基于ITS2序列的禹州漏蘆和漏蘆藥材基因識(shí)別＊

陳江平，侯典云，嚴(yán)緒華，胡志強(qiáng)，魏 蒙，胡志剛,5＊＊，汪樂原＊＊

（1. 湖北中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院 武漢 430065；2. 河南科技大學(xué)農(nóng)學(xué)院 洛陽 471023；3. 武漢市中醫(yī)醫(yī)院 武漢 430010； 4. 武漢市第一醫(yī)院 武漢 430022；5. 中國中醫(yī)科學(xué)院中藥研究所 北京 100700）

基于ITS2序列的禹州漏蘆和漏蘆藥材基因識(shí)別＊

陳江平1，侯典云2，嚴(yán)緒華3，胡志強(qiáng)4，魏 蒙1，胡志剛1,5＊＊，汪樂原1＊＊

（1. 湖北中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院 武漢 430065；2. 河南科技大學(xué)農(nóng)學(xué)院 洛陽 471023；3. 武漢市中醫(yī)醫(yī)院 武漢 430010； 4. 武漢市第一醫(yī)院 武漢 430022；5. 中國中醫(yī)科學(xué)院中藥研究所 北京 100700）

目的：應(yīng)用ITS2序列鑒別禹州漏蘆和漏蘆藥材的真?zhèn)危瑸榕R床準(zhǔn)確用藥提供可靠的基因識(shí)別方法。方法：收集多基原藥材禹州漏蘆基原物種藍(lán)刺頭和華東藍(lán)刺頭共14份樣品和漏蘆藥材基原物種祁州漏蘆8份樣品，經(jīng)實(shí)驗(yàn)獲取ITS2序列，結(jié)合GenBank中20條相關(guān)近緣混偽品序列，建立以上物種和混偽品的DNA條形碼鑒定方法；將從市場上收集的11份禹州漏蘆和20份漏蘆藥材的ITS2序列與以上序列進(jìn)行比對(duì)分析和構(gòu)建系統(tǒng)NJ樹。結(jié)果：禹州漏蘆兩個(gè)基原物種的序列主導(dǎo)單倍型相同；禹州漏蘆和漏蘆藥材基原物種最大K2P距離均小于其與混偽品的種間最小K2P距離；系統(tǒng)NJ樹分析均能準(zhǔn)確區(qū)分禹州漏蘆和漏蘆藥材與各自混偽品。藥材檢測結(jié)果表明，11份禹州漏蘆中10份為正品，1份為偽品；20份漏蘆中2份為正品，18份為偽品。結(jié)論：本研究建立了基于ITS2序列的禹州漏蘆和漏蘆藥材DNA條形碼鑒定方法，可用于快速鑒別禹州漏蘆和漏蘆藥材真?zhèn)巍?/p>

禹州漏蘆 漏蘆 ITS2序列 基因識(shí)別 近緣混偽品

禹州漏蘆為菊科藍(lán)刺頭屬植物藍(lán)刺頭Echinops latifolius Tausch.或華東藍(lán)刺頭Echinops grijisii Hance的干燥根[1]。這兩個(gè)種為中國特有物種，分布于遼寧南部、浙江、山東、安徽、江蘇、福建等地區(qū)[2，3]。漏蘆始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，為菊科漏蘆屬植物祁州漏蘆Rhaponticum uniflorum （L.） DC.的干燥根。在中國分布的漏蘆屬僅有2個(gè)物種，為祁州漏蘆和鹿草R. carthamoides （Willd.） Dittrich[4，5]。禹州漏蘆曾與漏蘆均作為漏蘆藥材收載于《中華人民共和國藥典》，近代研究表明兩者的化學(xué)成分及療效各有不同，禹州漏蘆具有良好的抗炎消腫、抗腫瘤、抗病毒作用；漏蘆具有較好的抗動(dòng)脈粥樣硬化、抗脂質(zhì)過氧化、免疫促進(jìn)、改善腦功能和抗衰老作用[6-8]。因此，《中華人民共和國藥典》1995年版開始將祁州漏蘆單獨(dú)作為漏蘆藥材使用，故禹州漏蘆和漏蘆藥材需區(qū)別使用[9]。歷代本草所述漏蘆藥材的基原物種不盡相同，民間混用、誤用情況普遍，漏蘆的混偽品涉及8個(gè)科約30種植物，嚴(yán)重影響了臨床用藥的準(zhǔn)確性和安全性[2]。因此，尋找一種快速、簡便、可靠的禹州漏蘆和漏蘆藥材及其混偽品鑒定方法尤為重要。

DNA條形碼技術(shù)（DNA Barcoding）是指利用基因組中一段公認(rèn)的、相對(duì)較短的DNA片段來進(jìn)行物種鑒定的分子診斷新技術(shù)。陳士林等[10]提出的以ITS2為主，psbA-trnH為輔的藥用植物條形碼鑒定體系已得到廣泛認(rèn)可[11]，目前已成功應(yīng)用于功勞葉、牡丹皮、葶藶子、蒼耳子等大量藥材的物種鑒定[12-15]。本研究采用ITS2序列鑒定禹州漏蘆和漏蘆藥材及其近緣混偽品，為其快速準(zhǔn)確鑒定、臨床用藥安全及資源開發(fā)利用提供可靠的基因識(shí)別方法。

1 材料

本研究實(shí)驗(yàn)材料包括禹州漏蘆基原物種藍(lán)刺頭8份、華東藍(lán)刺頭6份，漏蘆基原物種祁州漏蘆8份以及祁州漏蘆同屬物種鹿草1份。所有樣品經(jīng)中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥用植物研究所林余霖研究員鑒定，憑證標(biāo)本保存于中國中醫(yī)科學(xué)院中藥研究所。同時(shí)，從GenBank數(shù)據(jù)庫下載20條相關(guān)近緣混偽品序列，所有序列經(jīng)查閱文獻(xiàn)驗(yàn)證，確保準(zhǔn)確可靠[10,16-18]。禹州漏蘆和漏蘆藥材基原物種及其近緣混偽品的ITS2序列信息詳情見表1。

表1 禹州漏蘆和漏蘆藥材基原物種及其近緣混偽品ITS2序列信息

2 方法

2.1 DNA提取、PCR擴(kuò)增及測序和數(shù)據(jù)處理

用75%乙醇擦拭實(shí)驗(yàn)樣品表面，取禹州漏蘆基原物種藍(lán)刺頭、華東藍(lán)刺頭和漏蘆基原物種祁州漏蘆葉片各30 mg，鹿草根莖50 mg。用球磨儀（德國Retsch MM400公司）研磨2 min（30次/s），然后用改良的CTAB法提取植物總DNA。采用通用引物、PCR反應(yīng)條件及擴(kuò)增程序?qū)悠房侱NA進(jìn)行ITS2序列擴(kuò)增[19]。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測，對(duì)條帶單一且清晰的PCR產(chǎn)物進(jìn)行雙向測序。測序峰圖用CodonCode Aligner V4.2.4（美國CodonCode Co公司）進(jìn)行校對(duì)拼接，基于隱馬爾可夫模型HMMer注釋除去低質(zhì)量端，獲得ITS2序列，并提交至NCBI得到GenBank登錄號(hào)。

2.2 基原物種和市場收集的藥材鑒定分析

利用MEGA（Molecular Evolutionary Genetics Analysis）6.0對(duì)拼接后的禹州漏蘆和漏蘆藥材基原物種及其混偽品ITS2序列進(jìn)行比對(duì)分析，計(jì) 算 種 內(nèi) 和 種 間K2P(Kimura 2-parameter)距離，并將序列提交到中藥材DNA條形碼鑒定系統(tǒng)（http://www.tcmbarcode.cn/china/），用 于 后 續(xù)研究。將從市場上收集的11份禹州漏蘆藥材（編號(hào)：YC0004YP01-11）和20份漏蘆藥材（編號(hào)：YC0003YP01-20）的ITS2序列導(dǎo)入到中藥材DNA條形碼鑒定系統(tǒng)進(jìn)行最大相似度比對(duì)鑒定，并結(jié)合兩種藥材基原物種及其混偽品的ITS2序列共同構(gòu)建系統(tǒng)NJ（Neighbor Joining）樹，以檢測兩種藥材的真?zhèn)巍?/p>

3 基原物種鑒定結(jié)果與分析

3.1 ITS2序列變異位點(diǎn)分析

禹州漏蘆基原物種藍(lán)刺頭和華東藍(lán)刺頭共14條序列，序列比對(duì)后長度為220 bp，有2個(gè)單倍型。由于華東藍(lán)刺頭的6條序列均為A1型，且兩個(gè)物種的主導(dǎo)單倍型相同，故以禹州漏蘆的兩個(gè)基原物種為整體進(jìn)行后續(xù)分析，其變異位點(diǎn)見表2。兩個(gè)基原物種和同屬混偽品16條ITS2序列中共產(chǎn)生55個(gè)變異位點(diǎn)。

漏蘆基原物種祁州漏蘆共11條序列，序列比對(duì)后長度為222 bp，有7個(gè)單倍型，產(chǎn)生5個(gè)變異位點(diǎn)，見表3。祁州漏蘆與同屬物種鹿草的2條ITS2序列共產(chǎn)生10個(gè)變異位點(diǎn)。

3.2 K2P距離分析

基于MEGA6.0分析兩種藥材基原物種的種內(nèi)K2P距離及其與混偽品的種間K2P距離，詳見表4。由結(jié)果可知，禹州漏蘆藥材最大K2P距離（0.004 6）小于其與混偽品的最小K2P距離(0.014 0)，平均K2P距離（0.000 7）小于其與混偽品的種間平均K2P距離（0.146 9）；漏蘆藥材最大K2P距離(0.018 5)小于其與混偽品的最小K2P距離（0.023 3），平均K2P距離（0.007 5）小于其與混偽品的種間平均K2P距離（0.250 2），這說明K2P距離可以將禹州漏蘆和漏蘆藥材與其混偽品區(qū)分開。

表2 藍(lán)刺頭和華東藍(lán)刺頭ITS2序列變異位點(diǎn)

表3 祁州漏蘆ITS2序列變異位點(diǎn)

表4 禹州漏蘆和漏蘆藥材及其混偽品K2P距離

4 市場收集藥材結(jié)果鑒定分析

4.1 序列比對(duì)鑒定結(jié)果

禹州漏蘆藥材（編號(hào)：YC0004YP01-11）和漏蘆藥材（編號(hào)：YC0003YP01-20）ITS2序列的最大相似度比對(duì)鑒定結(jié)果中，10份禹州漏蘆藥材可比對(duì)到其基原物種藍(lán)刺頭或華東藍(lán)刺頭，1份比對(duì)到其它科屬物種；20份漏蘆藥材中，2份可比對(duì)到其基原物種祁州漏蘆，18份比對(duì)到其它科屬物種。比對(duì)結(jié)果詳見表5。

4.2 NJ樹鑒定結(jié)果

基于ITS2序列構(gòu)建的系統(tǒng)NJ樹中，禹州漏蘆的基原物種藍(lán)刺頭和華東藍(lán)刺頭聚為一支，漏蘆的基原物種祁州漏蘆單獨(dú)聚為一支，且均能與它們的混偽品區(qū)分開。11份禹州漏蘆藥材中有10份與基原物種聚為一支，1份在其它支上；20份漏蘆藥材中只有2份聚到基原物種的支上，18份分散在其它支上。

5 討論

5.1 ITS2序列鑒定禹州漏蘆和漏蘆藥材基原物種的準(zhǔn)確性和可靠性

本研究表明，基于ITS2序列可將禹州漏蘆的基原物種藍(lán)刺頭和華東藍(lán)刺頭與漏蘆的基原物種祁州漏蘆區(qū)分開，且均能與各自的混偽品區(qū)分開；藍(lán)刺頭和華東藍(lán)刺頭在NJ樹上聚為一支，且主導(dǎo)單倍型相同，故將其作為整體進(jìn)行分析。ITS2序列變異分析可知，兩個(gè)藥材的基原物種與同屬混偽品種間變異位點(diǎn)數(shù)均明顯大于其種內(nèi)變異位點(diǎn)數(shù)。K2P距離表明，禹州漏蘆和漏蘆的種內(nèi)最大（平均）K2P距離均小于它們與各自混偽品的種間最?。ㄆ骄㎏2P距離。從構(gòu)建的NJ樹可知，兩種藥材的基原物種均單獨(dú)聚為一支。綜上可知，ITS2序列能將兩種藥材基原物種與各自的混偽品區(qū)分開。

表5 禹州漏蘆和漏蘆藥材ITS2序列比對(duì)鑒定結(jié)果

5.2 ITS2序列檢測市場收集的禹州漏蘆和漏蘆藥材真?zhèn)蔚目尚行?/p>

基于序列相似性比對(duì)和系統(tǒng)NJ樹對(duì)兩種藥材真?zhèn)舞b定的結(jié)果均表明，11份禹州漏蘆藥材中，10份為正品，1份為混偽品；20份漏蘆藥材中，只有2份為正品，其余均為混偽品。需要說明的是，本研究目的是檢測藥材真?zhèn)?，而不?cè)重對(duì)藥材混偽品進(jìn)行基原物種溯源；故對(duì)于ITS2序列比對(duì)結(jié)果為其它科屬物種的市場收集的藥材樣品，本研究只認(rèn)為其為混偽品，而無需明確其基原物種，因此該方法適用于禹州漏蘆和漏蘆藥材的真?zhèn)螜z測。隨著中藥材DNA條形碼鑒定系統(tǒng)數(shù)據(jù)庫的不斷完善，對(duì)于藥材檢測的物種鑒定結(jié)果將更加穩(wěn)定可靠。

5.3 中藥材DNA提取方法的選擇

DNA提取是中藥材DNA條形碼鑒定的首要環(huán)節(jié)，能否獲得符合要求的高質(zhì)量DNA是決定DNA條形碼鑒定能否成功的關(guān)鍵因素[20]。常用的動(dòng)植物總DNA提取方法有試劑盒法和CTAB法。試劑盒法具有快速、方便、避免有機(jī)溶劑污染等優(yōu)點(diǎn)，但是成本偏高；且根據(jù)曹琳等[21]和羅焜等[22]等的研究，試劑盒對(duì)DNA降解嚴(yán)重的中藥材不太適用。本研究采用改良的CTAB法配制DNA提取試劑，用于提取禹州漏蘆和漏蘆兩種根莖類藥材及其葉片的DNA，序列擴(kuò)增成功率為100%，測序峰圖質(zhì)量高，這表明改良的CTAB法適用于根莖類藥材及其葉片的DNA提取，且大大降低了獲取高質(zhì)量DNA的成本。隨著DNA條形碼鑒定中藥材技術(shù)的不斷普及，運(yùn)用改良的CTAB法提取藥材DNA的方法將實(shí)現(xiàn)標(biāo)準(zhǔn)化流程。

圖2 基于ITS2序列的市場收集的禹州漏蘆和漏蘆藥材及其混偽品NJ樹

5.4 DNA條形碼技術(shù)對(duì)市售藥材進(jìn)行監(jiān)管的可行性

本研究對(duì)市場流通的禹州漏蘆和漏蘆藥材真?zhèn)舞b定結(jié)果表明，兩種藥材均存在混偽情況，其中漏蘆藥材尤為嚴(yán)重。市售藥材品種混亂給中藥安全和準(zhǔn)確使用造成極大隱患，傳統(tǒng)鑒定方法已經(jīng)難以滿足藥店、醫(yī)院、企業(yè)等各行業(yè)對(duì)藥材進(jìn)行快速、標(biāo)準(zhǔn)化鑒定的需求，建立新的檢測方法對(duì)市售藥材真?zhèn)芜M(jìn)行監(jiān)管十分必要和迫切[23，24]。DNA條形碼技術(shù)在物種鑒定上具有快速、準(zhǔn)確、高效和通用性等特點(diǎn)，并且不受藥材生長年限、藥用部位、植物性狀和研究者鑒別經(jīng)驗(yàn)等因素的影響，基于通用的標(biāo)準(zhǔn)化技術(shù)流程可以實(shí)現(xiàn)對(duì)中藥材真?zhèn)蔚目焖佟?zhǔn)確鑒定，非常適用于對(duì)市售藥材的真?zhèn)芜M(jìn)行監(jiān)管。中藥材DNA條形碼分子鑒定指導(dǎo)原則已經(jīng)被納入《中華人民共和國藥典》，為中藥材基原物種的鑒定提供了強(qiáng)有力的技術(shù)支撐[25，26]。目前，DNA條形碼技術(shù)已成功用于枸杞子、羌活、紅景天、矮地茶和老鸛草等藥材的真?zhèn)螜z測[27-29]。隨著中藥材DNA條形碼鑒定系統(tǒng)的推廣應(yīng)用，DNA條形碼技術(shù)將滿足不同行業(yè)人員對(duì)中藥材快速、標(biāo)準(zhǔn)化真?zhèn)舞b定的需求，實(shí)現(xiàn)對(duì)市售藥材的快速、準(zhǔn)確鑒定，為保障市售藥材質(zhì)量和臨床用藥安全提供技術(shù)支持。致謝：感謝新疆維吾爾自治區(qū)中藥民族藥研究所賈曉光研究員和卿德剛研究員為本研究提供部分實(shí)驗(yàn)材料！

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Identification of Echinopsis Radix and Rhapontici Radix Using ITS2 Sequences

Chen Jiangping1, Hou Dianyun2, Yan Xuhua3, Hu Zhiqiang4, Wei Meng1, Hu Zhigang1,5, Wang Leyuan1
(1. College of Pharmacy, Hubei University of Chinese Medicine, Wuhan 430065, China; 2. College of Agricultural, Henan University of Science and Technology, Luoyang 471023, China; 3. Wuhan City Chinese Medicine Hospital, Wuhan 430010, China; 4. First Hospital of Wuhan, Wuhan 430022, China; 5. Institute of Chinese Materia Medica, China Academy of Chinese Medical Sciences, Beijing 100700, China)

This study aimed to identify Echinopsis Radix and Rhapontici Radix using ITS2 sequences, in order to provide a reliable method for clinical accurate medication by gene recognition. Fourteen samples of Echinops latifolius Tausch and E. grijisii Hance from the origin-species of multi origin traditional Chinese medicine Echinopsis Radix, and eight samples of Rhaponticum uniflorum (L.) DC from the origin-species of Rhapontici Radix, were collected. ITS2 sequences were acquired based on standard experiments, while DNA barcoding system for the materials was established through combining twenty sequences of relative adulterants from GenBank. Based on DNA barcoding system, we detected eleven samples of Echinopsis Radix and twenty samples of Rhapontici Radix from the market. As a result, the sequences of two origin-species of Echinopsis Radix shared the same dominant haplotype. The maximum intra-specific K2P genetic distance between Echinopsis Radix and Rhapontici Radix was less than the minimum inter-specific K2P genetic distance. The analysis of intra-specific and genetic divergence and NJ tree showed that Echinopsis Radix and Rhapontici Radix were separated from their adulterants obviously. Among eleven samples of Echinopsis Radix, ten of them were genuine while the remaining one was fake. However, among twenty samples of Rhapontici Radix, two were genuine and the remaining eighteen were fake. It was concluded that, in this study, the DNA barcoding technique for identification of Echinopsis Radix and Rhapontici Radix was successfully established on the basis of ITS2 sequences, which was a powerful tool in distinguishing Chinese medicines in the marketplaces.

Echinopsis Radix, Rhapontici Radix, ITS2 sequences, gene recognition, adulterants

10.11842/wst.2016.02.010

R282.5

A

（責(zé)任編輯：馬雅靜 張志華，責(zé)任譯審：朱黎婷 王 晶）

2015-11-29

修回日期：2015-12-07

＊ 科學(xué)技術(shù)部國家重大新藥創(chuàng)制科技專項(xiàng)子課題（2014ZX09304307001-021）：中藥新藥安全性檢測技術(shù)與標(biāo)準(zhǔn)研究-中藥原料藥混偽品分子基因鑒定技術(shù)與標(biāo)準(zhǔn)，負(fù)責(zé)人：胡志剛；湖北省科技支撐計(jì)劃（研發(fā)與示范類）（2015BCA275）：茯苓等8種湖北優(yōu)勢(shì)中藥材DNA條形碼分子鑒定體系構(gòu)建，負(fù)責(zé)人：胡志剛。

＊＊ 通訊作者：胡志剛，博士，副教授，主要研究方向：中藥資源與分子鑒定；汪樂原，教授，主要研究方向：中藥資源與品質(zhì)研究。