電針對腦缺血大鼠海馬神經(jīng)元microRNA132和p250GAP蛋白表達(dá)的影響

鄭彩霞，黃曉琳，陸敏，張鳳霞，郭雅碧，韓肖華

血管性癡呆(vascular dementia, VaD)是指由缺血性卒中、出血性卒中和造成腦區(qū)低灌注的腦血管疾病所致的嚴(yán)重認(rèn)知功能障礙綜合征。在全世界范圍內(nèi)，VaD是僅次于阿爾茨海默氏病(Alzheimer's disease, AD)的第二大癡呆類型，約占癡呆總數(shù)的20%～30%[1]。近年來，越來越多的臨床研究及實(shí)驗(yàn)研究證實(shí)針灸對VaD引起的學(xué)習(xí)記憶功能下降具有明顯的保護(hù)和改善作用，但其具體作用機(jī)制尚不明確[2-3]。韓肖華等[4]發(fā)現(xiàn)電針(electroacupuncture, EA)刺激百會穴和大椎穴可以提高腦缺血大鼠Morris水迷宮成績，機(jī)制可能與EA刺激可能激活海馬區(qū)PKA/CREB信號通路，上調(diào)其下游的Bcl-2靶基因轉(zhuǎn)錄水平，使翻譯成的Bcl-2蛋白量增多，進(jìn)而發(fā)揮抗神經(jīng)元凋亡作用相關(guān)；Li等[5]在后來的研究中也表明EA可能是通過cAMP/PKA/CREB通路改善多發(fā)性腦梗塞大鼠的學(xué)習(xí)記憶功能。研究表明，miR-212/132可能受轉(zhuǎn)錄因子CREB(cAMP-response element binding)[6]和轉(zhuǎn)錄抑制因子REST/NRSF(Repressor Element 1 silencing transcription factor/neuron-restrictive silencer factor)調(diào)控[7]，其中CREB存在于神經(jīng)細(xì)胞中，而REST存在于小鼠胚胎成纖維細(xì)胞中。miR132和miR212串聯(lián)基因的正常表達(dá)是神經(jīng)元發(fā)育、成熟、發(fā)揮正常功能的必要條件，它們的異常表達(dá)會引起一些神經(jīng)系統(tǒng)疾病，如AD和tau疾病[8]。由于海馬區(qū)miR-212/132成熟產(chǎn)物主要是miR132，miR132被認(rèn)為在成年小鼠海馬區(qū)新生神經(jīng)元的突觸生長和分支中發(fā)揮重要作用[9]。miR132可能通過抑制GTP酶活化蛋白p250GAP而促進(jìn)樹突棘成熟，影響突觸形成[10]。本實(shí)驗(yàn)旨在初步探討EA是否通過激活PKA/CREB信號通路影響miR132及其下游p250GAP蛋白表達(dá)，為EA改善學(xué)習(xí)記憶障礙的內(nèi)在機(jī)制提出新的證據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料 ①實(shí)驗(yàn)動物：健康成年SPF(Specefic pathogen Free)級SD(Sprague-Dawley)雄性大鼠90只，體質(zhì)量250±20g，由湖南斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動物有限公司提供(許可證號：SCXK湘2011-0003)。②主要試劑：H89(Sigma-Aldrich, Shanghai, China)、山羊抗大鼠p250GAP多克隆抗體(1∶200, Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, USA)，小鼠抗大鼠β-tubulin單克隆抗體(1∶1000, Affinity Bioscience, USA)、辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記抗體(1∶5000; Proteintech Group Inc., Wuhan, China)、增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光系統(tǒng)(an enhanced chemiluminescence system, ECL, Millipore, Billerica, MA, US)、反轉(zhuǎn)錄試劑盒(TOYOBO First Strand cDNA Synthesis Kit，USA)、定量PCR試劑盒(TOYOBO THUNDERBIRD SYBR qPCR Mix，USA)。③主要材料與儀器：電針儀(G6805-II型，上海)、毫針(華佗牌，30號)、腦立體定位儀(深圳沃瑞德科技有限公司)、微量進(jìn)樣器、PVDF膜(Merck Millipore, Germany)、熒光定量PCR儀(StepOneTMReal-Time PCR System, Life Technologies, New York, USA)。

1.2 方法 ①動物分組及處理：90只動物隨機(jī)分為假手術(shù)組、模型組、EA組、EA+H89組和EA+NS組，每組18只，每組又分為7，14，21d 三個觀察時間點(diǎn)，即每個時間點(diǎn)6只SD大鼠。②側(cè)腦室注射：在制作2VO模型前1h，EA+H89組和EA+NS組的大鼠分別側(cè)腦室注射H89(2μg/μL)或NS 10μL。側(cè)腦室定位坐標(biāo)：前囟后0.8mm，前囟右側(cè)1.5mm，硬腦膜下約4.0mm。14、21d組的大鼠每間隔1周重復(fù)側(cè)腦室注射H89或NS一次。③模型制備：腹腔注射10%水合氯醛(3ml/kg)麻醉大鼠后，行頸部正中約2cm切口，并游離一小段頸總動脈，分別結(jié)扎其近端和遠(yuǎn)端并剪斷中部，以完全阻斷雙側(cè)頸總動脈血流；假手術(shù)組大鼠雙側(cè)頸總動脈只暴露，不接扎和剪斷?？p合切口，消毒皮膚，術(shù)后常規(guī)飼養(yǎng)。④EA參數(shù)：GV20位于頂骨正中，GV14位于背部正中第7頸椎與第1胸椎間。以30號1寸毫針斜刺入GV20 10mm，直刺入GV14 5mm。將針柄分別連接至電針儀上，GV20接負(fù)極，GV14接正極，選取連續(xù)波，頻率20Hz，電流強(qiáng)度以觀察到大鼠眼瞼輕微顫動為宜。每天1次，每次20min。

1.3 評定標(biāo)準(zhǔn) ①RT-PCR：直接斷頭法取出大腦后快速在冰上分離出雙側(cè)海馬組織。取100mg組織，加入1ml Trizol Reagent徹底勻漿，隨后加入氯仿和異丙醇，抽提總RNA。取10μl水溶RNA，依次加入特異性反轉(zhuǎn)錄引物U6-RT(10mM)，miR-132-5p-RT(10mM)各1μl，及4μl 5×buffer，2μl 10mM dNTPs，1μl RNA inhibitor和1μl 反轉(zhuǎn)錄酶，用槍抽吸混勻后于PCR儀上進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)。配制10μl反應(yīng)體系，每個反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物配制3管，進(jìn)行PCR擴(kuò)增。選用U6 RNA作為內(nèi)源參考基因。采用2-ΔΔCT法計算miR132表達(dá)的相對變化。引物由Invitrogen Biotechnology Co., LTD中國公司合成。miR132的引物：miR-132-5p-S：5′-ACCGTGGCTTTCGATTGTTAC-3′，通用下游：5′-TGGTGTCGTGGAGTCG-3′；U6的引物：R-U6-S：5′-CCTGCTTCGGCAGCACA-3′，R-U6-A：5′-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3′。②Western blot：取100mg組織，與裂解液混合并勻漿，提取總蛋白液。每孔總蛋白上樣量約60μg，行十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳(sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electropheresis, SDS-PAGE)，電泳完成后將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移至PVDF膜上。將PVDF膜用5%脫脂奶粉/TBS封閉液室溫振蕩封閉1h后，加入適當(dāng)稀釋的一抗4℃下過夜。滴加辣根過氧化物酶標(biāo)記二抗，在37℃下孵育1h，并采用ECL顯色系統(tǒng)顯色。采用Image-J軟件分析目標(biāo)蛋白及內(nèi)參蛋白的灰度值并計算比值。所有測定重復(fù)至少3次。

a代表假手術(shù)組；b代表模型組；c代表EA組；d代表EA+H89組；e代表EA+NS組

2 結(jié)果

2.1 大鼠海馬區(qū)miR132的表達(dá) 同時間點(diǎn)各組大鼠間的miR132表達(dá)量相比，7、14、21d時，模型組大鼠miR132的表達(dá)量較假手術(shù)組均顯著下降(P<0.05)；EA組較模型組miR132的表達(dá)量均顯著增多(P<0.05)；EA+H89組較EA+ NS組miR132的表達(dá)量均顯著下降(P<0.05)。同組別3個不同時間點(diǎn)之間miR132表達(dá)量相比，模型組、EA組隨著時間延長，miR132的表達(dá)量有逐漸下降的趨勢，但各時間點(diǎn)間差異無統(tǒng)計學(xué)意義；EA+NS組大鼠在14d時miR132的表達(dá)量較7d顯著增加，但21d時miR132的表達(dá)量較14d顯著減少(P<0.05)。見表1。

2.2 大鼠海馬區(qū)p250GAP蛋白的表達(dá) 同時間點(diǎn)各組大鼠間的p250GAP蛋白表達(dá)量相比，7、14、21d時，模型組與假手術(shù)組大鼠相比，海馬區(qū)p250GAP蛋白量均顯著增多(P<0.05)，EA組與模型組大鼠相比，海馬區(qū)p250GAP蛋白量均顯著減少(P<0.05)，且14d時，EA組與假手術(shù)組大鼠相比，海馬區(qū)p250GAP蛋白量亦顯著減少(P<0.05)；EA+H89組與EA+ NS組比較，海馬區(qū)p250GAP蛋白量均明顯增多(P<0.05)。見表1。同時間點(diǎn)各組大鼠間的p250GAP蛋白上樣順序及典型條帶見圖1。

組別時間miR132p250GAP蛋白假手術(shù)組7d1.00±0.010.16±0.0114d1.00±0.070.35±0.0221d1.00±0.030.18±0.02模型組7d0.67±0.04a0.31±0.04a14d0.61±0.03a0.56±0.04a21d0.59±0.06a0.32±0.04aEA組7d1.08±0.08b0.18±0.01b14d1.07±0.02b0.21±0.02ab21d0.90±0.07b0.19±0.01bEA+H89組7d0.77±0.04c0.39±0.04c14d0.84±0.03c0.50±0.01c21d0.66±0.04c0.35±0.07cEA+NS組7d1.05±0.070.22±0.0414d1.52±0.04d0.32±0.0421d0.91±0.02e0.20±0.01

與同時間點(diǎn)假手術(shù)組比較，aP<0.05；與同時間點(diǎn)模型組比較，bP<0.05；與同時間點(diǎn)電針+NS組比較，cP<0.05。與同組7d組比較，dP<0.05；與同組14d組比較，eP<0.05

3 討論

miRNA主要通過降解靶mRNA或抑制靶mRNA翻譯參與細(xì)胞轉(zhuǎn)錄后調(diào)節(jié)，在細(xì)胞增殖、分化、凋亡、代謝、胚胎發(fā)育等一系列生命過程中起重要作用[11]，同時參與許多疾病的病理過程。Dhar等[10]發(fā)現(xiàn)肥胖基因Leptin可以通過促進(jìn)海馬神經(jīng)元miR132表達(dá)抑制GTP酶活化蛋白p250GAP而促進(jìn)樹突棘成熟，影響突觸形成。另一項研究也表明，BDNF可能通過調(diào)控miR132及p250GAP蛋白的表達(dá)促進(jìn)視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞(retinal ganglion cells, RGC)的軸突分枝[12]。miR132的上調(diào)會特異性的定位于動態(tài)突觸，在長時程突觸激活和記憶過程中發(fā)揮重要作用[13]。本研究發(fā)現(xiàn)，在7、14、21d時，腦缺血會引起大鼠海馬組織miR132水平顯著下降，同時伴有p250GAP蛋白顯著增多；EA治療可以明顯促進(jìn)miR132上調(diào)， p250GAP蛋白下調(diào)，提示EA可能通過對miR132及p250GAP蛋白的調(diào)控影響突觸形成，這可能是電針改善腦缺血后學(xué)習(xí)記憶功能障礙的作用機(jī)制之一。模型組、EA組三個不同時間點(diǎn)相比時，隨著時間延長，miR132的表達(dá)量有逐漸下降的趨勢，提示隨著缺血缺氧時間延長，miR132的下降會進(jìn)行性加重，盡管EA組較同時間點(diǎn)模型組大鼠miR132的下降的嚴(yán)重程度已顯著緩解，但并不能完全逆轉(zhuǎn)或遏制miR132的下降水平。在western blot實(shí)驗(yàn)中，電泳條件及曝光時間對免疫沉淀復(fù)合物的相對光密度影響較大，此次實(shí)驗(yàn)并不能提供同組別不同時間點(diǎn)標(biāo)本的電泳圖，若直接使用同時間點(diǎn)不同組別樣品上樣后的實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行比較沒有實(shí)際意義，這也是下一步有待完善之處。

蛋白激酶A(protein kinase A，PKA)、Ca2+/鈣調(diào)蛋白激酶IV(Calcium/calmodulin-dependent protein kinase type IV, CaMK IV)等都能通過磷酸化CREB參與學(xué)習(xí)記憶形成機(jī)制[14]，其中，大量研究表明，PKA/CREB信號通路對學(xué)習(xí)記憶過程至關(guān)重要[15]。為了驗(yàn)證PKA/CREB信號通路激活是否可能涉入EA對miR132的調(diào)節(jié)作用，我們給予PKA特異性抑制劑-H89后觀察EA的上述作用是否會被抑制。結(jié)果表明，側(cè)腦室注射H89的大鼠，雖然按同樣方法在手術(shù)次日開始進(jìn)行EA治療，但在7、14、21d時， 相比側(cè)腦室注射NS的大鼠，EA對miR-132、p250GAP蛋白有利的調(diào)節(jié)作用均受到抑制，提示PKA/CREB信號通路可能是EA調(diào)控miR132表達(dá)及作用的內(nèi)在機(jī)制之一。

綜上所述，電針刺激百會穴和大椎穴7、14或21d時均可以調(diào)控miR-132及p250GAP蛋白的表達(dá)，其內(nèi)在機(jī)制可能與PKA/CREB信號通路激活相關(guān)。但EA能否因此調(diào)控海馬神經(jīng)元樹突生長和分枝，以及動態(tài)突觸形成等，進(jìn)而發(fā)揮改善突觸可塑性和學(xué)習(xí)記憶功能的作用還有待下一步深入研究。

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