在黏膜表面，評(píng)價(jià)細(xì)菌生物膜的形成情況。

2.11大鼠鼓膜中TLR4、MyD88和p-NF-κB蛋白的含量測(cè)定 用Western Blot法測(cè)定大鼠鼓膜中3種蛋白的含量，并計(jì)算目的蛋白的相對(duì)表達(dá)量。

3 結(jié)果

3.1愈瘍膠囊體外抗菌能力 體外抗菌實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，愈瘍膠囊對(duì)肺炎鏈球菌的MIC和MBC分別為12.5，25.0 g·L-1。

3.2鼓膜表征觀察 在第7天和第14天對(duì)各組大鼠鼓膜進(jìn)行觀察評(píng)分后發(fā)現(xiàn)，與模型組相比，陽(yáng)性對(duì)照組和愈瘍膠囊高劑量大鼠鼓膜紅腫、積液情況較輕，評(píng)分顯著降低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。第14天與第7天相比，模型組及愈瘍膠囊中、低劑量組鼓膜感染情況均有不同程度加重，陽(yáng)性對(duì)照組與愈瘍膠囊高劑量組基本未變。結(jié)果見(jiàn)表1。

3.3大鼠血清炎癥因子 與模型組比較，陽(yáng)性對(duì)照組與愈瘍膠囊高、中劑量組的IL-1β、IL-6和TNF-α含量均減少，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；第14天與第7天相比，各組IL-1β、IL-6和TNF-α含量均有不同程度增加。結(jié)果見(jiàn)表2。

表1 鼓膜評(píng)分情況

表2 愈瘍膠囊對(duì)大鼠血清中炎癥因子的影響

3.4大鼠血清中免疫指標(biāo)的測(cè)定 與模型組比較，第7天愈瘍膠囊高、中劑量組的IgA含量減少，愈瘍膠囊高劑量組的IgG含量減少；第14天愈瘍膠囊高劑量組的IgA與IgG含量均最低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。第14天與第7天相比，各組指標(biāo)均有不同程度增加，結(jié)果見(jiàn)表3。

表3 愈瘍膠囊對(duì)大鼠血清中免疫指標(biāo)的影響

3.5大鼠鼓室組織病理形態(tài)學(xué)及超微結(jié)構(gòu)觀察 對(duì)大鼠鼓室組織切片進(jìn)行HE染色發(fā)現(xiàn)，與模型組相比，愈瘍膠囊高、中劑量組OM病變程度減輕，中性粒細(xì)胞與壞死細(xì)胞數(shù)量減少，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見(jiàn)表4和圖1。對(duì)大鼠鼓室組織切片進(jìn)行掃描電鏡觀察發(fā)現(xiàn)，與模型組相比，愈瘍膠囊高、中劑量組聽(tīng)泡黏膜上細(xì)菌生物膜形成減少，菌絲分布少，細(xì)胞結(jié)構(gòu)完好，結(jié)果見(jiàn)圖2。

3.6大鼠鼓室組織相關(guān)蛋白的測(cè)定 與模型組相比，愈瘍膠囊高、中劑量組的TLR4、MyD88與p-NF-κB蛋白含量均降低，愈瘍膠囊低劑量組中MyD88與p-NF-κB蛋白含量降低，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，結(jié)果見(jiàn)表5和圖3。

表4 大鼠鼓膜病理學(xué)評(píng)分情況

圖1 大鼠鼓室病理形態(tài)學(xué)結(jié)果(HE染色，400×)

Fig.1 Staining results of rat tympanic membrane tissue (HE Staining，400×)

A.model group；B.positive control group；C.Yuyang Capsules high dose group；D.Yuyang Capsules middle dose group；E.Yuyang Capsules low dose group；bule arrow：neutrophile；green arrow：necrotic neutrophil；orange arrow：necrotic epithelial cell.

圖2 大鼠鼓室組織電鏡觀察情況(10 000×)

表5 愈瘍膠囊對(duì)大鼠鼓膜中蛋白含量的影響

圖3 Western Blot檢測(cè)TLR4、MyD88與p-NF-κB的蛋白含量

4 討論

OM作為一種常見(jiàn)的兒童上呼吸道疾病，主要包括急性中耳炎(AOM)、滲出性中耳炎(OME)與慢性中耳炎(CSOM)，其中80%的兒童在3歲前經(jīng)歷過(guò)AOM發(fā)作，其中1/3的患者會(huì)經(jīng)歷反復(fù)感染，許多發(fā)作是由細(xì)菌感染引起的[3-4]。OM急性發(fā)作會(huì)導(dǎo)致咽鼓管功能障礙消失，使?jié)B出液減少轉(zhuǎn)變成慢性或復(fù)發(fā)性O(shè)M，因此細(xì)菌是OM反復(fù)發(fā)作和轉(zhuǎn)變成CSOM的關(guān)鍵[5]。

肺炎鏈球菌是人類特有的病原體，是引起社區(qū)獲得性肺炎、OM、菌血癥和腦膜炎的主要病原菌，主要位于鼻咽，并通過(guò)氣溶膠傳播到宿主之間，如果細(xì)菌存在于生物膜中，則可能通過(guò)黏膜分泌物污染而在宿主之間傳播[6]。肺炎鏈球菌、非分型流感嗜血桿菌(NTHi)和卡他莫拉菌是3種全球已知的主要引起AOM的致病菌[7-8]。國(guó)際流行病學(xué)對(duì)拉丁美洲和加勒比人口的研究也確認(rèn)，肺炎鏈球菌和NTHi是AOM最常見(jiàn)的細(xì)菌病原體[9]。因此，本實(shí)驗(yàn)采用鼓室內(nèi)注射肺炎鏈球菌構(gòu)建大鼠OM模型。愈瘍膠囊的體外抗菌能力檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，愈瘍膠囊對(duì)肺炎鏈球菌的MIC和MBC分別為12.5，25.0 g·L-1，計(jì)算出用于體內(nèi)實(shí)驗(yàn)的3個(gè)劑量分別為600，300，150 mg·kg-1。

鼓膜的狀態(tài)是評(píng)價(jià)OM嚴(yán)重程度的重要指標(biāo)，鼓膜紅腫、內(nèi)陷和滲液等特征可用于直觀評(píng)價(jià)模型的構(gòu)建與藥物的干預(yù)效果[10]。使用耳鏡對(duì)鼓膜進(jìn)行觀察評(píng)分后發(fā)現(xiàn)，模型組鼓膜出現(xiàn)紅腫，部分出現(xiàn)滲液，初步證明模型構(gòu)建成功。與模型組比較，愈瘍膠囊高劑量組鼓膜腫脹程度減輕，基本未出現(xiàn)穿孔、滲液等情況，可初步說(shuō)明使用愈瘍膠囊后導(dǎo)致中耳鼓室滲液減少，能減輕鼓膜病變情況，但其干預(yù)機(jī)制還需進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)說(shuō)明。

由細(xì)菌感染造成的OM會(huì)對(duì)中耳鼓室造成嚴(yán)重?fù)p傷，尤其是鼓室黏膜，而通過(guò)對(duì)組織進(jìn)行HE染色與掃描電鏡觀察可進(jìn)一步了解損傷情況與藥物作用效果。在本實(shí)驗(yàn)中，肺炎鏈球菌感染鼓室后，HE染色觀察發(fā)現(xiàn)鼓室黏膜內(nèi)中性粒細(xì)胞大量生成，炎性細(xì)胞聚集嚴(yán)重，使用愈瘍膠囊后情況好轉(zhuǎn)，黏膜得到不同程度的修復(fù)。同時(shí)掃描電鏡結(jié)果顯示，未經(jīng)藥物處理的鼓室黏膜上存在大量的細(xì)菌生物膜，與肺炎鏈球菌的感染模式相符，使用愈瘍膠囊處理后，黏膜上生物膜減少，逐漸恢復(fù)正常狀態(tài)。由此說(shuō)明，愈瘍膠囊能在中耳鼓室產(chǎn)生抑菌抗炎效果。

肺炎鏈球菌是呼吸道感染疾病的主要致病菌，一旦肺炎鏈球菌進(jìn)入中耳，肺炎溶菌素和細(xì)胞壁成分就會(huì)引發(fā)炎癥，強(qiáng)烈的炎癥是肺炎鏈球菌致病的標(biāo)志[11]。肺炎鏈球菌釋放的炎癥成分包括肽聚糖、磷壁酸、溶血素、過(guò)氧化氫和許多其他分泌的蛋白質(zhì)[12]，召集來(lái)的白細(xì)胞吞噬包裹在細(xì)胞生物膜中肺炎鏈球菌是無(wú)效的，因?yàn)榧?xì)菌未得到有效清除[11]，只會(huì)導(dǎo)致促炎介質(zhì)的釋放增加，如IL-1β、IL-6與TNF-α等[13]。在本實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，與模型組相比，愈瘍膠囊高劑量組血清中的炎癥因子IL-1β、IL-6與TNF-α含量減少(P<0.05)，14 d后增長(zhǎng)緩慢，說(shuō)明愈瘍膠囊能減少因肺炎鏈球菌引起的炎癥反應(yīng)。當(dāng)細(xì)菌入侵中耳鼓室黏膜時(shí)，會(huì)引發(fā)機(jī)體免疫反應(yīng)，誘導(dǎo)IgA與IgG生成到達(dá)病灶發(fā)生作用[14]，巨噬細(xì)胞和肥大細(xì)胞也會(huì)釋放TNF-α[15]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，7 d后模型組血清中IgA與IgG大量生成，由于前期以分泌IgA為主，因此IgA的占比較高，符合感染前期趨勢(shì)。使用愈瘍膠囊后，愈瘍膠囊高劑量組血清中的IgA與IgG含量較模型組明顯下降(P<0.05)，14 d后增長(zhǎng)緩慢，可說(shuō)明愈瘍膠囊能降低血清中的炎癥與免疫因子，緩解細(xì)菌感染所致的癥狀。

Toll樣受體(TLR)是一類模式識(shí)別受體，它識(shí)別與微生物病原體相關(guān)的分子，在先天免疫系統(tǒng)中起關(guān)鍵作用[16]。其中TNF-α可調(diào)節(jié)TLR通路，調(diào)節(jié)包括NF-κB[17]，尤其是TLR4的表達(dá)[18]。MyD88作為一種受體分子，在細(xì)胞表面響應(yīng)TLR和IL-1β信號(hào)時(shí)被募集[19]。最新研究表明，TLR4信號(hào)通路可通過(guò)干預(yù)MyD88通路介導(dǎo)細(xì)菌感染的OM[20]。因此，尋找抑制TLR4/MyD88/NF-κB途徑的新藥可能是減輕OM的新方向。本實(shí)驗(yàn)使用愈瘍膠囊干預(yù)14 d后對(duì)中耳鼓室進(jìn)行蛋白含量檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)愈瘍膠囊高、中劑量組TLR4、MyD88與p-NF-κB的蛋白含量均明顯減少(P<0.05)，表明愈瘍膠囊可通過(guò)抑制TLR4/MyD88/NF-κB對(duì)炎癥與免疫產(chǎn)生作用，緩解肺炎鏈球菌造成的OM。

5 結(jié)論

愈瘍膠囊能延緩肺炎鏈球菌所致的OM進(jìn)程，主要表現(xiàn)在中耳鼓室黏膜細(xì)菌生物膜減少、黏膜結(jié)構(gòu)修復(fù)良好、減少炎癥與免疫反應(yīng)等方面，其潛在治療機(jī)制可能與抑制TLR4/MyD88/NF-κB信號(hào)通路相關(guān)。