C型產(chǎn)氣莢膜梭菌致病機(jī)理研究進(jìn)展

李凡飛,張 云,李 強(qiáng),趙澤慧,何小麗,許立華*

(1.寧夏大學(xué)農(nóng)學(xué)院， 寧夏銀川 750021;2.寧夏大學(xué)后勤集團(tuán)醫(yī)保中心，寧夏銀川 750001)

文獻(xiàn)綜述

C型產(chǎn)氣莢膜梭菌致病機(jī)理研究進(jìn)展

李凡飛1,張 云2,李 強(qiáng)1,趙澤慧1,何小麗1,許立華1*

(1.寧夏大學(xué)農(nóng)學(xué)院， 寧夏銀川 750021;2.寧夏大學(xué)后勤集團(tuán)醫(yī)保中心，寧夏銀川 750001)

C型產(chǎn)氣莢膜梭菌能夠引起人類和一些動(dòng)物的壞死性腸炎。該菌能產(chǎn)生α外毒素和β外毒素，大部分該菌菌株也能分泌出產(chǎn)氣梭菌細(xì)胞溶素O(PFO)和TpeL。試驗(yàn)證明β外毒素是C型產(chǎn)氣莢膜梭菌的主要致病毒素。在兔子腸襻和小鼠模型試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，通過細(xì)胞中同源基因C型產(chǎn)氣莢膜梭菌β毒素敲除基因突變株而導(dǎo)致該菌株失去毒力。當(dāng)野生型β毒素基因補(bǔ)充這些突變體時(shí)毒素的活力將會(huì)復(fù)活。大多數(shù)C型產(chǎn)氣莢膜梭菌產(chǎn)生的所有毒素(除TpeL外)都易與腸癌(Caco-2)細(xì)胞緊密結(jié)合并發(fā)生反應(yīng)，比它在體外生長更加迅速。VirS/virR雙組分調(diào)節(jié)系統(tǒng)(TCRS)被證明是在Coca-2細(xì)胞中導(dǎo)致β毒素和PFO產(chǎn)生快速上調(diào)。當(dāng)virR基因被抑制時(shí)，pfoA和β毒素基因的表達(dá)也會(huì)受阻，這種系統(tǒng)是可逆的，virR表達(dá)時(shí)會(huì)恢復(fù)。通過β毒素作用于動(dòng)物模型的試驗(yàn)研究，來尋找有效的預(yù)防措施。

C型產(chǎn)氣莢膜梭菌；β毒素；致病機(jī)制；壞死性腸炎

產(chǎn)氣莢膜梭菌(Clostridiumperfringens)是一種革蘭陽性厭氧桿菌，根據(jù)它產(chǎn)生的4種主要毒素(α、β、ε、ι)的不同而分為A、B、C、D、E共5種血清型[1]。產(chǎn)氣莢膜梭菌部分菌株也能產(chǎn)生其他毒素(腸毒素、β2毒素和產(chǎn)氣梭菌細(xì)胞溶素O)，但這些毒素并沒有用于這個(gè)微生物的分類。該菌能引起大多數(shù)哺乳類動(dòng)物的胃腸道感染，由于腸內(nèi)不僅能產(chǎn)生毒素而且能吸收毒素進(jìn)入機(jī)體循環(huán)，因此這種傳染病通常被稱為腸毒血癥。但是，產(chǎn)氣莢膜梭菌產(chǎn)生的一些毒素是在腸內(nèi)產(chǎn)生且作用于腸內(nèi)細(xì)胞，然而也有一些毒素在腸內(nèi)和機(jī)體都能產(chǎn)生致病作用[2]。

C型產(chǎn)氣莢膜梭菌能引起一些家畜和人類的腸毒血癥。人自然感染C型產(chǎn)氣莢膜梭菌的臨床癥狀、組織病變方面與大數(shù)動(dòng)物相同。該病根據(jù)病程分為最急性、急性和慢性3種。最急性和急性的特征是腹部疼痛、精神抑郁和腹瀉帶血；慢性疾病發(fā)生在一些成年動(dòng)物(羊和馬等)，臨床癥狀為頑固性腹瀉、糞便不帶血和脫水。尸體剖檢時(shí)，主要在病體的小腸上發(fā)生病變，但盲腸和結(jié)腸也會(huì)出現(xiàn)；其他組織與腸的各段具有相似的病變。最急性癥狀中肉眼可見的病變包括彌漫性、階段性、廣泛壞死性和出血性腸炎并伴隨水腫。在急性和亞急性病例中通常能觀察到偽膜性結(jié)腸炎。在組織結(jié)構(gòu)上，C型產(chǎn)氣莢膜梭菌病的腸壁上會(huì)出現(xiàn)出血性壞死，先是感染黏膜層然后會(huì)侵襲腸壁的所有層膜。纖維蛋白血栓能堵塞表面動(dòng)脈和固有層靜脈并且黏膜下層有條件性特征[3]。C型產(chǎn)氣莢膜病能引起人類的壞死性腸炎，該病在東南亞地區(qū)零星性發(fā)生，在新幾內(nèi)亞通常呈地方流行性[4-5]。該病在糖尿病患者多的地區(qū)較容易流行。人患有壞死性腸炎時(shí)，往往會(huì)在臨床癥狀開始出現(xiàn)的48 h內(nèi)死亡[6]。迄今為止，C型產(chǎn)氣莢膜梭菌的致病機(jī)制也是研究甚少。

1 β毒素

C型產(chǎn)氣莢膜梭菌各種毒素的主要特征：α毒素的分子質(zhì)量為42.528 ku，對(duì)鼠的半數(shù)致死量(LD50)為3 μg/kg，能引起致死性、壞死性和溶血性的癥狀，耐熱但對(duì)胰島素比較敏感；β毒素的分子質(zhì)量為35 ku，對(duì)鼠的半數(shù)致死量為1.8 μg/kg，能引起水腫癥狀，60℃下失活、在-80℃下能保存2個(gè)月左右，并且在胰島素作用下易失活；CPE分子質(zhì)量為35 ku，對(duì)鼠半數(shù)致死量為50 μg/kg，易導(dǎo)致水腫和致死性腸炎，在60℃1周內(nèi)失活、-20℃保存1月左右，胰島素能激活CPE的活性；β2毒素的分子質(zhì)量為28 ku，對(duì)鼠的半數(shù)致死量為0.3 μg/kg，也可為引起水腫癥狀但它的耐熱性還未知，對(duì)胰島素敏感。該菌至少會(huì)產(chǎn)生α毒素和β毒素，其他毒株也會(huì)產(chǎn)生腸毒素(CPE)、β2毒素、PFO、TpeL等毒素。但是，當(dāng)前的研究證明β毒素是C型產(chǎn)氣莢膜梭菌病的主要致病因子，β毒素是一個(gè)35 ku蛋白質(zhì)并在敏感細(xì)胞膜上形成孔道，這樣會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞水腫和溶解。

β毒素對(duì)小鼠的半數(shù)致死量(LD50)是1.87 μg/kg，毒素是在小鼠的腹腔進(jìn)行注射。β毒素基因編碼了一條336個(gè)氨基酸的強(qiáng)親和力毒素，在分泌期間有一段27個(gè)氨基酸的信號(hào)序列被拆掉，結(jié)果產(chǎn)生一個(gè)約為25 ku的突變毒素。純化的β毒素是不耐熱的，在50℃條件生長1 h將失去該毒素90%的致病毒性。β毒素對(duì)胰蛋白酶和胃蛋白酶也會(huì)有較高敏感性，但在低pH下似乎并不影響該毒素的活性。

通過對(duì)C型產(chǎn)氣莢膜梭菌病的調(diào)查，發(fā)現(xiàn)β毒素是該病誘發(fā)的基礎(chǔ)分子，先前的試驗(yàn)敘述β毒素能在衍生白色細(xì)胞HL-60和人白血病細(xì)胞的細(xì)胞膜上成孔形[3]。重組毒素研究也證明β毒素在磷脂雙分子膜上有形成孔道的能力，孔徑為12?。這些通道可以選擇性的使一些離子通過，如引起K+外流和Ca2+、Na+、Cl-涌入，這可以導(dǎo)致細(xì)胞腫脹和溶解[7]。如果將212位的精氨酸殘基用天冬氨基酸替代，其毒性會(huì)下降，對(duì)小鼠的半數(shù)致死的劑量將會(huì)增長13倍，也極度減弱了β毒素形成孔道的能力。在豚鼠的皮膚上注射小劑量的β毒素將產(chǎn)生皮膚壞死，也可以引起水腫和漿液性滲出。這種毒素也引起TNF-α和IL-1β的釋放和速激肽NK1受體的激活，目前其誘導(dǎo)機(jī)制還有待進(jìn)一步研究[8]。

Schafer K W等[9]發(fā)現(xiàn)β毒素在引起的人和仔豬的急性病例中，毒素與腸黏膜的血管內(nèi)皮細(xì)胞特異性結(jié)合。因此，β毒素與內(nèi)皮細(xì)胞的結(jié)合引起了上皮細(xì)胞壞死是產(chǎn)氣莢膜梭菌β毒素引起的腸炎的初期癥狀。在疾病的后期階段，當(dāng)發(fā)展為大面積的腸道黏膜壞死時(shí)，小腸微血管內(nèi)血栓的形成可以作為病變的特征。

2 β毒素的基因遺傳和其生產(chǎn)調(diào)控

β毒素基因編碼β毒素是在具有毒力的大質(zhì)粒上，該質(zhì)粒的大小是65 kb～110 kb。該基因也編碼出TpeL，是一種梭菌性細(xì)胞毒素，在β質(zhì)粒上也能編碼出CPE[2，4]。B型和C型產(chǎn)氣莢膜梭菌中關(guān)于β毒素的復(fù)制和測(cè)序，與1 000 bp的ORP非常相似[10]。盡管已經(jīng)知道β毒素在C型產(chǎn)氣莢膜梭菌病的重要性，卻對(duì)β毒素基因的調(diào)控作用相對(duì)了解較少。研究表明，無論是在厭氧還是需氧的條件下，β毒素在人結(jié)腸腺癌細(xì)胞Caco-2細(xì)胞中的產(chǎn)生都迅速上調(diào)。VirS/VirR雙組分調(diào)節(jié)系統(tǒng)(TCRS )被證明是在Caco-2細(xì)胞中生產(chǎn)過程中控制早期β毒素基因轉(zhuǎn)錄的上調(diào)[2]。上述研究報(bào)道了Caco-2細(xì)胞導(dǎo)致毒素的快速分泌的，標(biāo)志著Caco-2細(xì)胞對(duì)宿主梭菌的優(yōu)先識(shí)別會(huì)影響經(jīng)典外毒素的生產(chǎn)，這是梭菌傳染病的特點(diǎn)。這種現(xiàn)象在C型產(chǎn)氣莢膜梭菌中廣泛存在，從病人和一些不同種類動(dòng)物中分離出來產(chǎn)氣莢膜梭菌的其他菌株，它們的毒素也在人結(jié)腸腺癌細(xì)胞Caco-2細(xì)胞中的產(chǎn)生迅速上調(diào)[11]。

3 C型產(chǎn)氣莢膜梭菌的致病機(jī)制

C型產(chǎn)氣莢膜梭菌病是由于該菌先在腸道內(nèi)繁殖并產(chǎn)生毒素引起的，其中β毒素就是最重要的致病毒素。C型產(chǎn)氣莢膜梭菌在一些動(dòng)物的腸內(nèi)是一個(gè)共生體，它真正進(jìn)行傳染不是其中一種菌作用而是至少幾種菌共同作用。但是，有關(guān)正常動(dòng)物體內(nèi)C型產(chǎn)氣莢膜梭菌帶菌率的信息比較缺乏。C型產(chǎn)氣莢膜病中β毒素的第一靶點(diǎn)在宿主腸道上，這里的毒素具有較高的活性。對(duì)腸上皮細(xì)胞的破壞，可以通過β毒素的直接作用也可以間接作用，通過血栓形成和腸道缺血引起的腸內(nèi)皮細(xì)胞的破壞[12]，允許β毒素和其他毒素能傳入體內(nèi)循環(huán)系統(tǒng)而引發(fā)致死作用。一些動(dòng)物模型通常被用來研究C型產(chǎn)氣莢膜梭菌傳染病，其中包括小豬、豚鼠、兔、小鼠、綿羊和山羊。試驗(yàn)性仔豬和豚鼠最初被廣泛用于研究C型產(chǎn)氣莢膜梭菌病的致病機(jī)理[13]。

試驗(yàn)證明β毒素是由C型產(chǎn)氣莢膜梭菌提供的最重要毒力因子，也證明了用β類毒素疫苗進(jìn)行免疫，能夠確保人和動(dòng)物不被C型產(chǎn)氣莢膜梭菌感染[1，14]。也有試驗(yàn)證明純化的β毒素對(duì)小鼠有較高的致病力。Fisher等通過鼠靜脈注射法統(tǒng)計(jì)致死率的試驗(yàn)，證明了β毒素是重要的致病因子并在對(duì)數(shù)生長后期的培養(yǎng)上清液中存在。這個(gè)試驗(yàn)說明了C型產(chǎn)氣莢膜梭菌的培養(yǎng)上清液和純化的β毒素能引起試驗(yàn)鼠死亡，對(duì)含有β毒素單克隆抗體而不含α毒素抗體的液體進(jìn)行預(yù)培養(yǎng)能降低致死率[7，15]。通過這些試驗(yàn)可以確認(rèn)β毒素的毒力在誘導(dǎo)性致死方面存在特異性。

最新的一些報(bào)道以兔腸襻為模型，進(jìn)行一系列C型產(chǎn)氣莢膜梭菌毒素敲除突變體的檢測(cè)試驗(yàn)。在這些試驗(yàn)中，C型產(chǎn)氣莢膜梭菌野生型CN3685片段在對(duì)數(shù)生長后期營養(yǎng)繁殖的培養(yǎng)物能引起兔腸襻出血壞死性腸炎[16]。同基因毒素敲除突變體是準(zhǔn)備使用TargeTron技術(shù)把該毒素接種于兔腸襻，即使一個(gè)雙基因cpa/pfoA敲除CN3685的突變體但還會(huì)具有致病力[17]。但是，敲除兩個(gè)獨(dú)立的β毒素基因突變體，該毒素將會(huì)對(duì)動(dòng)物模型完全失去毒力。如果β毒素突變基因逆轉(zhuǎn)將恢復(fù)β毒素產(chǎn)生和對(duì)腸道的致病力，證明了科赫的分子學(xué)假設(shè)。這些結(jié)果證明了CN3685基因能誘發(fā)腸炎，該毒素在C型產(chǎn)氣莢膜梭菌致病性上發(fā)揮重要的作用[13]。

純化的β毒素在胃腸道的不同部位所產(chǎn)生的毒素效應(yīng)也有所不同，在十二指腸、空腸、回腸能夠觀察到出血和組織損傷。但是，十二指腸對(duì)β毒素的敏感性比空腸和回腸低，并且結(jié)腸是不受影響的[18]。這些部位對(duì)β毒素存在敏感性差異能為闡述C型產(chǎn)氣莢膜梭菌對(duì)胃腸道的影響提供重要依據(jù)，即該菌主要侵襲人和動(dòng)物的空腸和回腸。胰腺分泌的大量胰蛋白酶主要存在于十二指腸內(nèi)，β毒素對(duì)胰蛋白酶較為敏感，從而減弱了β毒素的活性，因此降低了C型產(chǎn)氣莢膜梭菌自然感然病例的發(fā)生。盡管有些研究報(bào)道顯示，在C型產(chǎn)氣莢膜梭菌自然感染和試驗(yàn)性感染中，β毒素的致病作用在結(jié)腸不受影響，但也有關(guān)于人C型產(chǎn)氣莢膜梭菌病中結(jié)腸損傷的一些報(bào)告。除β毒素外，其他的一些該菌毒素在結(jié)腸內(nèi)也存在活性或者物種的差異，導(dǎo)致β毒素在結(jié)腸內(nèi)的敏感性的不同，這些可能性還需要持續(xù)的試驗(yàn)加以驗(yàn)證。但是C型產(chǎn)氣莢膜梭菌分泌的其他毒素(如CPE與β毒素相似)對(duì)兔結(jié)腸襻沒有損傷[19]。在動(dòng)物體外和體內(nèi)的試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)結(jié)腸內(nèi)有限制該毒素活性的物質(zhì)[20]。

對(duì)C型產(chǎn)氣莢膜梭菌自然感染病例的研究表明，β毒素的致病性不僅是引起腸道病變，而且腸道還能吸收該毒素并能進(jìn)入體內(nèi)循環(huán)系統(tǒng)從而侵襲遠(yuǎn)端的器官(大腦)[14]。利用兩個(gè)小鼠模型(胃型和十二指腸型)，分別用野生型菌株CN3685接種，以研究C型產(chǎn)氣莢膜梭菌的致病性及小鼠體內(nèi)各系統(tǒng)的變化。結(jié)果顯示，在C型產(chǎn)氣莢膜梭菌自然感染小鼠的模型中，臨床癥狀表現(xiàn)為抑郁、腹部腫脹、呼吸困難和神經(jīng)癥狀，最終引起死亡。但是，在任何一個(gè)小鼠模型中并沒有觀察到腹瀉和腸道異常。試驗(yàn)小鼠缺乏明顯癥狀和小腸病理組織學(xué)變化，可以反映出小鼠腸道上皮細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞上缺少β毒素受體[21]。盡管之前關(guān)于β毒素的神經(jīng)系統(tǒng)效應(yīng)僅是猜測(cè)，F(xiàn)isher 等人研究發(fā)現(xiàn)通過對(duì)小鼠靜脈接種β毒素后可觀察到神經(jīng)系統(tǒng)的改變。而且，當(dāng)接毒之前β毒素和抗β毒素mATB混合培養(yǎng)一段時(shí)間，這些臨床癥狀將會(huì)消失。當(dāng)小鼠的胃和十二指腸內(nèi)受到C型產(chǎn)氣莢膜梭菌菌株和純化β毒素的侵襲時(shí)，可觀察到神經(jīng)病變癥狀，但在小鼠的腸道內(nèi)沒有觀察到組織病變，除了壞死性腸炎產(chǎn)生的其他毒素被吸收而引起的非特異性效應(yīng)。這些研究結(jié)果確認(rèn)β毒素能引起神經(jīng)系統(tǒng)病變，但β毒素產(chǎn)生神經(jīng)性癥狀及病理變化的致病機(jī)制仍需進(jìn)一步研究。

當(dāng)同基因CN3685毒素敲除突變體被接種于鼠的胃或十二指腸模型時(shí)，由于β毒素編碼基因的失活，使呈高致病性C型菌株CN3685對(duì)鼠胃模型沒有毒性而且對(duì)鼠腸模型幾乎沒有致病性。相反，編碼α毒素或PFO基因的失活僅僅略有降低CN3685的致病力[19]。對(duì)提前經(jīng)靜脈注射含有β毒素抗體的小鼠進(jìn)行野生型菌株CN3685的接種[22]，能抵抗細(xì)菌對(duì)胃的致病力。這些結(jié)果證明了C型產(chǎn)氣莢膜梭菌β毒素在該菌致病性上起著重要的作用。

4 討論

C型和B型產(chǎn)氣莢膜梭菌主要產(chǎn)生β毒素，該毒素是引起人和動(dòng)物患?jí)乃佬阅c炎和腸毒血癥的主要毒力因子。另外，研究β毒素作用的動(dòng)物試驗(yàn)?zāi)Ｐ停矠樵摬√峁┝诵碌念A(yù)防方針和治療方法。但是β毒素的作用機(jī)制還需進(jìn)一步在分子水平和細(xì)胞水平來闡述β毒素的反應(yīng)機(jī)理和影響β毒素毒力的主要因素。在C型產(chǎn)氣莢膜梭菌感染過程中，β毒素通過與特異性受體精準(zhǔn)結(jié)合后方可發(fā)揮其致病性，這就啟發(fā)我們可以設(shè)計(jì)特殊的毒素抑制劑或者制造經(jīng)過修飾的特異性毒素分子，其中包括C型產(chǎn)氣莢膜梭菌產(chǎn)生的一個(gè)或多個(gè)強(qiáng)力的毒素。產(chǎn)氣莢膜梭菌純毒素作用和研究方法的最新進(jìn)展之一，是提供失活的毒素基因作為非常有用的方法去研究產(chǎn)氣莢膜梭菌的幾種毒素在動(dòng)物和人梭菌病中發(fā)揮的作用[23]。這些方法使我們認(rèn)識(shí)梭菌毒素如何介導(dǎo)細(xì)胞且產(chǎn)生損傷的。這些有價(jià)值的研究方法在該領(lǐng)域變得非常重要并且能繼續(xù)幫助研究者：①確認(rèn)β毒素在引發(fā)動(dòng)物疾病中的作用；②調(diào)查動(dòng)物體內(nèi)毒素的作用機(jī)制；③開發(fā)更有效的疫苗,預(yù)防產(chǎn)氣莢膜梭菌所引發(fā)的致命疾??；④研究Virs/VirR雙組分調(diào)節(jié)系統(tǒng)的作用以及機(jī)體感應(yīng)機(jī)制。

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Progress on Pathogenesis Mechanism ofClostridiumperfringensType C

LI Fan-fei1, ZHANG Yun2, LI Qiang1, ZHAO Ze-hua1, HE Xiao-li1， XU Li-hua1

(1.SchoolofAgricultureNingxiaUniversity,Yinchuan,Ningxia, 750021,China；2.HealthCareCenterofNingxiaUniversityLogisticsGroup,Yinchuan,Ningxia,750001,China)

Clostridiumperfringenstype C causes necrotizing enteritis in humans and some animal species. Type C isolates produce beta toxin (CPB) and alpha toxin (CPA) and most strains produce several other toxins including perfringolysin O (PFO) and TpeL. However, current evidence indicates that CPB is the main virulence factor for type C infections. The rabbit intestinal loop and mouse model experiments showed thatC.perfringenstype C toxin β gene knockout mutant strain caused the loss of virulence, and the virulence was regained when these mutants were complemented with the wild-type cpb gene. Many type C isolates respond to contact with enterocyte-like Caco-2 cells by producing all toxins, except TpeL, VirS/VirR two-component regulation system (TCRS) proved rapid Caco-2 cell-induced upregulation of CPB and PFO production. The upregulatedinvivotranscription of the pfoA and cpb genes was blocked by inactivating the VirR gene,and was reversible by restoring VirR expression. The animal mode experimental research of beta toxin may find effective precautionary measures.

Clostridiumperfringenstype C; beta toxin; pathogenesis; necrotizing enteritis

2016-06-08

寧夏“優(yōu)質(zhì)高產(chǎn)奶牛遺傳改良與選育”專項(xiàng)(2013NYYZ0501)

李凡飛(1991-),男,河南商丘人,碩士，主要從事預(yù)防獸醫(yī)學(xué)研究。 *通訊作者

S852.615

A

1007-5038(2016)12-0082-04