皺蓋假芝化學(xué)成分分離及其結(jié)構(gòu)鑒定*

黃紀(jì)國(guó)，韓園園，謝意珍，潘鴻輝**

（1．廣東省微生物研究所省部共建華南應(yīng)用微生物國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東 廣州 510070；2．廣東粵微食用菌技術(shù)有限公司，廣東 廣州 510663）

〈生理生化〉

皺蓋假芝化學(xué)成分分離及其結(jié)構(gòu)鑒定*

黃紀(jì)國(guó)1，2，韓園園1，謝意珍1，2，潘鴻輝1，2**

（1．廣東省微生物研究所省部共建華南應(yīng)用微生物國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東 廣州 510070；2．廣東粵微食用菌技術(shù)有限公司，廣東 廣州 510663）

對(duì)皺蓋假芝（Amauroderma rude）子實(shí)體提取物的化學(xué)成分進(jìn)行分離及結(jié)構(gòu)鑒定。皺蓋假芝子實(shí)體經(jīng)干燥、粉碎，采用熱水浸提，依次采用氯仿、乙酸乙酯、正丁醇進(jìn)行萃取，最終得到氯仿萃取物、乙酸乙酯萃取物、正丁醇萃取物及水溶物；采用各種分離手段，從皺蓋假芝提取物中分離出6個(gè)化合物單體，并通過(guò)現(xiàn)代波譜分析方法及結(jié)合文獻(xiàn)，最終確定為尿苷、5’-甲氧基尿苷、星魚(yú)甾醇、腺苷、尿嘧啶、原兒茶酸，所有化合物均屬首次從皺蓋假芝中分離得到。

皺蓋假芝；化學(xué)成分；星魚(yú)甾醇；原兒茶酸

靈芝屬于擔(dān)子菌綱（Basidioycetes） 多孔菌科（Polyporaceae）靈芝亞科 （Ganodermatoideae）靈芝屬（Ganoderma）。因其具有滋補(bǔ)強(qiáng)壯，延年益壽等功效，受到廣泛關(guān)注[1]。目前，已從靈芝中分離得到150多種化合物，其中包括三萜類、多糖類、蛋白類、多肽類、核苷類、甾醇類、揮發(fā)油、生物堿、甘露醇、多種酶類、呋喃衍生物、脂肪酸和微量元素等。據(jù)報(bào)道，靈芝活性成分具有抗腫瘤、抗氧化、調(diào)節(jié)免疫、降血糖、降血脂、保肝護(hù)肝等功效，且?guī)缀鯚o(wú)毒副作用，受到醫(yī)藥界的廣泛重視[2-10]。而皺蓋假芝（Amauroderma rude） 屬于靈芝科（Ganodermataceae）假芝屬（Amauroderma），目前全球發(fā)現(xiàn)的大概30多種[11]，主要分布于熱帶及亞熱帶地區(qū)，我國(guó)華南及西南地區(qū)。因其子實(shí)體受外界損傷而流出紅色液體或者子實(shí)體器官變紅，故又名血芝[12]。通過(guò)查閱文獻(xiàn)發(fā)現(xiàn)，國(guó)內(nèi)外對(duì)于皺蓋假芝的研究主要是資源分布及液體發(fā)酵[12-14]，2013年本實(shí)驗(yàn)室曾經(jīng)對(duì)皺蓋假芝抗癌活性進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)其抗癌活性明顯高于其他食用菌[15]。為更加全面了解皺蓋假芝子實(shí)體的化學(xué)成分，本實(shí)驗(yàn)采用正相色譜、反相色譜分離方法，并結(jié)合波譜分析手段，對(duì)分離出的化學(xué)成分進(jìn)行結(jié)構(gòu)鑒定，最終確定6個(gè)化合物單體結(jié)構(gòu)，均屬首次從皺蓋假芝子實(shí)體中分離得到。

1 材料與方法

1.1 儀器與材料

X-4型顯微熔點(diǎn)儀，上海精密科學(xué)儀器有限公司；安捷倫1200高效液相色譜儀，美國(guó)安捷倫科技有限公司；島津LC-2OA色譜儀，日本島津科技有限公司；DRX-500M核磁共振儀，瑞士布魯克公司；BRUKER HCT電噴霧電離質(zhì)譜，美國(guó)布魯克道爾頓公司；RE-3000旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，上海亞榮生化儀器廠；BS210S BL610電子天平，德國(guó)賽多利斯公司；SK8200H超聲波清洗器，上海科導(dǎo)超聲儀器有限公司；DLSB-5/20型低溫冷卻液循環(huán)泵，鄭州長(zhǎng)城科工貿(mào)有限公司；SHB-S循環(huán)水式多用真空泵，鄭州長(zhǎng)城科工貿(mào)有限公司；高效硅膠薄層板、柱層析硅膠，青島海洋化工分廠；葡聚糖凝膠Sephadex LH-20，上海安瑪西亞生物技術(shù)有限公司；乙醇、甲醇、石油醚、正丁醇、乙酸乙酯、三氯甲烷均為分析純，廣州化學(xué)試劑二廠；氘代試劑，北京伊諾凱科技有限公司。

皺蓋假芝購(gòu)自安徽大別山種植戶，并經(jīng)廣東省微生物研究所食用菌研究發(fā)展中心鑒定。

1.2 分離流程

干燥的皺蓋假芝子實(shí)體（5 kg）經(jīng)粉碎，采用熱水浸提（液質(zhì)比1:25，提取溫度100℃，提取時(shí)間2×1 h），過(guò)濾，常溫真空濃縮，得到皺蓋假芝水提濃縮液（736 g）；對(duì)濃縮液進(jìn)一步采用氯仿、乙酸乙酯、正丁醇依次萃取，分別得到氯仿萃取物（135 g）、乙酸乙酯萃取物（155 g）、正丁醇萃取物（171 g）、水溶性提取物。對(duì)氯仿萃取物（135 g）進(jìn)行正相硅膠柱層析，采用氯仿和石油醚洗脫系統(tǒng)，進(jìn)行梯度洗脫（氯仿:石油醚為0:100至100:0），最終用甲醇沖柱，經(jīng)薄層色譜分析得到5個(gè)組分。其中，組分Fr 1-1中出現(xiàn)結(jié)晶析出，過(guò)濾、重結(jié)晶，得到化合物3（8 mg）。對(duì)正丁醇萃取物（171 g）進(jìn)行D101大孔樹(shù)脂進(jìn)行分離，采用水-乙醇進(jìn)行梯度洗脫（100:0至0:100），最終得到20個(gè)組分。其中Fr 3-1～Fr 3-3放入冰箱靜置24 h，大量白色沉淀析出。收集白色沉淀進(jìn)行葡聚糖凝膠柱層析，采用純水進(jìn)行洗脫，得到5個(gè)組分。對(duì)組分Fr 3-1-1進(jìn)行HPLC制備，得到化合物1（tR=2．349 min） （5 mg）；對(duì)組分Fr 3-1-2進(jìn)行HPLC制備，得到化合物2（tR=2．357 min）（6 mg） 和化合物6（tR=5．82 min）（8 mg）；對(duì)組分Fr 3-1-3進(jìn)行HPLC制備，得到化合物4（tR=4．99 min）（5．1 mg）；對(duì)組分Fr 3-1-4進(jìn)行HPLC制備，得到化合物5（tR=8．567 min）（6 mg）。其化合物結(jié)構(gòu)見(jiàn)圖1。

圖1 化合物1～6的結(jié)構(gòu)式Fig．1 Structure formula of compounds 1-6

2 結(jié)構(gòu)鑒定結(jié)果

化合物1：白色粉末。1H NMR (DMSO,500 MHz) δ：7．90 (1H,d,J=7．95 Hz,H-6)，5．79 (1H,d,J=5．35 Hz,H-1’)，5．66 (1H,d,J=7．95 Hz,H-5)，4．03 (1H,t,J=4．17 Hz)，3．97 (1H,s)，3．85 (1H,d,J=2．45 Hz)，3．59 (2H,m)；13C NMR (DMSO,125 MHz)δ：161．73 (C-4)，149．33 (C-2)，139．36 (C-6)，100．36 (C-5)，86．26 (C-1’)，83．41(C-4’)，72．11(C-3’)，68．44(C-2’)，59．39 (C-5’)。經(jīng)與參考文獻(xiàn)數(shù)據(jù)對(duì)比[16]，其與尿苷數(shù)據(jù)一致，最終確定其為尿苷。

化合物2：1H NMR (DMSO,500 MHz)δ：7．89 (1H,d,J=8．1 Hz,H-6)，5．77 (1H,d,J=5．4 Hz, H-1’)，5．64 (1H,d,J=8．1 Hz,H-5)，4．01 (1H,t, J=5．2 Hz)，3．95 (1H,t,J=5．2 Hz)，3．95 (1H,t,J =4．4 Hz)，3．83 (1H,q,J=3．3 Hz)，3．54 (2H,dq,J =3．05,4．0 Hz,H-5’)，3．38 (3H,s,C-5’-OCH3)；13C NMR (DMSO,125 MHz)δ：163．1(C-4)，150．7 (C-2)，140．7 (C-6)，101．7 (C-5)，87．6 (C-1’)，84.8 (C-4’)，73.5 (C-3’)，69.8 (C-2’)，63.0 (C-5’-OCH3)，60.8(C-5’)。通過(guò)與尿苷的波譜數(shù)據(jù)對(duì)比，結(jié)合HMBC和HSQC，最終確定化合物C-5’羥基被甲氧基取代，最終確定化合物為5’-甲氧基尿苷。

化合物3：白色針狀晶體，溶解于氯仿，熔點(diǎn)170℃～172℃；分子式C28H46O。1H NMR (CDCl3,500 MHz)δ：5.16～5.25 (3H,m)，3.58～3.66 (1H,m)，1.03 (3H,d,J=6.65 Hz)，0.94 (3H,d,J=6.8 Hz)，0.85 (6H,t,J=7.2 Hz)，0.82 (3H,s)，0.57 (3H, s)；13C NMR (CDCl3,125 MHz)δ：139.55 (C-8)，135.66 (C-22)，131.86 (C-23)，117.44 (C-7)，71.06 (C-3)，55.93 (C-17)，55.09 (C-14)，49.42 (C-9)，43.28 (C-13)，42.79 (C-24)，40.48 (C-20)，40.24 (C-5)，39.43 (C-12)，37.94 (C-4)，37.12 (C-1)，34.20 (C-10)，33.07 (C-25)，31.43 (C-6)，29.61 (C-2)，28.09 (C-16)，22.91 (C-15)，21.52 (C-11)，21.1 (C-21)，19.94 (C-27)，19.63 (C-26)，17.58 (C-28)，13.03 (C-19)，12.07 (C-18)。與參考文獻(xiàn)報(bào)道的Ergosta7，22-dien-3β-ol波譜數(shù)據(jù)一致[17]，最終確定化合物為星魚(yú)甾醇。

化合物4：白色無(wú)定形粉末。1H NMR(DMSO+ D2O,500 MHz)δ：6.06 (1H,d,J=1.95 Hz)，5.91 (1H,d,J=2.8 Hz)，3.74 (1H,d,J=6.3 Hz)，2.11 (1H,s)，1.98 (1H,d,J=2.2 Hz)，1.51～1.62 (2H, m)；13C NMR (DMSO+D2O,125 MHz)δ：156.95 (C-6)，153.95 (C-2)，149.88 (C-4)，142.09 (C-8)，120.41 (C-5)，89.73 (C-1’)，87.38 (C-4’)，75.12 (C-2’)，72.11 (C-3’)，63.02 (C-5’)。經(jīng)查閱文獻(xiàn)，其與報(bào)道的化合物腺苷化學(xué)位移一致[18]，最終確定化合物為腺苷。

化合物5：白色晶體，335.1℃～336℃。1H NMR (DMSO,500 MHz)δ：11.0 (1H,s)，10.8 (1H,s)為活潑氫；13C NMR (DMSO+D2O,125 MHz)δ：163.9 (C-4)，151.9 (C-2)，141.7 (C-6)，99.7 (C-5)，通過(guò)查閱文獻(xiàn)，其與報(bào)道的尿嘧啶數(shù)據(jù)一致[19]，最終確定其化合物為尿嘧啶。

化合物6：白色粉末。1H NMR (DMSO,500 MHz)δ：7.28 (1H,d,J=1.9 Hz,H-2)，7.20 (1H, dd,J=1.9 8.2 Hz,H-6)，6.73 (1H,d,J=8.2 Hz, H-5)；13C NMR (DMSO,125 MHz)δ：168.3 (C-7)，148.8 (C-4)，145.1 (C-3)，126.0 (C-6)，119.8 (C-1)，115.8 (C-2)，115.1 (C-5)。經(jīng)過(guò)查閱文獻(xiàn)，發(fā)現(xiàn)其與報(bào)道的原兒茶酸波譜數(shù)據(jù)一致[20]，最終確定化合物為原兒茶酸。

3 討論

皺蓋假芝為一種藥食兼用真菌。本實(shí)驗(yàn)從皺蓋假芝中分離出6個(gè)化合物單體，均為首次從皺蓋假芝中分離得到。其中化合物星魚(yú)甾醇具有提高免疫調(diào)節(jié)作用[21]，原兒茶酸具有治哮喘、抗菌、抗氧化、抗炎、抗高血糖以及神經(jīng)保護(hù)的等作用。魏苗苗等[22]發(fā)現(xiàn)原兒茶酸能顯著抑制MAPK（p38,ERK）以及NF-κB（IκB-α，NF-κB p65）通路的激活，能夠有效地改善致敏懸液（OVA）引起的小鼠過(guò)敏性哮喘。張秀麗等[23]通過(guò)對(duì)魚(yú)藤酮誘導(dǎo)的帕金森模型小鼠腦組織中相關(guān)抗氧化酶活性的觀察，發(fā)現(xiàn)原兒茶酸可提高帕金森模型小鼠中腦和紋狀體內(nèi)超氧化物歧化酶（SOD）、過(guò)氧化氫酶（CAT）、谷胱甘肽過(guò)氧化物酶（GSH-PX）活力，降低脂質(zhì)過(guò)氧化物丙二醛（MDA）含量，減輕魚(yú)藤酮誘導(dǎo)的腦組織損傷，減少體內(nèi)自由基的產(chǎn)生，從而達(dá)到神經(jīng)保護(hù)作用。據(jù)報(bào)道，不同濃度的原兒茶酸對(duì)HBV啟動(dòng)子（HBV-S1P、HBV-S2P、HBV-CP、HBV-XP、HBV-FP）均有不同程度的抑制作用。原兒茶酸體外抗HBV的相關(guān)分子作用機(jī)制，表現(xiàn)在對(duì)FP啟動(dòng)子的抑制作用呈現(xiàn)倒U型：當(dāng)濃度為1 μg·mL-1時(shí)，抑制作用最大；其次原兒茶酸對(duì)信號(hào)通路的啟動(dòng)子AP-1和NF-KB也有抑制作用且呈現(xiàn)劑量依賴關(guān)系，即當(dāng)濃度達(dá)到10 μg·mL-1時(shí)，抑制作用達(dá)到最大，其中AP-1的抑制率達(dá)到66.4%，NF-K B的抑制率達(dá)到31.2%。因此原兒茶酸對(duì)HBV啟動(dòng)子及信號(hào)通路的啟動(dòng)子的抑制，是抑制HBV復(fù)制的重要途徑之一[24]。通過(guò)對(duì)皺蓋假芝化學(xué)成分的分離及結(jié)構(gòu)鑒定，為全面了解和開(kāi)發(fā)皺蓋假芝提供科學(xué)依據(jù)。

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Constituents Extract from the Fruit Bodies of Amauroderma rude

HUANG Ji-guo1,2,HAN Yuan-yuan1,XIE Yi-zhen1,2,PAN Hong-hui1,2
(1．Guangdong Institute of Microbiology,State Key Laboratory of Applied Microbiology,South China (The Ministry Province Joint Development),Guangzhou 510070,China;2．Guangdong Yuewei Edible Fungi Technology Co．Ltd．,Guangzhou,Guangzhou 510663,China)

The chemical constituents extracts from Amauroderma rude and structure identification were studied．The chemical constituents of A.rude fruit bodies were studied．Six compounds were isolated by various chromatographic techniques from A. rude and their structures were elucidated on the basis of spectroscopic analysis,namely uridine,5’-methoxyuridine,stellasterol, adenosine,uracil,protocatechuic acid．All compounds were isolated from A.rude for the first time．

Amauroderma rude;chemical constituents;stellasterol;protocatechuic acid

S646.9

A

1003-8310（2016）01-0042-04

10．13629/j．cnki．53-1054．2016．01．012

廣東省產(chǎn)學(xué)研省部合作專項(xiàng)基金項(xiàng)目（2012B090600050）；廣東省工程技術(shù)研究開(kāi)發(fā)中心建設(shè)項(xiàng)目（2010B080100068）；廣東省自然科學(xué)基金項(xiàng)目（2015A030313711）。

黃紀(jì)國(guó)（1986-），男，碩士，助理研究員，從事食（藥）用真菌研究及開(kāi)發(fā)工作。E-mail:huangjiguo＠126．com

**通信作者：潘鴻輝（1979-），女，博士，副研究員，從事食（藥）用真菌研究及開(kāi)發(fā)工作。E-mail:phhcys＠yahoo．com

2015-11-02