當(dāng)歸多糖的提取、分離及純化

張清勇　于宏　王慶奎　孫學(xué)亮　邢克智　郭永軍

摘 要：對(duì)當(dāng)歸多糖的提取方法進(jìn)行了優(yōu)化，并測(cè)定了當(dāng)歸多糖得率及當(dāng)歸多糖中蛋白質(zhì)、總糖和還原糖的含量。結(jié)果表明先用乙醇進(jìn)行處理可以改變當(dāng)歸多糖的的獲得率，乙醇滲漏方法的當(dāng)歸粗多糖獲得率最高。

關(guān)鍵詞：當(dāng)歸多糖；總糖；還原糖

當(dāng)歸為傘形科（Umbrelliferae）植物當(dāng)歸（Angelica sinensis（Oliv）Diels）的根，藥性甘、辛、溫，有活血、補(bǔ)血、潤(rùn)腸滑腸、調(diào)經(jīng)止痛的功效，對(duì)于臨床應(yīng)用使用的頻率很高，素有“十方九歸”的美稱[1]。隨著現(xiàn)代分離技術(shù)和儀器的進(jìn)步，當(dāng)歸的多種成分被分離出來，當(dāng)歸多糖是從植物當(dāng)歸原料中提取的水溶性多糖，是當(dāng)歸的主要活性成分之一[2-3]。

目前當(dāng)歸多糖的提取、分離及純化方法主要是傳統(tǒng)的水提醇沉后脫蛋白[4]。但影響水提醇沉的因素有很多，比如水提時(shí)間、溫度、料液比以及水提次數(shù)等[5]。傳統(tǒng)方法先將中草藥當(dāng)歸加水煮沸，離心，上清液濃縮后加入一定體積的乙醇，靜置過夜，得到當(dāng)歸多糖粗制品。粗制品加一定量的去離子水溶解，用不同的方法去除蛋白質(zhì)后，透析、冷凍干燥后得到初步純化的當(dāng)歸多糖[6-7]。但得到的當(dāng)歸多糖得率并不高，并且費(fèi)時(shí)費(fèi)力。本試驗(yàn)擬比較3種植物多糖的提取方法，尋找當(dāng)歸多糖的最佳提取方法，為當(dāng)歸多糖的后續(xù)研究提供前期基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

中草藥當(dāng)歸購于本地中草藥市場(chǎng)，產(chǎn)地甘肅。

1.2 試劑與儀器

5%苯酚溶液：精確稱取2.449 6 g苯酚置于50 mL燒杯中，加入蒸餾水，玻璃棒攪拌使其充分溶解，然后置于50 mL容量瓶中定容。定容后裝入棕色玻璃瓶，以防苯酚溶液被氧化。

透析袋MW：8 000～14 400，BioSharp，USA。透析袋前處理：透析袋剪成適當(dāng)?shù)拈L(zhǎng)度，將透析袋在含1 mmol/L EDTA 和2% 碳酸氫鈉（NaHCO3）的溶液中煮沸10 min，用蒸餾水清洗干凈，置于20%乙醇溶液中4 ℃冷藏備用。

1.3 試驗(yàn)內(nèi)容

1.3.1 當(dāng)歸粗多糖的分離提取

提取方法Ⅰ：將自然風(fēng)干后的新鮮當(dāng)歸，直接用蒸餾水煮沸30 min，料液比為1∶30，最后得到的提取液用無水乙醇進(jìn)行醇沉，乙醇終濃度至80%，攪拌均勻后，4 ℃冷藏靜置6 h后離心（4 000 r/min，10 min）。沉淀用95%乙醇去除色素，直到上清無色為止，沉淀冷凍干燥后即為當(dāng)歸粗多糖（Crude angelica sinensis polysaccharide，CASP）。

提取方法Ⅱ：將新鮮當(dāng)歸自然風(fēng)干并處理成小片，用體積分?jǐn)?shù)為75%的乙醇溶液浸泡一周，料液比為1∶10，浸泡并不時(shí)攪動(dòng)。醇提后殘?jiān)扔盟蠓?0 min，料液比為1∶30，上清液中加入無水乙醇使乙醇終濃度至80%，攪拌均勻后4 ℃冷藏靜置6 h后離心（4 000 r/min，10 min）。將沉淀反復(fù)用95%的乙醇脫色，直到上清液無色，沉淀冷凍干燥后即為CASP。

提取方法Ⅲ：將自然風(fēng)干后的新鮮當(dāng)歸處理成小塊狀，用78%的乙醇浸泡一周，料液比為1∶10，要經(jīng)常攪拌，浸泡好后用76%的乙醇進(jìn)行滲漉，直到滲出液無色為止，將滲漉后的當(dāng)歸用蒸餾水煮沸30 min，料液比為1∶30，水煮后得到的提取液加入無水乙醇使乙醇終濃度至80%，攪拌，4 ℃冷藏靜置后離心（4 000 r/min，10 min）。將沉淀反復(fù)用95%的乙醇脫色，直到上清液無色，沉淀冷凍干燥后即為CASP。

1.3.2 CASP的脫蛋白處理 當(dāng)歸粗多糖加三蒸水溶解（濃度為2 mg/mL），采用Sevag法脫蛋白[8]：當(dāng)歸多糖粗提物溶液中按體積比為3∶1加入Sevag試劑，放在磁力攪拌器上攪拌45 min后離心（4 000 r/min，10 min）。離心后溶液分為三層，上層為多糖溶液，中層為蛋白質(zhì)凝膠層，底層為有機(jī)溶劑。取上層多糖溶液重復(fù)上述步驟，直到蛋白質(zhì)凝膠層消失。多糖溶液在280 nm波長(zhǎng)附近無特征吸收峰，說明多糖中的蛋白質(zhì)已經(jīng)去除。

1.3.3 透析 將脫蛋白后的多糖溶液移到處理好的透析袋中，放入三蒸水中透析3～4 d。透析過程中，要注意勤換水。透析好的多糖溶液經(jīng)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮后冷凍干燥得到當(dāng)歸多糖（Angelica sinensis polysaccharide，ASP）。

1.3.4 CASP和ASP蛋白質(zhì)、總糖和還原糖含量測(cè)定 采用考馬斯亮藍(lán)染色法測(cè)定蛋白質(zhì)含量。精密稱取100 mg考馬斯亮藍(lán)G-250，溶于50 mL 95%乙醇中，加入100 mL 85%磷酸，最后用蒸餾水定容至1 000 mL。放于棕色瓶中備用。精確稱取牛血清白蛋白10 mg，用蒸餾水溶解并定容至100 mL，配成0.l mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)溶液。精密吸取蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)溶液0.0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、和l mL，分別置于10 mL比色管中，然后加入配制好的考馬斯亮藍(lán)G-250溶液5.0 mL溶液，各管用蒸餾水加至6.0 mL，搖勻后放置2 min，用紫外分光光度計(jì)在波長(zhǎng)595 nm處測(cè)定吸光度，將上述數(shù)據(jù)進(jìn)行線性回歸，得標(biāo)準(zhǔn)曲線方程：y=0.006 x+0.014，相關(guān)系數(shù)為0.999，線性良好。精密稱取10 mg多糖樣品，用蒸餾水溶解并定容至10 mL，精密吸取1.0 mL多糖樣品溶液，加入考馬斯亮藍(lán)溶液5.0 mL，振蕩搖勻，靜置2 min后，在595 nm處測(cè)定其吸光度，從標(biāo)準(zhǔn)曲線上查得蛋白的濃度。

采用苯酚-硫酸法測(cè)定總糖含量。用分析天平精密稱取葡萄糖（105 ℃下干燥至恒重）100 mg，置于燒杯中用蒸餾水溶解后，置于1 000 mL容量瓶中定容，搖勻，配得葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液。精密吸取葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液0.1、0.2、0.4、0.6、0.8和l mL，分別置于10 mL比色管中，然后加入5%的重蒸酚1.0 mL溶液，搖勻，加入濃硫酸5.0 mL，加蒸餾水至刻度，搖勻后放置5 min，再于沸水浴中加熱15 min，取出冷卻至室溫。另以蒸餾水20 mL加5%的重蒸酚和硫酸，同上做空白對(duì)照，用紫外分光光度計(jì)在波長(zhǎng)490 nm處測(cè)定吸光度，將上述數(shù)據(jù)進(jìn)行線性回歸，得標(biāo)準(zhǔn)曲線方程：y=0.007 x+0.089，相關(guān)系數(shù)為0.999，濃度范圍在0～0.l mg/mL，線性良好。精密稱取多糖樣品20 mg，用蒸餾水溶解并定容至1 000 mL，精密吸取多糖樣品溶液0.2 mL，按上述方法測(cè)定吸光度，從標(biāo)準(zhǔn)曲線中求出樣品中總糖的含量。

用蒽酮-硫酸法測(cè)定還原糖活力。用分析天平精密稱取葡萄糖（105 ℃下干燥至恒重）100 mg，置于燒杯中用蒸餾水溶解后，置于1 000 mL容量瓶中定容，搖勻，配得葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液。精密吸取葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液0.0、0.2、0.4、0.8、1.2、和l.6 mL，分別置于10 mL比色管中，然后加入005%的蒽酮-硫酸溶液4.0 mL，混勻，立即用冰水冷卻，再于沸水浴中加熱5 min，取出在冰水中冷卻30 min。將上述數(shù)據(jù)進(jìn)行線性回歸，得標(biāo)準(zhǔn)曲線方程：y=0.054 x+0.288，相關(guān)系數(shù)為0999，線性良好。精密稱取多糖樣品20 mg，用蒸餾水溶解并定容至1 000 mL，精密吸取多糖樣品溶液0.2 mL，按上述方法測(cè)定吸光度，從標(biāo)準(zhǔn)曲線中求出樣品中還原糖的含量。

1.4 數(shù)據(jù)處理

所得數(shù)據(jù)（平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤表示，n=3）用Excel 2003和SPSS 18.0處理，做單因素方差分析，顯著水平為p<0.05。

2 結(jié)果

2.1 CASP得率

CASP得率的結(jié)果見表1。結(jié)果表明：第III種提取方法的CASP得率顯著高于其它提取方法。

2.2 蛋白質(zhì)、總糖和還原糖含量

將分離到的CASP和ASP配成一定濃度的溶液，測(cè)定其蛋白質(zhì)、總糖和還原糖含量，由標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算結(jié)果見表2。

3 討論

目前當(dāng)歸多糖的提取方法主要是傳統(tǒng)的水提醇沉工藝、超聲波萃取和微波萃取法等[4]。本試驗(yàn)采用水提醇沉的方法提取當(dāng)歸粗多糖，影響水提醇沉的方法效果有很多因素，比如水提時(shí)間、溫度、料液比以及水提次數(shù)等[5]。楊婧等[9]通過正交試驗(yàn)得出了水提法得到當(dāng)歸多糖的最佳條件：水提時(shí)間為30 min、溫度為100 ℃、料液比為1∶20、提取2次。但是水提醇沉的方法本身也有很多缺點(diǎn)，反復(fù)高溫可能破壞多糖結(jié)構(gòu)，乙醇的濃度也會(huì)影響當(dāng)歸多糖的提取率。因?yàn)楫?dāng)歸中含有大量脂溶性物質(zhì)，所以本試驗(yàn)先用乙醇去除一部分脂溶性物質(zhì)[10]。本試驗(yàn)采用Sevag法脫蛋白，王慶奎等[7]通過試驗(yàn)得出了sevag法脫除當(dāng)歸多糖蛋白的最佳條件。本試驗(yàn)結(jié)果表明，先用乙醇進(jìn)行處理可以改變當(dāng)歸粗多糖的獲得率，乙醇滲漉方法的當(dāng)歸粗多糖的獲得率最高。

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Abstract：The sinensis polysaccharide yield was optimize and measured angelica sinensis polysaccharide content of protein， total sugar and reducing sugar .Results showed that the use of ethanol first processing can change the gain rate of angelica sinensis polysaccharide， ethanol sinelica angelica polysaccharide to obtain the highest rate of leakage method.

Key words：Angelica sinensis polysaccharide；；total sugar；reducing sugar

（收稿日期：2015-12-11）