分泌金黃色的真姬菇隱性污染菌包微生物的分離與鑒定*

張職視，李佳歡，詹森然，賴淑芳，王麗芬，陳桂珍，孫淑靜，，胡開輝，**

（1.福建農(nóng)林大學生命科學學院，福建 福州 350002；2.福建農(nóng)林大學（古田）菌業(yè)研究院，福建古田352200）

分泌金黃色的真姬菇隱性污染菌包微生物的分離與鑒定*

張職視1，李佳歡1，詹森然1，賴淑芳1，王麗芬2，陳桂珍2，孫淑靜1，2，胡開輝1，2**

（1.福建農(nóng)林大學生命科學學院，福建 福州 350002；2.福建農(nóng)林大學（古田）菌業(yè)研究院，福建古田352200）

真姬菇（Hypsizygus marmoreus）憑借獨特的風味和優(yōu)良的保健功效成為工廠化栽培的食用菌之一，但生產(chǎn)過程中易受雜菌污染，為了分析污染原因，降低污染率和生產(chǎn)成本，采用稀釋涂平板法從菌袋上部變黃吐黃水的污染菌袋中分離得到5株細菌及5株真菌，通過形態(tài)學結合細菌16S rRNA以及真菌ITS保守序列進行鑒定并構建了系統(tǒng)發(fā)育樹。研究結果表明，5株細菌分別屬于芽孢桿菌屬（Bacillus）、腸桿菌科（Enterobacter）、西地西菌屬（Cedecea）、假單胞菌屬（Pseudomonas）、藤黃色桿菌屬（Luteibacter），5株真菌分別屬于枝孢菌屬（Cladosporium）、青霉菌屬（Penicillium）、曲霉菌屬（Aspergillus）、格孢腔菌目（Pleosporales）、鐮孢菌屬（Fusarium）。系統(tǒng)發(fā)育樹分析表明污染菌相互之間的親緣關系較遠。

真姬菇；污染菌；分離；鑒定

真姬菇 [Hypsizygus marmoreus(Peck)Bigelow HE]是近幾年福建省工廠化生產(chǎn)的重要品種之一。目前國內(nèi)外的研究主要集中在其生物學特性[1]、遺傳育種[2－3]、子實體營養(yǎng)物質(zhì)及生理活性物質(zhì)[4]、原材料的開發(fā)與栽培特性[5－14]以及酶活性和蛋白質(zhì)組學等方面[15－16]，但對栽培過程中污染情況缺乏系統(tǒng)的研究。有學者對平菇、金針菇、雙孢蘑菇、雞腿菇、蛹蟲草等食用菌病原菌做了研究[17－27]，然而關于真姬菇污染菌方面的報道卻很少。由于真姬菇為低溫結實性品種，在栽培生產(chǎn)中發(fā)菌較為緩慢，后熟培養(yǎng)時間長，生產(chǎn)周期長達120 d～150 d以上[28]。故在工廠化生產(chǎn)中，任何一個環(huán)節(jié)受隱性污染都可能影響出菇的質(zhì)量。并且真姬菇生產(chǎn)過程中可用秸稈、玉米芯、米糠等工農(nóng)業(yè)副產(chǎn)物和下腳料作其主要培養(yǎng)基，這在一定程度上增加了真姬菇工廠化生產(chǎn)的潛在污染性。受隱性污染的真姬菇會影響其出菇，甚至不能出菇，影響產(chǎn)量和質(zhì)量，不但增加企業(yè)生產(chǎn)成本，而且受隱性污染的真姬菇出菇后的朵型、大小、質(zhì)地差，難以滿足消費者的消費需求，降低相關產(chǎn)品的品牌美譽度。本研究通過隱性污染分離鑒定，分析其群落結構及生物學特性，為真姬菇產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)降低隱性污染和檢測提供幫助，同時也為其它食（藥）用菌隱性污染研究提供借鑒和參考。

1 材料與方法

1.1 菌株

菌株分離自福州市羅源縣力生食用菌有限公司真姬菇污染菌包，該菌袋上部分泌有金黃色液體。1.2 試劑

PDA培養(yǎng)基：馬鈴薯200 g、葡萄糖20 g、瓊脂20 g，定容至1 L，pH自然。液體培養(yǎng)基不加瓊脂。

LB培養(yǎng)基：蛋白胨5 g、酵母粉5 g、NaCl 5 g、瓊脂20 g，定容至1 L，調(diào)節(jié)pH至7.0。液體培養(yǎng)基不加瓊脂。

2×Power Taq PCR MaterMix為北京百泰克生物技術有限公司產(chǎn)品。

試驗所用試劑均為分析純。

1.3 菌種富集和分離純化

在無菌條件下，用藥匙從菌袋上部變黃處取1 g～2 g分別接種至LB與PDA培養(yǎng)基中，分別于25℃和37℃搖床富集培養(yǎng)16 h，轉(zhuǎn)速為150 r·min－1。采用稀釋平板法進行分離[29]。吸取1 mL富集液梯度稀釋至10－5，吸取10－3、10－4、10－5稀釋液各100 μL，分別均勻涂布于LB與PDA平板上，用封口膜進行封口，分別放入25℃與37℃恒溫培養(yǎng)箱中，正置培養(yǎng)30 min，30 min后倒置培養(yǎng)16 h，檢查平板菌落生長情況，挑取單菌落于新鮮液體培養(yǎng)基中，于搖床培養(yǎng)16 h，用于提取基因組、形態(tài)學分析和保藏菌種。

1.4 菌種的培養(yǎng)與觀察

觀察細菌的單克隆菌落特征并拍照，用接種針挑取真菌菌絲，制作成顯微切片，于光學顯微鏡下觀察菌株的形態(tài)特征。

1.5 基因組提取PCR擴增與序列測定

采用細菌基因組DNA提取試劑盒（北京百泰克生物技術有限公司）提取細菌基因組，采用真菌基因組提取試劑盒（上海生工生物工程股份有限公司）提取真菌基因組。

細菌PCR擴增引物為16S rDNA的通用引物：27F：5’－AGAGTTTGATCCTGGCTCAG－3’和1492R：5’－TACCTTGTTACGACTT－3’。

真菌PCR擴增引物為內(nèi)部間隔序列：ITS4：5’－TCCTCCGCTTATTGATATGC－3’ 和 ITS5： 5’－GGAAGTAAAAGTCGTAACCAAGG－3’。

PCR反應體系：模板DNA 1 μL；上下游引物各1 μL；2×Power Taq PCR MaterMix 10 μL；ddH2O 7 μL。PCR擴增條件：94℃預變性 5 min，94℃變性30 s，55℃退火30 s，72℃延伸1 min，30個循環(huán)；72℃延伸10 min，4℃保存。

擴增產(chǎn)物以1%瓊脂糖凝膠電泳檢測。按照美國Omega BioTek公司膠回收試劑盒說明書進行切膠回收后送往上海生工生物工程股份有限公司進行測序。

1.6 序列比對和系統(tǒng)發(fā)育樹構建

將測序結果在NCBI中GeneBank數(shù)據(jù)庫進行比對，獲取前3條相似性高的序列。用MEGA6.0軟件將測定序列與相關序列一起用Clustal W算法進行序列比對，用Neighbor－Joining法構建系統(tǒng)發(fā)育樹。

2 結果與分析

2.1 基因組提取

細菌基因組DNA電泳圖見圖1。

圖1 細菌的基因組DNA電泳圖Fig.1 Electrophoretic pattern of DNA genome

如圖1所示，細菌基因組DNA片段都在10 000 bp以上，沒有降解條帶，說明提取效果非常好。

2.2 PCR擴增產(chǎn)物

細菌16S rRNA區(qū)PCR擴增電泳圖見圖2。

圖2 細菌16S rRNA區(qū)PCR擴增電泳圖Fig.2 Electrophoretic pattern of PCR amplification in 16S rRNA

由圖2可以看出，細菌PCR產(chǎn)物大約為1 500 bp，PCR特異性良好，但還是有一些非特異性條帶。真菌ITS區(qū)PCR擴增電泳圖見圖3。

圖3 真菌ITS區(qū)PCR擴增電泳圖Fig.3 Electrophoretic pattern of PCR amplification in ITS

由圖3可以看出，真菌PCR產(chǎn)物大約為600 bp，PCR特異性良好，但是還是有一些非特異性條帶。

2.3 序列比對及系統(tǒng)發(fā)育樹分析

2.3.1 污染細菌的序列分析

細菌16S rDNA序列與GenBank數(shù)據(jù)庫比對的結果見表1。

據(jù)表1比對結果，用鄰近相接法直接構建鑒定菌株與相關近緣菌株的16S rDNA系統(tǒng)發(fā)育樹，見圖4。

表1 細菌16S rDNA序列與NCBI數(shù)據(jù)庫比對結果Tab.1 Nearest match of bacterial 16S rDNA sequences in GenBank

圖4 基于16S rDNA構建的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.4 System developmental tree constituted on the base of 16S rDNA

系統(tǒng)發(fā)育分析結果表明，B－1與芽孢桿菌屬（Bacillus） 處于同一分支，具有較高的同源性，bootsrap支持率為92%，且三者序列相似性為99%；B－2與腸桿菌科（Enterobacter）處于同一分支，具有較高的同源性，bootsrap支持率為94%，且三者序列相似性為99%；B－3與西地西菌屬（Cedece）處于同一分支，具有較高的同源性，bootsrap支持率為92%，且三者序列相似性為99%；B-4與假單胞菌屬（Pseudomonas）處于同一分支，具有較高的同源性，bootsrap支持率為96%，且三者序列相似性為99%以上，B-5與藤黃色桿菌屬（Luteibacter）處于同一分支，具有較高的同源性，bootsrap支持率為99%，且三者序列相似性為99%以上。

2.3.2 污染真菌的序列分析

真菌ITS rDNA序列與NCBI數(shù)據(jù)庫比對結果見表2。

表2 真菌ITS rDNA序列與NCBI數(shù)據(jù)庫比對結果Tab.2 Nearest match of fungi ITS rDNA sequences in GenBank

據(jù)表2比對結果，用鄰近相接法直接構建鑒定菌株與相關近緣菌株的ITS系統(tǒng)發(fā)育樹，見圖5。

系統(tǒng)發(fā)育分析結果表明，F(xiàn)-1與枝孢菌屬（Cladosporium）處于同一分支，具有較高的同源性，bootsrap支持率為99%，且三者序列相似性為100%；F-2與青霉菌屬（Penicillium）處于同一分支，具有較高的同源性，bootsrap支持率為97%，且三者序列相似性為100%；F-3與曲霉菌屬（Aspergillus） 處于同一分支，具有較高的同源性，bootsrap支持率為97%，且三者序列相似性大于99%；F-4與格孢腔菌目Pleosporales處于同一分支，具有較高的同源性，bootsrap支持率為98%，且三者序列相似性為100%；F-5與鐮孢菌屬（Fusarium）處于同一分支，具有較高的同源性，bootsrap支持率為98%，且三者序列相似性為98%以上。

圖5 基于ITS區(qū)rDNA構建的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.5 System developmental tree constituted on the base of ITSrDNA

2.4 菌株形態(tài)學

2.4.1 細菌菌株形態(tài)學

單菌落形態(tài)及菌落形態(tài)比較見圖6、表3。由圖6可以看出，在37℃培養(yǎng)16 h的5株細菌的顏色形狀有明顯差別，通過相關形態(tài)特征的描述（表3）總結了5株細菌群落的特點。

圖6 單菌落形態(tài)圖Fig.6 Single colony morphology

2.4.2 真菌菌株形態(tài)學

真菌菌株菌落形態(tài)見圖7。

由圖7可以看出，5種真菌的菌落形態(tài)各不相同。菌落F-1屬于枝孢菌屬，該菌落與培養(yǎng)基結合緊密，有韌性。正面為棕綠色，有層次感，背面為黑綠色，邊緣有一圈棕綠色邊帶。F-2屬于青霉菌屬，菌落正面為綠色，外部有細小黃色環(huán)形邊緣帶，有非常多的分生孢子，菌落背面為艷麗的橙黃色，分泌黃色色素，邊緣有黃色邊帶，菌落后期形成紅色的子囊，成熟后有更多的子囊孢子散落。F-3屬于曲霉菌屬，菌落前期為白色，后期形成大量黑色孢子。菌落正面前期為白色，后期為黑色，背面為淺綠色。F-4屬于格孢腔菌目，菌落正反面均為白色，沒有孢子散落。F-5屬于鐮孢菌屬，菌絲呈放射狀，菌落正面為淺紅色，背面中心為血紅色，邊緣為白色?？梢耘c青霉菌共生，共生時菌落正面為黃色，背面中心為黃色，周圍為紅色，可以通過挑取單孢子進行分離。

表3 細菌菌落形態(tài)比較Tab.3 Comparison of bacterial colony on morphology

圖7 真菌菌落形態(tài)Fig.7 Colony morphology

圖8 菌絲形態(tài)圖Fig.8 The hypha morphology

菌絲形態(tài)見圖8。

由圖8可見，5種真菌菌絲形態(tài)各不相同。F-1菌絲分節(jié)為綠色。F-2菌絲分節(jié)為綠色，可以看到掃帚狀的分生孢子。F-3菌絲分節(jié)為綠色，可以看見圓形囊狀物，可能是分生孢子梗頂端膨大形成的頂囊脫落。F-4菌絲為綠色。F-5菌絲為紅色，可以與青霉菌共生，共生時可以明顯的看到紅色菌絲與綠色菌絲相互交叉生長，紅色菌絲附著在綠色菌絲上，連接點有略微膨大。

由圖8還可以看出，5種真菌菌絲形態(tài)各不相同。F-1菌絲分節(jié)為綠色。F-2菌絲分節(jié)為綠色，可以看到掃帚狀的分生孢子。F-3菌絲分節(jié)為綠色，可以看見圓形囊狀物，可能是分生孢子梗頂端膨大形成的頂囊脫落。F-4菌絲為綠色。F-5菌絲為紅色，可以與青霉菌共生，共生時可以明顯的看到紅色菌絲與綠色菌絲相互交叉生長，紅色菌絲附著在綠色菌絲上，連接點有略微膨大。

3 討論

菌包上部變黃吐黃水是影響真姬菇出菇的一種現(xiàn)象，嚴重時變成黃褐色，搔菌后菌絲死亡變黑，不能恢復出菇。經(jīng)過研究發(fā)現(xiàn)這不是由單一微生物引起的現(xiàn)象，是由一特定的菌群相互作用產(chǎn)生的，而其中的芽孢桿菌屬是一類能產(chǎn)生抗逆性極強的芽孢細菌。因此對原料進行充分的滅菌，徹底殺死耐熱芽孢結構成為滅菌的關鍵?？梢圆捎梅植綔缇?，以及梯度升溫法、充分排除冷空氣、延長滅菌時間等方法進行徹底滅菌。大腸桿菌的污染可以用來反映環(huán)境衛(wèi)生狀況，推斷原料是否受到污染。西地西菌屬與人類健康有密切關系。假單胞菌屬主要著生在土壤等大多數(shù)培養(yǎng)料中。藤黃色桿菌屬能分泌黃色色素，可能與菌包上部出現(xiàn)黃色水珠相關。枝孢菌、青霉菌、曲霉菌、格孢腔菌、鐮孢菌等真菌也是食用菌污染的一個重要原因，可產(chǎn)生抗逆性強、易傳播的分生孢子，成為隱性污染的重要來源。

液體菌種因生產(chǎn)周期短，節(jié)省勞動力成本[14]，逐漸將成為主流，本研究可為其安全生產(chǎn)提供參考。

企業(yè)應該嚴把原材料關，采用先進的滅菌技術，并注意生產(chǎn)過程中各個環(huán)節(jié)衛(wèi)生，確保從源頭上消除污染隱患，從而降低生產(chǎn)成本，防止真姬菇長期培養(yǎng)過程中造成隱性污染。本研究通過隱性污染菌分離鑒定，通過分析其群落結構及生物學特性，為真姬菇產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)降低隱性污染和檢測提供幫助，同時也為研究其它食（藥）用菌隱性污染提供借鑒和參考。

[1]劉建中，孫淑靜，胡開輝，等.姬菇融合菌株生物學特性及生產(chǎn)性能的研究[J].中國食用菌，2010，29（3）：22-25.

[2]董巖，陳輝，趙明文，等.真姬菇栽培菌株的ITS和SSR分析[J].上海農(nóng)業(yè)學報，2009，25（3）：59-64.

[3]胡開輝，劉建中，孫淑靜，等.斑玉蕈育種中漆酶轉(zhuǎn)化體系建立的初步研究[J].菌物學報，2010（4）：528-535.

[4]林中寧，陳敏健，劉明香，等.真姬菇菇腳和菌糠氨基酸含量測定及營養(yǎng)評價[J].中國食用菌，2012，31（2）：44-46.

[5]翁梁，張科，陳赟，等.玉米秸稈與菌糠栽培真姬菇比較研究[J].北方園藝，2014（17）：143-145.

[6]石健林，林中鱗，林雷通，等.煙稈替代部分棉籽殼做培養(yǎng)基栽培真姬菇的效果[J].中國煙草學報，2011，17（2）：59-62.

[7]張炳照，閆培生.海帶廢渣真姬菇發(fā)酵產(chǎn)物抗氧化活性研究[J].中國農(nóng)業(yè)科學導報，2013，15（3）：157-162.

[8]宋志剛，李艷婷，申挺挺，等.蘆筍老莖培養(yǎng)料對杏胞菇、白靈菇和真姬菇多糖含量及抗氧化性的影響[J].廣東農(nóng)業(yè)科學，2011（18）：32-34.

[9]沙春娥，李富得，王振坤．利用油橄欖冬剪枝栽培真姬菇試驗[J].食用菌，2010（4）：35.

[10]蘇啟苞，劉傳森.利用木薯、木薯渣栽培真姬菇試驗[J].中國食用菌，2008，27（4）：59，61.

[11]程繼紅，馮志勇，高君輝.米糠添加量對真姬菇產(chǎn)量和品質(zhì)的影響[J].食用菌學報，2004，11（1）：42-45.

[12]姚榮錦.用玉米芯栽培真姬菇初探[J].黔東南民族師范高等?？茖W校學報，2002，20（3）：36-37.

[13]黃忠英.金針菇廢菌料栽培真姬菇試驗[J].食用菌，2014（4）：30-31．

[14]孫淑靜，顏松，胡開輝.斑玉蕈不同菌種類型的生產(chǎn)性能[J].河南科技大學學報，2010，31（1）：66-69.

[15]胡開輝，黃貴英，顏松，等.斑玉蕈低溫脅迫下菌絲體酶活變化及差異蛋白質(zhì)組學研究[J].菌物學報，2009，28（4）：584-590.

[16]郭艷艷，阮玲云，馮宏昌，等.不同營養(yǎng)條件下斑玉蕈菌絲生長及產(chǎn)酶特性[J].菌物學報，2014（3）：697-705.

[17]張瑞穎，左雪梅，姜瑞波.平菇褐斑病病原菌的分離與鑒定[J].中國食用菌，2007，26（5）：58-60.

[18]金丹，李寶聚，石延霞，等.一種平菇褐斑病病原菌的鑒定[J].食用菌學報，2009，16(1)：89-91.

[19]李德舜，曹新紅，蘇靜，等.平菇黃腐病病愿菌分離與鑒定[J].山東大學學報，2008，43(1)：4-7.

[20]白靜，楊洋，張秀云，等.金針菇褐斑病病原菌的分離篩選及防治[J]．中國食用菌，2006，25(4)：38-40.

[21]趙肖靜，石延霞，謝學文，等.一種金針菇新病害病原菌的鑒定[J]．食用菌，2013(5)：57-58.

[22]黃春燕，張柏松，萬魯長，等.金針菇工廠化生產(chǎn)中黑腐病病原菌的分離與鑒定[J]．食用菌學報，2012，19（1）：75-78.

[23]張園園.蛹蟲草栽培中幾種細菌性病原菌分離與鑒定[J].中國食用菌，2014，33（6）：46-48，55.

[24]李河，周國英，劉君昂.雙孢蘑菇褐腐病病原菌的分離與分子鑒定[J].食用菌學報，2009，16（2）：74-76.

[25]支月娥，黃建春，汪毅，等.杏胞菇細菌性病害病原菌研究[J].食用菌，2009，31（2）：60-61.

[26]蘭玉菲，安秀榮，王慶武，等.一種雞腿菇病害病原菌的分離及鑒定[J].山東農(nóng)業(yè)科學，2012，44（3）：84-87.

[27]陳少珍，黃思良，黃卓忠，等.蘑菇黑斑病病原菌分離與鑒定[J].廣西農(nóng)業(yè)科學，2009，40（1）：43-46.

[28]胡開輝，出小平.外界因子對蟹味菇菌絲特性的影響[J].中國食用菌，2008，27（2）：16-18.

[29]胡開輝.微生物學實驗[M].北京：中國林業(yè)出版社，2004：37-39.

Isolation and Identification of Latent Contaminating Microorganisms from Hypsizygus marmoreus Bag Secrect Yellow Liquid

ZHANG Zhi-shi1,LI Jia-huan1,ZHAN Sen-ran1,LAI Shu-fang1, WANG Li-fen2,CHEN Gui-zhen2,SUN Shu-jing1,2,HU Kai-hui12
(1.College of Life Sciences,Fujian Agriculture and Forestry University,Fuzhou 350002,China; 2.Gutian Edible Fungi Research Institute,Fujian Agriculture and Forestry University,Gutian 352200,China)

Hypsizygus marmoreus is one of the edible fungi produced by factories.In order to cut down contamination rate and safe cost,five bacteria and five fungi were isolated by spread－plate method,and they were identified by morphological observation and 16S rDNA and ITS sequence analysis respectively.The result showed that five bacteria belonged to Bacillus,Enterobacter,Cedecea,Pseudomonas,Luteibacter.And five fungi belong to Cladosporium,Penicillium,Aspergillus,Pleosporales, Fusarium.Phylogenetic tree showed that their kinship was far.

Hypsizygus marmoreus;contamination;isolation;identification

S646.9

A

1003-8310（2016）02-0061-06

10.13629/j.cnki.53－1054.2016.02.016

福建省高校產(chǎn)學研重大項目（2013N5004）；珍稀食用菌品種（斑玉蕈、繡球菌）創(chuàng)新與自動化生產(chǎn)技術產(chǎn)業(yè)化工程（2014S1477－8）；福建省食用菌產(chǎn)業(yè)技術重大研發(fā)平臺（2014N2001）。

張職視（1991－），男，在讀碩士研究生，主要從事食用菌開發(fā)與利用研究。E－mail:746830163@qq.com.

**通信作者：胡開輝（1962－），男，學士，教授，主要從事食用菌栽培與遺傳育種研究。E－mail:2692609765@qq.com

2016－01－11