新城疫滅活疫苗免疫的抗病毒機理

邢立曉　任慧英

摘 要： 新城疫是由新城疫病毒引起雞、火雞、鴿等禽類的一種急性、高度接觸性傳染病，是危害養(yǎng)雞業(yè)的三大傳染病之一，目前預(yù)防新城疫主要使用弱毒疫苗和滅活疫苗。本文主要從抗原提呈角度，分析新城疫滅活苗免疫后，雞體發(fā)生的免疫反應(yīng)及其機理，并分析該免疫反應(yīng)建立后雞體對抗該病毒再次感染的途徑。

關(guān)鍵詞： 新城疫病毒 滅活疫苗 抗原提呈 再次感染

一、新城疫病毒及新城疫

新城疫病毒（NDV）是一種具有囊膜的單股、負鏈RNA病毒，基因組長度約15kb，包含6個基因，分別編碼3-NP-P-M-F-HN-L-56種結(jié)構(gòu)蛋白，即NP核蛋白、P磷蛋白、M基質(zhì)蛋白、F融合蛋白、HN血凝素—神經(jīng)氨酸酶和L聚合酶。病毒表面蛋白結(jié)構(gòu)對病毒與細胞之間的吸附有決定作用，其中覆蓋于囊膜表面的F和HN是NDV的兩種重要的功能性蛋白，是決定NDV致病性的主要因素。新城疫病毒感染雞產(chǎn)生的病理癥狀主要集中在消化道、呼吸道和中樞神經(jīng)系統(tǒng)，發(fā)病率和死亡率可達90%以上，給養(yǎng)雞業(yè)造成極大損失，是世界動物衛(wèi)生組織規(guī)定的法定通報疫病。疫苗免疫是阻止新城疫廣泛流行的關(guān)鍵措施[1]。

二、雞新城疫滅活疫苗注射后，雞體內(nèi)發(fā)生的抗原提呈反應(yīng)

滅活疫苗由新城疫活病毒經(jīng)0.3%甲醛處理后仍保留免疫原性但不具有組織感染性的死病毒輔以佐劑制備而成，該過程中可能會導(dǎo)致某些主要蛋白抗原的變性，這就意味著部分抗原的構(gòu)象表位遭到破壞，會導(dǎo)致疫苗免疫保護力的降低。由于是滅活病毒，因此不存在病毒感染細胞進行增殖的過程[2]。

（一）雞體內(nèi)的抗原提呈細胞對抗原的加工

滅活病毒通過皮下或肌肉注射進入雞體，雞的皮膚中存在朗格漢斯細胞（即皮膚表皮內(nèi)的樹突狀細胞），此時的樹突狀細胞沒有接受抗原的刺激處于尚未成熟狀態(tài)，可以通過巨胞飲作用介導(dǎo)的內(nèi)吞作用攝取和加工滅活病毒抗原，由于其處理和呈遞抗原過程相分離的特性，僅受抗原刺激的樹突狀細胞不能提呈抗原以激活初始型T細胞，成熟的樹突狀細胞就不能再呈遞其他抗原。受到抗原刺激后，樹突狀細胞會從皮膚向淋巴組織的T細胞富集區(qū)遷移，同時發(fā)育為成熟樹突狀細胞，細胞表面高度存在MHC-Ⅱ類分子，將所吞噬的滅活病毒抗原展示于細胞表面，并表達協(xié)同刺激分子與黏附分子（LFA-3，ICAM-1，ICAM-3等），以激活CD4 + T細胞。

當(dāng)然，在雞的皮下或肌肉中存在巨噬細胞，它們也是抗原提呈的重要力量。當(dāng)滅活病毒注射到雞的皮下或肌肉時，可能會有血管內(nèi)的白細胞發(fā)生附壁、粘著、游出、趨化等一系列過程，因而可能導(dǎo)致局部炎癥的發(fā)生及一些白介素等細胞因子的釋放，從而使組織中的巨噬細胞由靜息轉(zhuǎn)為活化狀態(tài)，細胞增大，細胞的變形運動及吞噬能力均增強，產(chǎn)生了一系列適應(yīng)吞噬、處理抗原的變化。有了上述變化，巨噬細胞能夠更好地捕獲、加工抗原，并通過MHC-Ⅱ類分子展示于細胞表面，同時分泌IL-1，以激活免疫細胞并促進其增殖與分化及調(diào)節(jié)免疫應(yīng)答。

注射進入皮下或肌肉內(nèi)的滅活病毒，可能會因局部組織內(nèi)血管的破裂進入血液或其中某些小分子抗原通過毛細血管內(nèi)皮細胞間隙進入血液，血液則是B細胞發(fā)揮特異性抗原提呈作用的場所。進入血液的滅活病毒，隨著血液的運行到達脾臟，并隨著中央動脈入脾，由于其末端分支與脾索和血竇相連，滅活病毒亦隨血液進入血竇。血竇周圍白髓中的脾小結(jié)是B細胞的集結(jié)區(qū)，在脾小結(jié)的邊緣區(qū)B細胞與滅活病毒接觸。B細胞表面抗原受體（BCR）與滅活病毒抗原表位結(jié)合后，會引起B(yǎng)細胞骨架結(jié)構(gòu)的改變，從而會使滅活病毒被吞入細胞內(nèi)，將NDV的抗原表位處理后，放在MHC-Ⅱ類分子抗原肽結(jié)合槽內(nèi)，使抗原表位和MHC-Ⅱ類復(fù)合物被展示在細胞膜上。B細胞以此方式向CD4 + T細胞提呈抗原，使其進入克隆增殖狀態(tài)。有時，B細胞提呈抗原的方式與上述有所不同。因為B細胞活化CD4 + T細胞的能力不如樹突狀細胞強，所以由已攝取加工抗原并成熟的樹突狀細胞先活化CD4 + T細胞，隨后B細胞再提呈抗原給已活化的CD4 + T細胞，使其快速增殖、分化。

如果將三種專職抗原提呈細胞加以比較，不難發(fā)現(xiàn)，巨噬細胞和樹突狀細胞基本都是以吞噬等方式捕獲滅活病毒，對抗原的識別是非特異性的，而B細胞是以B細胞抗原受體的方式識別抗原，是具有特異性的[3]。因此在抗原濃度低的情況下，B細胞能夠有效地攝取足夠多的抗原來啟動免疫應(yīng)答。但是，B細胞主要識別由蛋白質(zhì)三級結(jié)構(gòu)組成的構(gòu)象抗原表位，在將NDV滅活的過程中，許多蛋白抗原的空間結(jié)構(gòu)遭到破壞，因此，滅活疫苗活化B細胞參與免疫應(yīng)答的強度會受影響。

（二）雞體抗原提呈細胞對抗原的呈遞

將新城疫油佐劑滅活苗注射到雞的皮下或肌肉一段時間后，液態(tài)的滅活病毒抗原會被皮膚中的朗格漢斯細胞以巨吞飲作用吞入胞內(nèi)，并被其質(zhì)膜包裹形成內(nèi)吞小體，或是被分布在肌肉中的巨噬細胞捕獲吞入胞內(nèi)。此時，存在于外周組織中的樹突狀細胞由于未與抗原接觸處于尚未成熟狀態(tài)，還不能呈遞抗原激活T細胞。但它受抗原刺激后，會向淋巴組織的T細胞富集區(qū)遷移，同時發(fā)育為成熟的樹突狀細胞。

在樹突狀細胞成熟的過程中，其細胞內(nèi)部發(fā)生一系列的變化。首先是在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)內(nèi)進行MHC-Ⅱ類分子的組裝及釋放。組成MHC-Ⅱ類分子的α肽鏈和β肽鏈在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)內(nèi)同步合成，并組裝成為二聚體，即完整的MHC-Ⅱ類分子。因為新合成的MHC-Ⅱ類分子結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定，容易與細胞內(nèi)部的游離蛋白質(zhì)結(jié)合，所以需要一種穩(wěn)定分子的存在。恒定鏈（跨膜伴侶分子）便在MHC-Ⅱ分子組裝后及時地插入到剛形成的抗原肽結(jié)合槽中穩(wěn)定結(jié)構(gòu)。并且在恒定鏈的指導(dǎo)下，MHC-Ⅱ類分子逐漸向高爾基復(fù)合體遷移。其次是在溶酶體內(nèi)，MHC-Ⅱ類分子加載抗原表位后被展示于細胞膜表面，MHC-Ⅱ類分子及恒定鏈復(fù)合物被轉(zhuǎn)運到高爾基復(fù)合體內(nèi)，并復(fù)合體表面的膜包裹后釋放進入胞質(zhì)中。胞質(zhì)中的H + 不斷被泵入內(nèi)吞小體，使其的pH不斷下降，形成一個強酸性的微環(huán)境；同時，不斷有來自高爾基復(fù)合體的含蛋白酶小泡與內(nèi)吞小體融合，內(nèi)吞的滅活病毒逐漸被降解為小分子的抗原肽片段。之后，膜包小體在某種信號的牽引下，找到吞有抗原的內(nèi)吞小體，并與內(nèi)吞小體表面的質(zhì)膜相互融合。由于結(jié)合在MHC-Ⅱ類分子抗原肽結(jié)合槽內(nèi)的恒定鏈干擾抗原肽與結(jié)合槽的結(jié)合，因此，內(nèi)吞小體內(nèi)的酸性蛋白酶會將恒定鏈的游離端和膜結(jié)合片段相機水解，最終隨著pH的下降，恒定鏈中部的恒定鏈多肽亦從抗原肽結(jié)合槽內(nèi)解離下來，內(nèi)吞小體內(nèi)已降解好的抗原肽進入槽內(nèi)，形成抗原肽-MHC-Ⅱ類分子復(fù)合物，最終復(fù)合物被轉(zhuǎn)運到細胞膜表面供CD4 + T細胞識別。CD4 + T在細胞因子和共刺激分子的作用下分化為效應(yīng)T細胞。

有時也可能會發(fā)生抗原的交叉提呈，即含有滅活病毒的內(nèi)吞小體進入胞質(zhì)，并被泛素化，最后，經(jīng)過蛋白酶體的降解成MHC-I類分子的抗原肽并進一步展示于細胞表面，供CD8 + T識別，CD8 + T在細胞因子和共刺激分子的作用下分化為CTL細胞。

三、再次感染新城疫病毒時，雞體對抗該病毒感染的途徑

在油乳劑滅活苗注射到雞皮下或肌肉一段時間后，抗原提呈細胞將滅活病毒捕獲并加工之后會向CD4 + T細胞提呈抗原。當(dāng)雞體再次發(fā)生NDV感染時，之前產(chǎn)生的記憶T細胞受到與滅活病毒中相似或相同的蛋白質(zhì)抗原刺激，迅速活化為輔助T細胞，并分泌細胞因子激活抗原提呈細胞，活化的抗原提呈細胞分泌IL-12和IL-18，二者共同作用于初始CD8 + T細胞使之活化，并增殖、分化為細胞毒性T細胞，即通過CD4 + T細胞幫助下的旁路活化途徑活化CD8 + T細胞，實現(xiàn)CD8 + T細胞的快速活化及CTL快速有效地殺死被NDV感染的靶細胞，從而對抗病毒感染。

將油佐劑滅活苗注射進入雞體并激活CD4+T細胞后，B細胞受到Th細胞及雙信號的刺激后，增殖并分化為漿細胞，產(chǎn)生抗體。抗體通過中和病毒的感染作用、補體參與的溶囊膜作用、吞噬細胞的調(diào)理作用、NK細胞的ADCC作用等，消滅感染的NDV。在經(jīng)抗原選擇的B細胞中，有一部分停止向漿細胞分化而轉(zhuǎn)變?yōu)橛洃汢細胞。當(dāng)雞體再次發(fā)生NDV感染時，記憶B細胞可迅速活化，產(chǎn)生大量抗原特異免疫球蛋白（如抗血凝素的IgG等），并快速表達MHC-I類、MHC-Ⅱ類分子及共刺激分子，使B細胞向T細胞提呈抗原的能力增強，從而使雞體對抗NDV感染能力增強。

四、結(jié)語

雖然在實際生產(chǎn)中，使用雞新城疫滅活苗免疫能夠在雞體內(nèi)建立如上所述的免疫反應(yīng)，但有時單用滅活疫苗往往引起免疫失敗。一是因為油佐劑滅活苗免疫產(chǎn)生免疫應(yīng)答潛伏期長，增加了野毒感染機會[4]；二是滅活苗制作中會使一些NDV的抗原構(gòu)象表位喪失，導(dǎo)致疫苗保護力下降；三是滅活病毒無法在體內(nèi)增殖，從而影響內(nèi)源性抗原的產(chǎn)生并進一步影響CTL細胞的活化；另外，家禽上呼吸道、肺的局部免疫當(dāng)直接與抗原接觸時，才能引起免疫應(yīng)答。因為存在與血清循環(huán)中的相應(yīng)抗體不能轉(zhuǎn)運到肺部，所以初次免疫使用Lasota等弱毒疫苗進行點眼滴鼻免疫、加強免疫時要使用滅活苗或弱毒疫苗，以全面預(yù)防雞群新城疫的感染。

參考文獻：

[1]武發(fā)菊，劉學(xué)榮，尚勇良等.新城疫疫苗的研究進展[J].中國畜牧獸醫(yī)，2011，38（10）：145-148.

[2]李一經(jīng).獸醫(yī)微生物學(xué).北京：高等教育出版社，2011.

[3]王家鑫.免疫學(xué).北京：中國農(nóng)業(yè)出版社，2009

[4]趙全興，楊慧玲，劉方娜等.新城疫滅活疫苗免疫間隔期探討[J].中國畜牧獸醫(yī)，2011，38（10）：238-241.

基金項目：青島農(nóng)業(yè)大學(xué)教改項目（基于雙語網(wǎng)絡(luò)教學(xué)平臺的獸醫(yī)微生物學(xué)課程教學(xué)改革）建設(shè)項目

通訊作者：任慧英