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    分子對接法虛擬篩選桂枝茯苓膠囊抗子宮肌瘤的潛在活性成分*

    2016-03-13 03:58:34范麒如王振中馬宏躍
    關(guān)鍵詞:茯苓桂枝靶點

    范麒如,王振中,馬宏躍,蕭 偉**

    (1. 江蘇康緣藥業(yè)股份有限公司 連云港 222001;2. 中藥制藥過程新技術(shù)國家重點實驗室連云港 222001;3. 中國藥科大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院 南京 210009;4. 南京中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院 南京 210046)

    分子對接法虛擬篩選桂枝茯苓膠囊抗子宮肌瘤的潛在活性成分*

    范麒如1,2,3,王振中1,2,馬宏躍4,蕭 偉1,2**

    (1. 江蘇康緣藥業(yè)股份有限公司 連云港 222001;2. 中藥制藥過程新技術(shù)國家重點實驗室連云港 222001;3. 中國藥科大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院 南京 210009;4. 南京中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院 南京 210046)

    目的:運用計算機虛擬對接技術(shù)篩選桂枝茯苓膠囊中抗子宮肌瘤的潛在活性成分。方法:選擇與子宮肌瘤發(fā)病機制高度相關(guān)的雌激素受體ER、CDK2、EGFR為靶點,采用軟件Molegro Virtual Docker,以選擇性抑制劑與靶點的共結(jié)晶復(fù)合物作為受體模板,建立靶點的活性位點,與桂枝茯苓膠囊中的35種已知主要成分進(jìn)行分子對接。結(jié)果:以選擇性抑制劑與靶點的MD Score的1/2為閾值,篩選得到13個化合物與靶點存在較強的相互作用。結(jié)論:桂枝茯苓膠囊多個成分能與ER、CDK2,EGFR成功對接,這可能是桂枝茯苓膠囊抗子宮肌瘤作用的活性成分。

    桂枝茯苓膠囊 子宮肌瘤 分子對接 虛擬篩選 ER CDK2 EGFR

    桂枝茯苓膠囊源于東漢張仲景《金匱要略》中桂枝茯苓丸,經(jīng)現(xiàn)代工藝提升改革而來,具有活血化瘀、消徵散結(jié)之功效。臨床上常用于原發(fā)性痛經(jīng)、卵巢囊腫、子宮肌瘤、慢性盆腔炎等婦科血瘀證的治療[1-4]。流行病學(xué)研究發(fā)現(xiàn),子宮肌瘤(Uterine Leiomyoma,UtLM)是女性生殖器中最常見的良性腫瘤,多發(fā)于30-50歲婦女,發(fā)病率為20%-30%,占女性生殖器良性腫瘤發(fā)病總量的52%[5]。子宮肌瘤的發(fā)病機制至今仍不明確?,F(xiàn)代醫(yī)學(xué)認(rèn)為,子宮肌瘤是激素依賴性腫瘤,與基因、細(xì)胞增殖與凋亡、細(xì)胞信號傳導(dǎo)途徑異常、雌激素及其受體、孕激素及其受體、催乳素、生長因子等因素有關(guān)[6]。關(guān)于桂枝茯苓膠囊治療子宮肌瘤的物質(zhì)基礎(chǔ)及作用機制未見報道。因此,本研究以子宮肌瘤發(fā)生高度相關(guān)的雌激素受體(Estrogen Receptor,ER)、細(xì)胞周期蛋白依賴激酶(Cyclin-Dependent Kinase 2,CDK2)、表皮生長因子受體(Epidermal Growth Factor Receptor,EGFR)為靶點,采用計算機 分子對接(Molecular Docking,DOCK)技術(shù),研究桂枝茯苓膠囊中已知的35種主要成分與靶點的對接信息,以期為闡明桂枝茯苓膠囊治療子宮肌瘤的物質(zhì)基礎(chǔ)及作用機制研究提供依據(jù)。

    1 方法

    1.1 受體的晶體結(jié)構(gòu)

    選擇雌激素受體(PDB code:3ERT)與抑制劑Tamoxifen復(fù)合物的晶體結(jié)構(gòu),CDK2(PDB code: 1CKP)與激酶抑制劑Purvalanol B復(fù)合物的晶體結(jié)構(gòu),EGFR(1XKK)與激酶抑制劑Lapatinib共結(jié)晶復(fù)合物[9]作為受體模板,作為計算機分子對接的受體模型,使用軟件MVD進(jìn)行對接研究[7-9]。

    1.2 配體構(gòu)建

    桂枝茯苓膠囊是由桂枝Ramulus Cinnamomi,茯苓Poria,桃仁Semen Persicae,丹皮Cortex Moutan,白芍Paeonia Radix 5味藥材提取精制而成。本研究選擇桂枝茯苓膠囊中35種主要可檢測成分作為研究對象,其中包括桂皮醇、桂皮醛、肉桂酸、芍藥苷、芍藥內(nèi)酯苷、苯甲酰芍藥苷、沒食子酰芍藥苷、羥基苯甲酰芍藥苷、羥基芍藥苷、丹皮酚、茯苓酸、苦杏仁苷、沒食子酸、山柰酚、山柰酚-3-O-葡糖糖苷、1,2,3,6-O-四沒食子酰葡萄糖、1,2,3,4,6-O-五沒食子酰葡萄糖、香豆素、7-羥基香豆素、原兒茶酸、槲皮素、丁香酸、兒茶素等,化合物的平面化學(xué)結(jié)構(gòu)采用ISIS-Draw軟件畫圖,并導(dǎo)出為mol格式;利用小分子化合物在線結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)換服務(wù),將其二維化學(xué)結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)換成三維立體結(jié)構(gòu)。采用Open Babel軟件** http://openbabel.sourceforge.net/** http://www.molegro.com/products.php對三維結(jié)構(gòu)進(jìn)行加氫、加電荷之后將pdb文件保存成mol2文件格式,用于分子對接研究。

    1.3 對接程序

    分別以3ERT晶體結(jié)構(gòu)中抑制劑Tamoxifen (OH-600),1CKP晶體結(jié)構(gòu)中選擇性抑制劑Purvalanol B(PVB-299),1XKK晶體結(jié)構(gòu)中選擇性抑制劑Lapatinib(FMM-91)為中心,選擇距離10?以內(nèi)的所有氨基酸基團組成受體活性篩選位點,采用標(biāo)準(zhǔn)Molegro Virtual Docker*** http://openbabel.sourceforge.net/** http://www.molegro.com/products.php對接程序進(jìn)行分子對接,基于對接的分子能量對各種結(jié)合模式進(jìn)行評分,以最低的對接能量確定分子的對接構(gòu)像。篩選之前,分別通過將配體OH-600、PVB-299、FMM-91抑制劑對接到相應(yīng)的靶蛋白活性位點,來確證MVD對接程序的有效性[10]。以選擇性抑制劑與靶點的MD Score的1/2為閾值,篩選有潛在活性的化合物。

    2 結(jié)果

    2.1 靶蛋白與抑制劑的分子對接結(jié)果

    3ERT、1CKP、1XKK與各對應(yīng)抑制劑對接的模擬構(gòu)象與真實X-晶形衍射的構(gòu)象進(jìn)行比對,兩種構(gòu)象間所有原子的均方根偏差(Root Mean Square Deviation,RMSD)小于1 ?,表明分子對接模擬成功,對接的能量值如表1 所示。

    表1 3ERT、1CKP、1XKK與各對應(yīng)抑制劑的分子對接參數(shù)

    2.2 桂枝茯苓膠囊化學(xué)成分與3ERT、1KCP、1XKK分子對接篩選結(jié)果

    將桂枝茯苓膠囊35個主要可測成分與3個靶點對接得分與相應(yīng)抑制劑得分進(jìn)行比較,得到13個命中化合物,其中7個化合物能結(jié)合于2個或3個靶點,6個化合物僅作用于1個靶點,命中化合物對接的能量如表2、表3、表4所示。

    3 討論

    分子對接法(Molecular Docking Method)是一種基于受體大分子三維結(jié)構(gòu)來尋找先導(dǎo)化合物的重要方法,是計算機輔助藥物分子設(shè)計中最為重要的方法之一。對接計算時,將配體分子放到受體活性位點,然后按照幾何互補、能量互補以及化學(xué)環(huán)境互補的原則來實時評價配體與受體相互作用,該方法已有成功用于中藥復(fù)方活性成分篩選和作用機制研究的報道[11-13]。

    大量實驗研究表明,子宮肌瘤為激素依賴性腫瘤,較正常子宮肌層相比,子宮肌瘤對雌激素具有高應(yīng)答性,肌瘤內(nèi)ERmRNA及其蛋白的表達(dá)高于周圍正常肌組織,局部形成的異常高的E2及ER 環(huán)境,可能是誘發(fā)子宮肌瘤的主要因素[14,15]。CDK2調(diào)節(jié)細(xì)胞周期S期染色體DNA的復(fù)制,當(dāng)長期不利因素刺激時(細(xì)胞周期的驅(qū)動力失控或者監(jiān)控檢查機制受損時)會異常表達(dá),進(jìn)而引起細(xì)胞周期紊亂導(dǎo)致細(xì)胞異常增殖形成腫瘤。有報道稱,CDK2在肝癌、胃癌、結(jié)腸癌、前列腺癌、乳腺癌、白血病等腫瘤中高度表達(dá),是基于細(xì)胞周期的小分子抗腫瘤

    藥物研究的重要靶點[16]。在肌瘤組織中,CDK2明顯高于正常子宮肌組織[17]。抑制CDK2是治療子宮肌瘤的一個有效途徑;EGFR是一種具有酪氨酸蛋白激酶活性的膜受體,與生長因子(Epidermal Growth Factor,EGF)構(gòu)成EGF/EGFR信號通路,該通路被激活后可以將細(xì)胞外的信號傳遞到細(xì)胞內(nèi)和細(xì)胞核,促進(jìn)細(xì)胞增殖,與多種腫瘤的產(chǎn)生機制有關(guān)[18-20]。有研究證明,在子宮肌瘤組織中EGFR表達(dá)顯著[21]。本文選擇上述3個靶點采用分子對接方法虛擬篩選桂枝茯苓膠囊中抗子宮肌瘤的潛在活性成分,結(jié)果顯示:膠囊中多種成分能與ER、CDK2、EFGR結(jié)合。其中兒茶素與ER結(jié)合見圖1,該結(jié)果與已有報道的兒茶素調(diào)節(jié)雌激素活性一致[22]。槲皮素與CDK2、EGFR結(jié)合見圖2,此結(jié)果與文獻(xiàn)報道活性一致[23,24]。

    表2 桂枝茯苓膠囊命中化合物與3ERT的分子對接參數(shù)

    表3 桂枝茯苓膠囊命中化合物與1KCP的分子對接參數(shù)

    表4 桂枝茯苓膠囊命中化合物與1XKK的分子對接參數(shù)

    小結(jié):本研究采用分子對接方法虛擬篩選桂枝茯苓膠囊中具有抗子宮肌瘤作用的潛在活性成分,在一定程度上揭示了桂枝茯苓膠囊抗子宮肌瘤的物質(zhì)基礎(chǔ)和作用機制,對驗證實驗研究具有啟示意義。

    圖1 兒茶素與ER結(jié)合圖

    圖2 槲皮素與CDK2、EGFR結(jié)合圖

    參考文獻(xiàn)

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    Virtual Screening of Potential Active Ingredients in Guizhi Fuling Capsule with Molecular Docking

    Fan Qiru1, 2, 3, Wang Zhenzhong1, 2, Ma Hongyue4, Xiao Wei1, 2
    (1. Jiangsu Kanion Pharmaceutical Co. Ltd., Lianyungang 222001, China; 2. State Key Laboratory of Pharmaceutical New-tech for Chinese Medicine, Lianyungang 222001, China; 3. Faculty of Life Science and Technology, China Pharmaceutical University, Nanjing 210009, China; 4. College of Pharmacy, Nanjing University of Chinese Medicine, Nanjing 210046, China)

    The study aimed to explore the potential anti-hysteromyoma active ingredients of Guizhi Fulingcapsule (GZFLC) through virtual screening with molecular docking. According to their crystal structures, ER (PDB: 3ERT) and its selective inhibitor CDK2 (PDB: 1CKP) and EGFR (PDB: 1XKK) were important targets which had close relationship with hysteromyoma. A molecular docking study was performed by Molegro Virtual Docker program to find out potential active ingredients for investigating anti-hysteromyoma effects of GZFLC. The results showed that thirteen compounds can bind to the targets. It was concluded that several potential active in gredients were docked with ER, CDK2 and EGFR successfully, which offered to be active ingredients that performed antihysteromyoma effects of GZFLC.

    Guizhi Fuling capsule, uterine leiomyoma, molecular docking, virtual screening, ER, CDK2, EGFR

    10.11842/wst.2016.02.027

    R283

    A

    (責(zé)任編輯:馬雅靜 張志華,責(zé)任譯審:朱黎婷 王 晶)

    2014-08-25

    修回日期:2014-12-19

    * 科學(xué)技術(shù)部國家重大新藥創(chuàng)制專項(2013ZX09402203):現(xiàn)代中藥創(chuàng)新集群與數(shù)字制藥技術(shù)平臺,負(fù)責(zé)人:王振中。

    ** 通訊作者:蕭偉,本刊編委,博士,研究員,主要研究方向:中藥新劑型的研究與開發(fā)。

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