復(fù)合多因素法對(duì)血瘀型肝纖維化大鼠模型的建立和評(píng)價(jià)＊

彭 岳，韋燕飛，趙鐵建，段雪琳，劉雪梅

（廣西中醫(yī)藥大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院 南寧 530200）

復(fù)合多因素法對(duì)血瘀型肝纖維化大鼠模型的建立和評(píng)價(jià)＊

彭 岳，韋燕飛，趙鐵建＊＊，段雪琳，劉雪梅

（廣西中醫(yī)藥大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院 南寧 530200）

目的：本研究在中醫(yī)學(xué)辨證思維指導(dǎo)下，根據(jù)血瘀證理論探索和改良造模方法，采用多因素復(fù)合法建立血瘀型肝纖維化病證結(jié)合大鼠模型。方法：通過二甲基亞硝胺、小牛血清白蛋白和去甲腎上腺素注射液聯(lián)合注射，外加乙醇灌胃及高脂低蛋白飼料喂養(yǎng)，多因素聯(lián)合構(gòu)建血瘀型肝纖維化大鼠模型。造模結(jié)束觀察大鼠的死亡率，評(píng)價(jià)中醫(yī)血瘀證證候，進(jìn)行證候等級(jí)評(píng)分，觀察肝臟病理學(xué)大體形態(tài)，檢測(cè)肝功能改變，采用免疫組化法觀察I型和III型膠原、α-平滑肌肌動(dòng)蛋白（α-SMA）3種膠原蛋白的表達(dá)情況、放射酶免法血清學(xué)檢測(cè)大鼠肝纖維化4項(xiàng)——HA、P3NP、LN、C IV的含量。將以上結(jié)果與傳統(tǒng)四氯化碳（CCl4）單因素造模法進(jìn)行比較。結(jié)果：血瘀證組：①大鼠的死亡率為20%；②大鼠出現(xiàn)瘀斑、舌紫暗、便溏等典型的中醫(yī)血瘀證證 候，血瘀證證候等級(jí)評(píng)分高；③病理學(xué)大體形態(tài)觀察發(fā)現(xiàn)肝臟出現(xiàn)表面暗白、密布灰白結(jié)節(jié)、質(zhì)硬脆等纖維樣變化；④血清學(xué)肝功能檢測(cè)發(fā)現(xiàn)模型大鼠的ALT和AST，以及TBIL、DBIL及IBIL的含量均顯著增加；⑤肝臟I型和III型膠原、α-SMA 3種膠原蛋白的表達(dá)水平顯著增高；⑥大鼠的血清肝纖維化4項(xiàng)——HA、P3NP、LN、C IV的含量均顯著增加。與CCl4模型組相比，多因素復(fù)合法所致血瘀證模型組以上各項(xiàng)結(jié)果（除了死亡率及肝功能外）更為明顯，結(jié)果有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.05）。結(jié)論：多因素復(fù)合造模方法能有效地改善CCl4造模法的高死亡率缺點(diǎn)；模型動(dòng)物同時(shí)具備了疾病與證候雙重特征，既符合中醫(yī)血瘀證證候的基本特點(diǎn)，又與西醫(yī)肝纖維化病理特征相一致。

血瘀證 肝纖維化 動(dòng)物模型

目前，現(xiàn)代醫(yī)學(xué)對(duì)肝纖維化形成及逆轉(zhuǎn)機(jī)制的研究層次走過了從器官到細(xì)胞，深入到了細(xì)胞因子及胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、基因表達(dá)的階段[1]。然而，中西醫(yī)結(jié)合依然是肝纖維化疾病治療研究的趨勢(shì)，此類研究必須要有一個(gè)符合要求的動(dòng)物模型作為研究平臺(tái)，才能保證實(shí)驗(yàn)過程和結(jié)果的準(zhǔn)確度和信度。而目前常用于肝纖維化研究的動(dòng)物模型，有的造模周期太長，有的死亡率太高，有的纖維化形成欠穩(wěn)定[2]。并且絕大多數(shù)此類由單因素作用而建立的動(dòng)物模型，并不能全面、準(zhǔn)確地復(fù)制出人類肝臟的纖維化病變（當(dāng)然更模擬不出病變狀況復(fù)雜的中醫(yī)血瘀證），限制了這些模型的應(yīng)用性和研究價(jià)值[3]。

針對(duì)上述情況，筆者以中醫(yī)學(xué)辨證思維作為指導(dǎo)，根據(jù)血瘀證理論，通過造模因素的優(yōu)化和方法的改良，采用新的多因素復(fù)合方法建立了一個(gè)血瘀證肝纖維化病證結(jié)合大鼠模型。結(jié)果顯示，該模型在較全面、準(zhǔn)確地復(fù)制人類肝纖維化疾病的同時(shí)，其病變更貼近中醫(yī)理論、具有血瘀證的特色：模型表現(xiàn)的證候與中醫(yī)血瘀證改變十分相似；其證候表現(xiàn)結(jié)合造模因素綜合分析，合乎血瘀證的中醫(yī)病理機(jī)制，較準(zhǔn)確地模擬出了“脾胃氣虛，痰濕瘀阻”中醫(yī)血瘀證型。該病證結(jié)合動(dòng)物模型的建立，可以使后續(xù)的、基于該模型的中西醫(yī)結(jié)合研究結(jié)果更為準(zhǔn)確可信、更具有說服力；為血瘀證肝纖維化的研究提供了一個(gè)良好的實(shí)驗(yàn)平臺(tái)，也給臨床肝纖維化疾病的治療探索提供了一個(gè)很好的有效切入點(diǎn)?，F(xiàn)把造模研究結(jié)果報(bào)告如下。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

四氯化碳（CCl4，自廣東汕頭達(dá)濠精細(xì)化學(xué)品公司，批號(hào)：20120513）；血清肝功能指標(biāo)五項(xiàng)（丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶、天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶、總膽紅素、直接膽紅素、間接膽紅素）測(cè)試試劑盒（上海科華東菱診斷用品有限公司，批號(hào)：20130318）；血清肝纖維化4項(xiàng)（透明質(zhì)酸、層粘蛋白、III型前膠原、IV型膠原）放射免疫分析藥盒（北京北方生物技術(shù)研究所，批號(hào)：130320）；膠原I第一抗體（Collagen I Ab-2）和膠原III第一抗體（Collagen III）（美國Santa Cruz公司，批號(hào)：20130515）；α-SMA（福建邁新生物工程有限公司，批號(hào)：20130411）；PV單克隆抗體工作液試劑盒（鼠Polymer Kit）和PV多克隆抗體工作液試劑盒（兔Polymer Kit）（北京中杉生物技術(shù)有限公司，批號(hào)：20130401，20130521）。

1.2 研究方法和實(shí)驗(yàn)方案

1.2.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組

45只SPF級(jí)健康SD大鼠，雄雌各半，體質(zhì)量150-180 g。由廣西中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心繁殖生產(chǎn)（實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用許可證：SYXK桂2003-0001）。

將大鼠隨機(jī)等分為3組，每組15只。第一組為空白對(duì)照組：普通方法飼養(yǎng)；第二組為血瘀證模型組：改良新方法病證結(jié)合動(dòng)物造模；第三組為CCl4模型組：傳統(tǒng)肝纖維化造模方法，陽性對(duì)照。

1.2.2 造模方法

1.2.2.1 血瘀證肝纖維化病證結(jié)合模型的制備

該模型的制備，參考并改良張斌等[4]研究者的“二甲基亞硝胺（Dimethyl nitroxide，DMN）、小牛血清白蛋白（Bovine Serum Albumin，BSA）和去甲腎上腺素注射液（Norepinephrine，NE）聯(lián)合注射造模法”，在該方法的基礎(chǔ)上（新法的步驟和方法上與該造模法不盡相同，對(duì)其進(jìn)行了藥物劑量上和用藥時(shí)間上等多項(xiàng)細(xì)節(jié)的探索及改良，以求更合理及有效），外加乙醇灌胃及高脂低蛋白飼料喂養(yǎng)， 多因素聯(lián)合建立起更為完善和貼切的氣滯血瘀模型。此法是一種制作病證結(jié)合血證肝纖維化動(dòng)物模型的新方法。具體步驟如下：①使用DMN建立大鼠肝纖維化模型；每天1次，以1 mg/100 g的劑量腹腔注射0.5%DMN，每周內(nèi)連續(xù)用藥3天，共給予8周；②從第2周開始，每天1次給造模大鼠尾靜脈注射NE，用生理鹽水配制成0.1 g·L-1濃度的注射液，給藥劑量為0.01 mg/100 g，共給予8周；③造模開始的第1天和第10天，分別給予大鼠尾靜脈注射BSA，用生理鹽水配制成50 g·L-1濃度的注射液，給藥劑量為0.025 mL/100 g。在上述基本造模法的基礎(chǔ)上，給予大鼠20%乙醇灌胃（用量：0.1 mL/100 g，每日2次）及高脂低蛋白飼料喂養(yǎng)（低蛋白飼料配方，以玉米面為主要成分；混合以20%的豬油及0.5%的膽固醇）。在整個(gè)模型復(fù)制過程中密切觀察動(dòng)物行為、體征、排便等改變，認(rèn)真監(jiān)視動(dòng)物的死亡情況并作詳細(xì)實(shí)驗(yàn)記錄。

該組動(dòng)物模型的復(fù)制時(shí)間約為8周。8周后對(duì)各大鼠的血瘀證候，按照陳可冀血瘀證證候分型標(biāo)準(zhǔn)[5]，自擬評(píng)分表進(jìn)行全面的血瘀等級(jí)評(píng)價(jià)；之后處死并解剖，取其肝臟病理標(biāo)本及血液標(biāo)本進(jìn)行檢測(cè)。這樣可獲得確切的、全面的檢測(cè)結(jié)果。

1.2.2.2 CCl4肝纖維化大鼠模型的制備

將肝毒劑CCl4與橄欖油配成40%濃度油劑，按0.3 mL/100 g劑量對(duì)組內(nèi)大鼠進(jìn)行皮下注射染毒，每周2次。第一次注射量加倍。染毒時(shí)間共計(jì)8周（肝纖維化病變約在造模6周時(shí)形成，第8周病變穩(wěn)定）[6]。造模過程認(rèn)真監(jiān)視動(dòng)物的死亡情況并作詳細(xì)實(shí)驗(yàn)記錄。

1.2.3 觀察的指標(biāo)及檢測(cè)方法

1.2.3.1 對(duì)大鼠進(jìn)行血瘀證證候等級(jí)評(píng)分：

觀察大鼠毛發(fā)、爪甲、舌質(zhì)舌象、舌下靜脈、眼球顏色、尾部色澤或瘀斑、糞便變化等證候情況。根據(jù)的血瘀證證候等級(jí)評(píng)分表（自擬）進(jìn)行評(píng)分并記錄，見表1。同時(shí)用數(shù)碼相機(jī)拍攝記錄大鼠的血瘀證候體征（如舌質(zhì)的紫暗程度與舌靜脈主干長度的比值等）。評(píng)分值越高說明血瘀程度越嚴(yán)重。最后將各組的各項(xiàng)目得分累積并進(jìn)行比較。

1.2.3.2 病理學(xué)肝臟大體形態(tài)的檢測(cè)

評(píng)分后，將各組模型大鼠處死，解剖取肝臟，進(jìn)行肝臟大體形態(tài)的觀察和比較。觀察要點(diǎn)[7]：①肝臟有無腫大，肝臟邊緣銳利或鈍；②肝臟的觸感和硬度；③肝臟的顏色和光澤（肝臟表面的顏色尤為重要）；④肝臟的表面及內(nèi)部有無細(xì)小顆粒，及顆粒的顏色。

1.2.3.3 測(cè)定血清肝功能指標(biāo)

大鼠進(jìn)行腹腔麻醉后，腹主動(dòng)脈采血，所得血液室溫下自然凝固3-4 h后，以3 000 r·min-1離心10 min，分離得血清。選擇新鮮無溶血的血清樣本進(jìn)行檢測(cè)。在在日立7180全自動(dòng)生化分析儀上進(jìn)行檢測(cè)：①血清谷丙轉(zhuǎn)氨酶（ALT）的含量（應(yīng)用紫外——乳酸脫氫酶法，波長340 nm）；②血清谷草轉(zhuǎn)氨酶（AST）的含量（應(yīng)用紫外——蘋果酸脫氫酶法，波長340 nm）；③總膽紅素（TBIL）及直接膽紅素含量（DBIL）的含量[應(yīng)用釩酸鹽氧化法，波長450 nm（主），546 nm（副）]；間接膽紅素含量（IBIL）=總膽紅素含量（TBIL）-直接膽紅素含量（DBIL）。

1.2.3.4 免疫組化法染色觀察肝臟膠原蛋白的表達(dá)水平

肝臟標(biāo)本取距離肝門2 cm處的肝組織，0.5 cm× 1 cm大小，用4%福爾馬林后固定12 h以上，然后經(jīng)脫水、透明、石蠟包埋、切片后進(jìn)行免疫組化法染色，檢測(cè)I、III型膠原及α-SMA 3種蛋白的表達(dá)情況。通過顯微攝像系統(tǒng)放大200倍進(jìn)行觀察，每張標(biāo)本片隨機(jī)選取3個(gè)視野進(jìn)行記錄，所得圖片結(jié)果采用Motic Med 6.0 CMIAS彩色圖像分析軟件進(jìn)行半定量分析。I、III型膠原、α-SMA這3種蛋白免疫組化染色的陽性反應(yīng)產(chǎn)物均為：出現(xiàn)位于細(xì)胞漿的棕黃色細(xì)顆粒狀物。采用固定大小的測(cè)量面積進(jìn)行采樣觀察，測(cè)定圖片的平均光密度值（MOD），MOD=膠原面積/肝組織面積×100%。

1.2.3.5 測(cè)定血清肝纖維化指標(biāo)

大鼠進(jìn)行腹腔麻醉后，腹主動(dòng)脈采血，所得血液室溫下自然凝固3-4 h后，以3 000 r·min-1離心10 min，分離得血清。選擇新鮮無溶血的血清樣本進(jìn)行檢測(cè)。在SN-697全自動(dòng)雙探頭放射免疫γ計(jì)數(shù)器上測(cè)定各血清試管的放射性計(jì)數(shù)，得到各樣本的肝纖4項(xiàng)指標(biāo)——血清透明質(zhì)酸（HA）、層粘蛋白（LN）、Ⅲ型前膠原（P3NP）、IV型膠原（C IV）的含量。

1.2.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

數(shù)據(jù)處理采用PEMS 3.1統(tǒng)計(jì)軟件分析。各組數(shù)據(jù)均以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，組間比較用單因素方差分析，以P＜0.05為有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1 各組大鼠死亡情況

造模過程認(rèn)真監(jiān)測(cè)各組大鼠的死亡情況，并進(jìn)行詳細(xì)記錄。實(shí)驗(yàn)過程中空白對(duì)照組大鼠未見死亡；血瘀證模型組大鼠從造模第5周起出現(xiàn)死亡情況，造模結(jié)束共計(jì)死亡3只；CCl4組大鼠從造模第3周起有死亡，造模結(jié)束共計(jì)死亡5只；詳細(xì)情況見表2。

表1 血瘀證肝纖維化大鼠證候等級(jí)評(píng)分表

表2 各組大鼠死亡數(shù)量/只

2.2 血瘀證證候等級(jí)評(píng)分結(jié)果

第8周實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)，空白對(duì)照組大鼠的一般狀況與實(shí)驗(yàn)前相比無明顯變化。血瘀證模型組大鼠的毛發(fā)黯淡枯燥，舌面色青紫有瘀斑，舌底色紫暗且舌靜脈主干長度超過3/4，眼球顏色暗紅，尾巴出現(xiàn)中度以上瘀斑，糞便稀溏，不成形（見圖1），具有典型的血瘀證證候。CCl4組大鼠出現(xiàn)瘦削、厭食、活動(dòng)減少，但上述血瘀證候不明顯。比較血瘀證證候等級(jí)評(píng)分表的積分，各組出現(xiàn)顯著差異性，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），詳見表3。

表3 血瘀證等級(jí)積分表（，n=15）

表3 血瘀證等級(jí)積分表（，n=15）

注：與空白組比較，**P＜0.01；與CCl4組比較，△△P＜0.01。

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2.3 病理學(xué)肝臟大體形態(tài)觀察比較的結(jié)果：

圖1 血瘀證模型組證候表現(xiàn)

肉眼觀察及比較各組大鼠的肝臟大體觀（圖2）?？瞻讓?duì)照組大鼠肝臟表面光滑，外觀呈紅褐色，質(zhì)地軟、富彈性，肝邊緣銳利。血瘀證模型組大鼠中（n=15）有9只肝臟顏色深紅發(fā)暗，表面分布有較多灰白色小結(jié)節(jié)，肝臟深處可見滿布深紅色小結(jié)節(jié)，肝臟觸感質(zhì)地較實(shí)，切割較脆易碎，邊緣鈍、厚，部分表面出現(xiàn)輕度桔皮樣變，有明顯油膩感；其余6只大鼠肝臟顏色較為淡白，質(zhì)地尚軟，油膩感不強(qiáng)。CCl4組大鼠（n=15）中有8只肝臟顏色呈暗灰白色，肝臟稍增大，表面光滑；有4只肝臟顏色為淡紅，表面有散在的灰白色小結(jié)節(jié)；其余3只肝臟顏色為灰色，表面有較密集的灰白色小結(jié)節(jié)。

圖2 各組大鼠肝臟大體觀

2.4 血清肝功能指標(biāo)檢測(cè)的結(jié)果

與空白對(duì)照組相比，血瘀證模型組和CCl4造模組的血清肝功能指標(biāo)——ALT、AST、TBIL、DBIL 及IBIL的含量均顯著上升，差異有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）；而血瘀證模型組的AST、TBIL和DBIL 3項(xiàng)指標(biāo)高于CCl4造模組，其差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），詳見表4。

2.5 免疫組化法染色觀察I型膠原和III型膠原、α-SMA的表達(dá)水平

空白對(duì)照組中，肝組織的I型膠原和III型膠原、α-SMA 3種蛋白均有少量分布于匯管區(qū)、血管壁及膽管壁，在肝實(shí)質(zhì)內(nèi)沿肝竇壁形成絲狀著色，免疫組化染色呈弱陽性。血瘀證模型組肝組織中的I型膠 原和III型膠原、α-SMA 3種蛋白主要分布于中央靜脈周圍（見圖3、表5）及纖維組織增生的匯管區(qū)（見圖4、表6），可形成寬而粗大的纖維條索，狄氏間隙有沉積，纖維間隔強(qiáng)陽性染色。CCl4造模組肝組織中I型膠原和III型膠原、α-SMA 3種蛋白的分布區(qū)域與血瘀證模型組基本相似，但部分狄氏間隙、匯管區(qū)及中央靜脈周圍的陽性區(qū)域較血瘀證模型組小，著色較淺；纖維間隔的染色也較弱。分別比較中央靜脈區(qū)及匯管區(qū)各組標(biāo)本的MOD值，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

2.6 血清學(xué)肝纖維化指標(biāo)檢測(cè)的結(jié)果

與空白對(duì)照組相 比，血瘀證模型組和CCl4造模組的血清肝纖4項(xiàng)——HA、P3NP、LN、C IV的含量均顯著上升，差異有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）；而血瘀證模型組的HA、LN、C IV 3項(xiàng)指標(biāo)的檢測(cè)結(jié)果高于CCl4造模組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），詳見表7。

表4 血清肝功能指標(biāo)5項(xiàng)檢測(cè)的結(jié)果（，n=15）

表4 血清肝功能指標(biāo)5項(xiàng)檢測(cè)的結(jié)果（，n=15）

注：與空白組比較，**P＜0.01；與CCl4組比較，△P＜0.05。

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3 討論

中國的肝纖維化疾病發(fā)生率持續(xù)較高水平，是嚴(yán)重危害人類健康的常見病之一，近年來抗肝纖維化的治療和逆轉(zhuǎn)肝纖維化進(jìn)程的研究受到國內(nèi)外的高度重視[8]。對(duì)于肝纖維化，中醫(yī)理論認(rèn)為：肝纖維化具有瘀血或癥積、痞塊的特征，歸屬于脅痛、黃疸、積聚、癥瘕等病的范疇[9]。統(tǒng)計(jì)并分析近年來中醫(yī)藥治療肝纖維化較為完整的文獻(xiàn)38篇、共計(jì)3 800余病例的臨床資料可以發(fā)現(xiàn)，氣滯血瘀是肝纖維化最主要的證型，該證貫穿肝纖維化發(fā)病的全過程，成為最重要的病因之一[10]。在慢性肝病的演變過程中，濕熱邪毒是主要致病因素，血瘀則是重要的病理產(chǎn)物。病理學(xué)研究報(bào)道[11]，一方面，肝細(xì)胞及血竇內(nèi)上皮細(xì)胞發(fā)生變性壞死，可引起肝組織的微循環(huán)障礙進(jìn)而出現(xiàn)血瘀證；而且發(fā)生纖維化的肝組織分泌大量膠原蛋白形成條束，也參與了血瘀證的形成。另一方面，瘀血在肝纖維化病變中主要表現(xiàn)在肝臟微循環(huán)障礙及纖維結(jié)締組織的增生[12]。這些都為活血化瘀法及活血化瘀類藥物治療纖維增生性疾病提供了強(qiáng)有力的可靠實(shí)驗(yàn)依據(jù)。故筆者提出可以從血瘀證的視角出發(fā)研究肝纖維化的形成機(jī)制和逆轉(zhuǎn)機(jī)制，采用活血化瘀的方法來控制及治療肝纖維化疾病，為肝纖維化疾病的研究提供一個(gè)新的切入點(diǎn)。

圖3 中央靜脈區(qū)各組Ⅰ、Ⅲ型膠原和α-SMA蛋白表達(dá)染色

表5 中央靜脈區(qū)Ⅰ、Ⅲ型膠原和α-SMA蛋白平均光密度值結(jié)果（，n=15）

表5 中央靜脈區(qū)Ⅰ、Ⅲ型膠原和α-SMA蛋白平均光密度值結(jié)果（，n=15）

注：與空白組比較，*P＜0.05；與CCl4組比較，△P＜0.05。

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表6 匯管區(qū)Ⅰ、Ⅲ型膠原和α-SMA蛋白平均光密度值結(jié)果（，n=15）

表6 匯管區(qū)Ⅰ、Ⅲ型膠原和α-SMA蛋白平均光密度值結(jié)果（，n=15）

注：與空白組比較，*P＜0.05；與CCl4組比較，△P＜0.05。

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本實(shí)驗(yàn)給中西醫(yī)結(jié)合血瘀證肝纖維化研究提供了一個(gè)符合要求的病證結(jié)合動(dòng)物模型。在中醫(yī)學(xué)辨證思維指導(dǎo)下，根據(jù)血瘀證的病機(jī)理論，通過對(duì)造模方法的思考和比較，通過造模因素的優(yōu)化和方法的改良，采用新的多因素復(fù)合方法建立了一個(gè)血瘀證肝纖維化病證結(jié)合大鼠模型。該方法整合并改良傳統(tǒng)的病證結(jié)合肝纖維化大鼠造模技術(shù)，其原理及特點(diǎn)在于：①用DMN取代肝臟毒性藥物CCl4來誘導(dǎo)大鼠肝纖維化，主要是利用DMN 更為全面的肝臟損傷特性[13]，如肝毒性、免疫毒性和基因毒性等，使肝臟的纖維化改變更穩(wěn)定，能較好地克服CC14造模時(shí)肝纖維化病變自愈的傾向；而且在此基礎(chǔ)上并不升高造模動(dòng)物的死亡率；②氣滯血瘀的病因之一為內(nèi)感憂怒，生理學(xué)研究發(fā)現(xiàn)情緒劇烈變化（如應(yīng)激、暴怒）時(shí)機(jī)體會(huì)分泌大量的以去甲腎上腺素為主的激素，所以該實(shí)驗(yàn)中運(yùn)用多次反復(fù)注射去甲腎上腺素的方法引發(fā)血管內(nèi)皮慢性損傷，并誘導(dǎo)紅細(xì)胞和血小板聚集，以此模擬中醫(yī)“氣滯”，引發(fā)模型大鼠的急性血瘀證候；③小牛血清白蛋白[14]作為異種抗原，多次注射可誘發(fā)III型變態(tài)反應(yīng)，形成沉積于血管內(nèi)皮的免疫復(fù)合物，聯(lián)合腎上腺素?fù)p傷血管內(nèi)皮細(xì)胞；同時(shí)該免疫復(fù)合物還通過誘導(dǎo)紅細(xì)胞和血小板發(fā)生聚集，進(jìn)一步促進(jìn)血瘀證的形成。研究中發(fā)現(xiàn)將NE與BSA聯(lián)合應(yīng)用，可較快地使造模動(dòng)物產(chǎn)生高黏、高聚、高濃、高凝的瘀血類病理變化；這指導(dǎo)理論與血瘀證的中醫(yī)病理機(jī)制較為符合，證候表現(xiàn)也與血瘀證很相似；④本造模方法的重要改良是給予大鼠20%乙醇灌胃及高脂低蛋白飼養(yǎng)，該措施是為了進(jìn)一步模仿中醫(yī)痰濕和血瘀的病機(jī)，使大鼠飲食失節(jié)而達(dá)到減少其生氣之源、引發(fā)其氣滯，后致痰濕血瘀的目的。酒性濕且熱，常飲可致使?jié)駸衢L期困阻中焦，進(jìn)而濕熱邪毒可交蒸于肝膽；而中醫(yī)理論還認(rèn)為“肥甘厚味易致膏粱之疾”，滋膩礙胃而傷脾，使后天氣血生化乏源，又可助生痰濕導(dǎo)致氣滯瘀血的發(fā)生和加劇，這樣改良的飼養(yǎng)方法造出的動(dòng)物模型更合乎中醫(yī)理論，可以更全面、準(zhǔn)確地復(fù)制“脾胃氣虛，痰濕瘀阻”病證。

圖4 匯管區(qū)各組Ⅰ、Ⅲ型膠原和α-SMA蛋白表達(dá)染色

表7 放射酶免法檢測(cè)血清肝纖4項(xiàng)的結(jié)果（，n=15，ng·mL-1）

表7 放射酶免法檢測(cè)血清肝纖4項(xiàng)的結(jié)果（，n=15，ng·mL-1）

注：與空白組比較，**P＜0.01；與CCl4組比較，△P＜0.05。

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造模結(jié)束后，對(duì)該復(fù)合多因素方法造出的動(dòng)物模型進(jìn)行檢測(cè)驗(yàn)證，結(jié)果為：①應(yīng)用該改良的病證結(jié)合新方法造模，大鼠的死亡率為20%，低于傳統(tǒng)CCl4單因素造模法的死亡率（33.3%）；可見該新方法在控制造模動(dòng)物死亡率的方面是有效的；②血瘀證證候等級(jí)評(píng)分結(jié)果顯示，造模大鼠出現(xiàn)瘀斑、舌紫暗、便溏等典型的中醫(yī)血瘀證證候，成功復(fù)制出了“脾胃氣虛，痰濕瘀阻”的中醫(yī)證；③病理學(xué)大體形態(tài)觀察，肉眼可見模型大鼠肝臟出現(xiàn)表面暗白、密布灰白結(jié)節(jié)、質(zhì)硬脆等纖維樣變化，可見肝臟正常結(jié)構(gòu)已經(jīng)被破壞；④生化血清學(xué)肝功能檢測(cè)發(fā)現(xiàn)模型大鼠的ALT和AST，以及TBIL、DBIL及IBIL的含量均有顯著上升，高水平的轉(zhuǎn)氨酶和膽紅素值說明大鼠肝功能已經(jīng)受到明顯損害；⑤免疫組化法染色發(fā)現(xiàn)，可以直接反映肝纖維化程度的I型和III型膠原、α-SMA 3種膠原蛋白的表達(dá)水平顯著增高，表明肝臟內(nèi)發(fā)生了纖維化膠原沉積；⑥放射酶免法血清學(xué)檢測(cè)的結(jié)果表明，大鼠的血清肝纖維化4項(xiàng)指標(biāo)——HA、P3NP、LN、C IV的含量均顯著上升，高水平的肝纖維化血清標(biāo)志物進(jìn)一步證實(shí)了肝臟纖維化已經(jīng)穩(wěn)定形成。綜上結(jié)果證明，該造模方法能有效地改善CCl4造模法的高死亡率缺點(diǎn)；同時(shí)模型動(dòng)物具備了疾病與證候雙重特征，既符合中醫(yī)血瘀證證候的基本特點(diǎn)，又與西醫(yī)肝纖維化病理特征相一致，該改良新方法造模成功。此模型為一較穩(wěn)定、理想的慢性血瘀證肝纖維化病證結(jié)合動(dòng)物模型，具有較好的應(yīng)用性和研究價(jià)值；可用于中西醫(yī)結(jié)合肝纖維化疾病的基礎(chǔ)、臨床研究，及活血化瘀方藥作用機(jī)制的探討，為肝病的防治做出貢獻(xiàn)。

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Establishment and Evaluation of Compound Multifactor-induced Liver Fibrosis Rat Model with Blood Stasis Syndrome

Peng Yue, Wei Yanfei, Zhao Tiejian, Duan Xuelin, Liu Xuemei
(School of Basic Medical Sciences, Guangxi University of Traditional Chinese Medicine, Nanning 530200, China)

Under the guidance of traditional Chinese medicine (TCM) syndrome differentiation, the liver fibrosis rat model with blood stasis syndrome induced by multifactor method was established according to the theory of blood stasis syndrome. The multifactor method, which included the injection of dimethyl nitrosamine, bovine serum albumin and norepinephrine, ethanol lavage and high-fat, low-protein feed, was used in the establi shment of liver fibrosis rat model with blood stasis syndrome. After the establishment of rat model, the rat mortality was observed for the evaluation of TCM blood stasis syndrome. The syndrome rank was also scored. The pathology gross morphology of the liver was observed. Changes of liver function were detected. Immunohistochemical method was used to observe the expression levels of three collagens——the type I and type III collagen, and α-SMA. The radioactive enzyme immunoassay was used in the detection of the contents of HA, P3NP, LN and C IV in liver fibrosis rats. Finally the results were compared to the traditional model establishment by the CCl4 single facto r method. The results showed that in the blood stasis syndrome group, the rat mortality was 20%. The rat presented with typical symptoms of TCM blood stasis syndrome, such as ecchymosis, dark purple tongue, loose stool and etc. The score of blood stasis syndrome ranked with high grade. The observation of pathology gross morphology of the liver sho wed fibrillation which included dark white surface, pale nodules, hard brittle texture, and etc. The serological liver function tests showed that contents of ALT, AST, TBIL, DBIL and IBIL were obviously increased in the model rat. The expression levels of type I and type III collagen, and α-SMA were obviously increased. The contents of HA, P3NP, LN and C IV were obviously increased. Compared with the CCl4 model group, different results (except the rat mortality and liver function) of the compound multifactor-induced blood stasis syndrome model were more obvious with statistical differences (P ＜ 0.05). It was concluded that the compound multifactorinduced model can effectively improve the shortage of high mortality in CCl4 model establishment method. The animal model acquired both the characteristics of disease and syndrome, which was in accordance with the basic features of TCM blood stasis syndrome and the pathological features of liver fibrosis in modern medicine.

Blood stasis syndrome, liver fibrosis, animal model

10.11842/wst.2016.01.024

R575

A

（責(zé)任編輯：朱黎婷 張志華，責(zé)任譯審：王 晶）

2015-08-03

修回日期：2015-12-19

＊ 國家自然科學(xué)基金地區(qū)科學(xué)基金項(xiàng)目（81160553）：白花丹醌對(duì)肝纖維化HSEC的干預(yù)作用 及其機(jī)制研究，負(fù)責(zé)人：趙鐵建；國家自然科學(xué)基金地區(qū)科學(xué)基金項(xiàng)目（81260675）：白花丹醌干預(yù)肝癌血管新生及其信號(hào)調(diào)控研究，負(fù)責(zé)人：韋燕飛；國家自然科學(xué)基金青年科學(xué)基金項(xiàng)目（81403189）：基于TLR4通道的白 花丹醌抗肝纖維化及活血化瘀作用機(jī)制研究，負(fù)責(zé)人：彭岳；廣西科學(xué)研究與技術(shù)開發(fā)計(jì)劃基金項(xiàng)目（桂科攻13349005）：基于HSEC的血瘀型肝纖維化模型構(gòu)建與壯藥的活血化瘀藥效評(píng)價(jià)研究，負(fù)責(zé)人：趙鐵建；廣西研究生 教育創(chuàng)新計(jì)劃基金項(xiàng)目（JGY2014082）：基于研究生創(chuàng)新教育模式的研究生導(dǎo)師團(tuán)隊(duì)建設(shè)與研究，負(fù)責(zé)人：趙鐵建。

＊＊ 通訊作者：趙鐵建，教授，主要研究方向：民族藥防治慢性肝病基礎(chǔ)與臨床研究。