3種司帕沙星制劑在健康人體內(nèi)的藥動學(xué)及生物等效性研究

劉和鳳，何家才，樊 麗（安徽醫(yī)科大學(xué)附屬口腔醫(yī)院，合肥市 230032）

司帕沙星是第4代氟喹諾酮類藥物，對革蘭陰性菌、陽性菌及厭氧菌具有廣譜抗菌作用，具有口服吸收好、組織分布廣、生物利用度高、消除半衰期長等藥動學(xué)特點[1]。1993年首先在日本上市，繼而在法國、英國、比利時、芬蘭及瑞士等國家注冊。我國現(xiàn)已有多種劑型上市，主要以片劑和膠囊劑為主，臨床廣泛應(yīng)用于治療下呼吸道感染、肺結(jié)核、慢性前列腺炎、宮頸炎、口腔感染、根管的沖洗消毒等，其臨床療效及安全性已得到證實。本試驗的目的是研究健康志愿者口服3種司帕沙星制劑后的體內(nèi)藥動學(xué)并評價其生物等效性，為其臨床應(yīng)用提供依據(jù)。

1 材料

1.1 儀器

高效液相色譜儀，包括LC-10ATvp溶劑輸送泵、SPD-10Avp紫外-可見檢測器、Chromato-Solution Light色譜中文數(shù)據(jù)系統(tǒng)（日本島津公司）；TDL80-2B型離心機（上海安亭科學(xué)儀器廠）；GL-16G-Ⅱ型高速冷凍離心機（上海安亭科學(xué)儀器廠）；SZ-1型快速混勻器（江蘇金壇市金成國勝實驗儀器廠）；AL104/01型電子分析天平（梅特勒-托利多儀器上海有限公司）。

1.2 試藥

受試制劑1:司帕沙星膠囊（江蘇萬高藥業(yè)有限公司，規(guī)格:每粒100 mg，批號:080911）；受試制劑2:司帕沙星片（江蘇萬高藥業(yè)有限公司，規(guī)格:每片100 mg，批號:080915）；參比制劑:司帕沙星膠囊（鄭州永和制藥有限公司，規(guī)格:每粒100 mg，批號:060301）；司帕沙星標(biāo)準品:（中國藥品生物制品檢定所，批號:130461-200501，含量:99.8%）；內(nèi)標(biāo):加替沙星標(biāo)準品（中國藥品生物制品檢定所，批號:130518-200402，含量:99.4%）；三乙胺、甲醇、乙腈為色譜純，冰醋酸為分析純，水為純凈水。

2 方法

2.1 色譜條件

色譜柱:Shim-packVP-ODS C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相:醋酸緩沖液（冰醋酸-水（5∶95），用三乙胺調(diào)pH至2.87）∶乙腈＝80∶20；流速:1.0 mL·min－1；柱溫:26 ℃；檢測波長:298 nm；靈敏度:0.005AUFS；進樣量:20 μL。在該色譜條件下，司帕沙星和內(nèi)標(biāo)加替沙星分離良好，不受血漿色譜峰的干擾，內(nèi)標(biāo)加替沙星和司帕沙星的保留時間分別約為4.7 min和5.6 min。色譜見圖1。

圖1 高效液相色譜圖A.空白血漿；B.司帕沙星標(biāo)準溶液+內(nèi)標(biāo)溶液；C.空白血漿+司帕沙星標(biāo)準溶液+內(nèi)標(biāo)溶液；D.受試者服藥4 h后血漿+內(nèi)標(biāo)溶液；1.加替沙星；2.司帕沙星Fig 1 HPLC chromatogramsA.blank plasma；B.sparfloxacin standard solution+internal standard；C.blank plasma+sparfloxacin standard solution+internal standard；D.plasma 4 h after administration+internal standard；1.gatifloxacin；2.sparfloxacin

2.2 受試者選擇

選擇24名男性健康志愿者，年齡19～25歲，平均年齡（22.38±1.60）歲，平均體重（61.13±5.33）kg，體重指數(shù)20～24。受試前經(jīng)病史詢問、體格檢查及血、大小便常規(guī)檢查均正常，無藥物過敏史，無煙、酒嗜好，本品皮試陰性，試驗前2周及試驗過程中未服用其他任何藥物。受試者試驗前均簽署知情同意書，且本試驗方案經(jīng)安徽醫(yī)科大學(xué)醫(yī)學(xué)倫理委員會批準通過。

2.3 試驗方案

采用3制劑3周期雙重3×3拉丁方交叉試驗設(shè)計。將24名志愿者隨機分成A、B、C 3組，分別服用受試制劑和參比制劑。受試者于前一日晚餐后，禁食禁水12 h，次日清晨在前臂靜脈安置留置針，抽取空白血樣（服藥前0 h）3 mL后，用200 mL溫開水送服（3種制劑的服用量均為400 mg），分別于服藥后0.5、2.0、3.0、4.0、4.5、5.0、6.0、7.0、8.0、12.0、24.0、48.0、72.0、96.0 h時各采血3 mL，血標(biāo)本收集于肝素抗凝管內(nèi)，室溫靜置后離心分離血漿，血漿樣本置－20℃低溫冰箱，避光保存?zhèn)錅y。服藥后2 h可飲水，4 h和10 h進統(tǒng)一清淡飲食。洗脫期2周，清洗期密切觀察受試者的一般情況，2周后交叉服藥，連服藥3周期。試驗期間由醫(yī)護人員監(jiān)護。

2.4 血漿樣品的處理

精密量取血漿200 μL置1.5 mL具塞試管中，精密加入內(nèi)標(biāo)（29 μg·mL－1加替沙星）溶液10 μL混勻，精密加入甲醇300 μL，于快速混勻器上混合2 min沉淀蛋白，靜置10 min后，置于高速冷凍離心機以12000 r·min－1離心10 min，取出上清液于另一試管中再以12000 r·min－1離心10 min，取第2次離心后上清液20 μL直接進樣分析，以內(nèi)標(biāo)法定量。

2.5 標(biāo)準曲線的制備及最低檢測濃度

精密吸取不同濃度的司帕沙星標(biāo)準貯備液10 μL，置1.5 mL具塞試管中，加入空白血漿200 μL，配制成每毫升血漿含待測物司帕沙星分別為0.0625、0.125、0.25、0.5、1.0、2.0、4.0 μg·mL－1的標(biāo)準血漿樣本，按“2.4”項下自“精密加入內(nèi)標(biāo)（29 μg·mL－1加替沙星）溶液10 μL”起同法操作，以“2.1”項下色譜條件進行測定，記錄色譜。以待測物司帕沙星濃度（X）為橫坐標(biāo)，司帕沙星色譜峰面積（As）與內(nèi)標(biāo)加替沙星色譜峰面積（Ai）的比值（Y）為縱坐標(biāo)，用加權(quán)（1/X2）最小二乘法進行線性回歸，得回歸方程為Y＝－0.004+0.774X（r＝0.9990，n＝7）。結(jié)果表明，司帕沙星血藥濃度在0.0625～4.0 μg·mL－1范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，最低檢測濃度（最低定量下限）為0.0625 μg·mL－1（S/N＞10）。

2.6 回收率及精密度試驗

取1.5 mL具塞試管，分別精密加入不同濃度的司帕沙星標(biāo)準溶液10 μL及空白血漿200 μL，配制成低、中、高3種濃度（0.125、1.0、4.0 μg·mL－1）血漿樣品各3份，按“2.4”項下方法處理，進樣20 μL，得到司帕沙星與內(nèi)標(biāo)加替沙星峰面積之比值A(chǔ)s（H）/Ai（H）；另取1.5 mL具塞試管，分別精密加入不同濃度的司帕沙星標(biāo)準溶液及內(nèi)標(biāo)加替沙星的標(biāo)準溶液，配置低、中、高相同濃度的對照品溶液各3份，進樣20 μL，得到司帕沙星與內(nèi)標(biāo)加替沙星峰面積之比值A(chǔ)s（D）/Ai（D）。按公式[As（H）/Ai（H）]/[As（D）/Ai（D）]×100%計算提取回收率，結(jié)果低、中、高3種濃度的回收率分別為69.99%、96.35%、71.54%；RSD分別為4.60%、4.54%、3.09%。另配制低、中、高3種濃度（0.125、1.0、4.0 μg·mL－1）的血漿樣品各0.5 mL，按“2.4”項下方法操作，在不同天內(nèi)連續(xù)制備并測定3批，每批樣品測定3個濃度，每個濃度5份樣品，計算日內(nèi)和日間的相對標(biāo)準差（RSD）。結(jié)果日內(nèi)和日間的RSD均＜15%，表明方法的精密度良好。

2.7 穩(wěn)定性試驗

配制低、中、高3種濃度（0.125、1.0、4.0 μg·mL－1）的血漿樣品，每個濃度各4份，一份立即按“2.4”項下方法操作，測定血漿中藥物濃度；第2份室溫放置24 h后，同法測定血漿中藥物濃度，考察血漿樣品在室溫條件下的穩(wěn)定性；第3份于－20℃保存7 d后，自然解凍后，同法測定血漿中的藥物濃度，考察樣品在冷凍條件下的穩(wěn)定性；第4份反復(fù)凍融3次后，同法測定血漿中藥物濃度，考察樣品在凍融條件下的穩(wěn)定性。結(jié)果4份樣品的RSD均＜15%，表明血漿樣品在室溫放置、冷凍儲存及反復(fù)凍融情況下穩(wěn)定。

2.8 藥-時曲線

24名受試者口服司帕沙星受試制劑1、2和參比制劑后的平均藥-時曲線見圖2。

圖2 健康受試者單劑量口服3種司帕沙星制劑400 mg后平均藥-時曲線Fig 2 Mean concentration-time curves of sparfloxacin in healthy volunteers after receiving single dose of 3 kinds of sparfloxacin preparations 400 mg

2.9 藥動學(xué)參數(shù)

24名受試者口服司帕沙星受試制劑1、2和參比制劑后的主要藥動學(xué)參數(shù)見表1。

2.10 生物等效性分析

分別對 2 種受試制劑與參比制劑的 cmax、tmax、AUC0～t、AUC0～∞進行方差分析和雙向單側(cè)t檢驗，受試制劑1、2與參比制劑的cmax、tmax、AUC0～t、AUC0～∞相比均無顯著性差異，故2種受試制劑與參比制劑具有生物等效性。

表1 健康受試者單劑量口服3種司帕沙星制劑400 mg后主要藥動學(xué)參數(shù)Tab 1 Main pharmacokinetic parameters of sparfloxacin in healthy volunteers after receiving single dose of 3 kinds of sparfloxacin preparations 400 mg

3 討論

本試驗24名志愿者全部是醫(yī)學(xué)院學(xué)生，平均體重（61.13±5.33）kg，平均年齡（22.38±1.60）kg，全部完成試驗，試驗過程由醫(yī)師和護士進行觀察，24名受試者服藥后均未見不良事件的發(fā)生。

樣品測定過程中為減少系統(tǒng)誤差，筆者每天建立1條隨行標(biāo)準曲線計算血藥濃度，并測定低、中、高（0.125、1、4 μg·mL－1）質(zhì)控樣品3種濃度，確保計算得到的藥物濃度準確可靠。

本試驗血漿樣品的處理與文獻[2，3]報道不同，直接加入色譜甲醇沉淀蛋白，操作方便，適合大批量的血漿樣品檢測。流動相（醋酸緩沖液（冰醋酸-水（5∶95），用三乙胺調(diào)pH值至2.87）∶乙腈＝80∶20）、柱溫（26 ℃）與文獻[2，3]報道也不同[2，3]。預(yù)試驗中，筆者發(fā)現(xiàn)文獻報道血漿樣品的處理方法復(fù)雜，需加乙腈，再水浴和氮氣吹干；文獻所用的流動相與柱溫靈敏度也較低，專屬性不高。流動相篩選發(fā)現(xiàn)采用醋酸緩沖液（冰醋酸-水（5∶95），用三乙胺調(diào)pH值至2.87）∶乙腈＝80∶20時，內(nèi)標(biāo)和試藥峰形最好，出峰時間適宜。

數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計學(xué)分析是利用DAS2.0.1統(tǒng)計軟件計算藥動學(xué)參數(shù):t1/2、cmax、tmax、AUC0～t、AUC0～∞。其中cmax和tmax均以實測值表示，AUC用梯形法計算，t1/2＝0.693/λz，λz為末端消除常數(shù)（用對數(shù)藥-時曲線末段直線部分斜率求得），相對生物利用度F＝AUC受試制劑/AUC參比制劑×100%。

分別對 2 種受試制劑和參比制劑的 cmax、tmax、AUC0～t、AUC0～∞等進行方差分析和雙單側(cè)t檢驗，并進行生物等效性評價。分析受試制劑和參比制劑之間、個體間和周期間變異的統(tǒng)計學(xué)意義。

cmax、AUC0～t、AUC0～∞在進行對數(shù)轉(zhuǎn)換后，進行雙單側(cè)t檢驗和（1－2α）置信區(qū)間考察。AUC在參比制劑的80%～125%作為等效標(biāo)準，cmax在參比制劑的70%～143%作為等效標(biāo)準。

受試制劑司帕沙星膠囊、司帕沙星片和參比制劑司帕沙星膠囊相比，在相對生物利用度、吸收程度、達峰時間上均具有生物等效性。

[1]呂增春，邢玉斌.喹諾酮類抗菌藥的分類和進展[J].國外醫(yī)藥-抗生素分冊，2001，22（2）:73.

[2]張永東，肖云彬，羅繼名.2種國產(chǎn)司帕沙星制劑的生物等效性研究[J].中南藥學(xué)，2008，6（1）:58.

[3]張 琨，馬香芹.司帕沙星片人體生物等效性研究[J].河南職工醫(yī)學(xué)院學(xué)報，2008，20（4）:324.