牛支原體膜蛋白研究進(jìn)展

李　強(qiáng)，趙澤慧，牛耀祖，許立華

(寧夏大學(xué)農(nóng)學(xué)院，寧夏銀川 750001)

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文獻(xiàn)綜述

牛支原體膜蛋白研究進(jìn)展

李強(qiáng)，趙澤慧，牛耀祖，許立華*

(寧夏大學(xué)農(nóng)學(xué)院，寧夏銀川 750001)

摘要：膜蛋白是牛支原體的重要結(jié)構(gòu)，在牛支原體與宿主間的互作中具有重要作用。近年來(lái)，據(jù)報(bào)道牛支原體可變表面脂蛋白在病原黏附力及致病性中具有重要作用。論文主要綜述了牛支原體膜蛋白和可變表面脂蛋白的研究進(jìn)展，并介紹了牛支原體的黏附力以及其膜蛋白在牛支原體檢測(cè)上的應(yīng)用，以期為今后牛支原體膜蛋白的研究、疫苗和檢測(cè)試劑盒的研發(fā)提供參考。

關(guān)鍵詞：牛支原體；膜蛋白；黏附力

1961年，由Hale等在美國(guó)一例患嚴(yán)重乳房炎的奶牛中首次分離到牛支原體(Mycoplasmabovis)。在柔膜體綱下的不同分類學(xué)中，目前已認(rèn)定超過(guò)100種支原體，至少20種能感染牛。其中，牛支原體是最重要的一種。在全球范圍，牛支原體是造成肉牛、奶牛、犢牛一系列病癥的重要病原體。牛支原體感染可引起肺炎、關(guān)節(jié)炎、乳房炎、角膜結(jié)膜炎、中耳炎和生殖障礙等相關(guān)疾病，引起不可估量的經(jīng)濟(jì)損失[1]。

在我國(guó)，由辛九慶等人從犢牛肺臟中首次分離得到牛支原體，隨后在國(guó)內(nèi)多個(gè)省市均發(fā)現(xiàn)牛支原體感染病例[2]。隨著該病的流行，牛支原體越來(lái)越受到重視，與之相關(guān)的研究日益增多。本文主要對(duì)牛支原體膜蛋白及其可變表面脂蛋白的研究進(jìn)展進(jìn)行綜述，以期為今后牛支原體膜蛋白的研究提供參考。

1牛支原體膜蛋白

牛支原體結(jié)構(gòu)相對(duì)簡(jiǎn)單，沒有細(xì)胞壁，其表面聚集著大量脂蛋白，因此膜蛋白在牛支原體功能中有著重要作用，同時(shí)也是利用其作為研究膜結(jié)構(gòu)和功能模型的主要原因。然而牛支原體膜蛋白與宿主之間有著復(fù)雜的相互作用關(guān)系。其細(xì)胞膜上含有的主要抗原物質(zhì)是膜蛋白和糖脂，能夠刺激宿主產(chǎn)生相應(yīng)的體液免疫和細(xì)胞免疫應(yīng)答[3]。目前除可變表面膜蛋白，僅有很少的牛支原體膜蛋白被鑒定。研究結(jié)果顯示，一種48 ku的牛支原體膜脂蛋白p48，與發(fā)酵支原體的巨噬細(xì)胞極化脂蛋白(macrophage activating lipoprotein, MALP)具有同源性。由于牛支原體的結(jié)構(gòu)和抗原的保守性，可作為感染的血清學(xué)標(biāo)記。另一種68 ku的旁系同源編碼的假定蛋白p68，已在牛支原體PG45克隆變異體6中被認(rèn)定。p68蛋白的基因只在某些牛支原體中檢測(cè)到，而這些牛支原體同時(shí)包含p48基因。因此，在所有支原體中，僅有牛支原體含有MALP的多種同系物。由于牛支原體與無(wú)乳支原體等具有較高的同源性，急需特異性蛋白用于區(qū)分和檢測(cè)。目前，通過(guò)對(duì)部分牛支原體基因組測(cè)序，多數(shù)膜蛋白是由基因組序列假定預(yù)測(cè)的。因此，還有許多牛支原體膜蛋白和假定蛋白需要研究和鑒定。

2牛支原體可變表面脂蛋白

牛支原體細(xì)胞質(zhì)膜含有獨(dú)特的膽固醇，總蛋白含量高達(dá)50%以上。這些膜和膜相關(guān)蛋白十分重要，通常含有細(xì)胞黏附素。同細(xì)胞質(zhì)膜相關(guān)的其他蛋白大多為脂蛋白，通常暴露在外環(huán)境中，通過(guò)酰基附著于細(xì)胞質(zhì)膜上[4]。

牛支原體基因組的靈活性，使其具有高度可變的表面抗原，這是造成慢性感染的重要因素。PG45型菌株由13個(gè)不同的單拷貝可變表面脂蛋白(variable surface protein, Vsp)基因組成的染色體群，即Vsp基因座。該基因座大約23 kb，包含2個(gè)閱讀框(open reading frame, ORF)，有較高的同源性。Vsp基因座具有雙親特性，含有脂肪酸和半胱氨酸殘基[5]。Vsp基因包含保守的5′端非編碼序列，分為兩個(gè)基因盒，基因盒Ⅰ與全Vsp基因有99%的同源性，具有編碼指定的核糖體結(jié)合位點(diǎn)[6]?；蚝孝蛱幱诨蚝孝竦纳嫌危哂懈叩目勺冃?。該序列跟隨在一個(gè)開放閱讀框之后，N末端區(qū)域與98%～99%的菌株具有一致性，包裹著載脂蛋白信號(hào)肽。而Vsp的C末端結(jié)構(gòu)域，表面暴露[7]。由于Vsp基因具有高度的變異性，導(dǎo)致牛支原體在面對(duì)來(lái)自宿主的不同選擇壓力時(shí)，不斷增強(qiáng)變異性，提高生存能力。

Sachse K等[8]已發(fā)現(xiàn)牛支原體可變表面脂蛋白能自發(fā)進(jìn)行高頻相位變化。On與Off之間表達(dá)狀態(tài)的轉(zhuǎn)換，是由于牛支原體染色體上DNA特殊位點(diǎn)的重排，根據(jù)高度同源性相位變化的機(jī)制還發(fā)現(xiàn)，與無(wú)乳支原體具有密切相關(guān)性。Vsp在牛支原體感染機(jī)制中有著重要作用，其變異表達(dá)和復(fù)雜結(jié)構(gòu)共同決定了它的功能，可做為感染的血清學(xué)標(biāo)記。同時(shí)Vsp的變異性又導(dǎo)致了宿主的特異性和牛支原體的慢性疾病。但是，目前的困難在于明確其復(fù)雜的結(jié)構(gòu)和高度的可變性。

3牛支原體的黏附力

黏附是牛支原體侵染的第一步，因此黏附素的表達(dá)十分關(guān)鍵。由于基因組很小和缺少必要的生物合成途徑，牛支原體先黏附宿主細(xì)胞，進(jìn)行細(xì)胞膜的融合，然后相互交換細(xì)胞膜和細(xì)胞內(nèi)成分。然而，在牛支原體中并未發(fā)現(xiàn)能夠積累大量黏附素的極性結(jié)構(gòu)。通常認(rèn)為牛支原體黏附素幾乎覆蓋整個(gè)膜蛋白的表面[9]。此外，在細(xì)胞黏附實(shí)驗(yàn)中，添加純化的Vsp可減少牛支原體的細(xì)胞黏附因子，并且Vsp將留存于宿主的細(xì)胞層中。Vsp通過(guò)重復(fù)域中的寡肽抑制牛支原體局部的細(xì)胞黏附因子[10]。表面抗原的變異，通過(guò)刪除或嵌入Vsp的重復(fù)單元，去除或產(chǎn)生一些額外的抗原表位，導(dǎo)致細(xì)胞黏附因子的增減以及更寬或更窄范圍的配體結(jié)合[11]。目前，通過(guò)研究已知牛支原體的黏附力與膜蛋白和可變脂蛋白有著密切聯(lián)系，但是對(duì)于黏附素的分泌和牛支原體與宿主細(xì)胞黏附作用的機(jī)制還需進(jìn)一步研究。

4牛支原體膜蛋白在檢測(cè)上的應(yīng)用

近年來(lái)，國(guó)內(nèi)外牛支原體病的檢測(cè)方法主要集中在病原體的分離鑒定、血清學(xué)檢測(cè)、基因診斷三個(gè)方面[12]。傳統(tǒng)的檢測(cè)方法主要通過(guò)病原的分離鑒定判斷牛支原體感染，但由于在臨床實(shí)踐中，牛支原體的分離經(jīng)常受到其他病原菌或者抗菌藥物的影響，分離較為困難并且對(duì)培養(yǎng)基的營(yíng)養(yǎng)要求高，培養(yǎng)周期長(zhǎng)，無(wú)法對(duì)牛支原體感染進(jìn)行快速檢測(cè)。PCR技術(shù)可廣泛的應(yīng)用于檢測(cè)，但是需要對(duì)樣品進(jìn)行較為復(fù)雜的處理，對(duì)實(shí)驗(yàn)室的條件和儀器設(shè)備有一定的要求，同時(shí)需要一定的專業(yè)人員進(jìn)行操作，不適用于基層和臨床工作的廣泛應(yīng)用[13]。與這些檢測(cè)方法相比，血清學(xué)檢測(cè)具有方便、快捷、敏感性強(qiáng)等特點(diǎn)。其中ELISA方法、間接血凝試驗(yàn)(IHA)等廣泛應(yīng)用于實(shí)踐當(dāng)中，并且適用于大量樣本的檢測(cè)。1981年一種全菌蛋白的間接ELISA方法用于檢測(cè)牛支原體抗體[14]，當(dāng)然特定的目標(biāo)蛋白比全菌蛋白具有更高的特異性。目前，一些牛支原體膜蛋白和脂蛋白已發(fā)展應(yīng)用于牛支原體的檢測(cè)和分析。

4.1牛支原體p48蛋白

該蛋白是一種48 ku的牛支原體膜脂蛋白。簡(jiǎn)瑩娜等[15]優(yōu)化并合成了牛支原體的p48基因，將其克隆到pET-32a表達(dá)載體上，16℃低溫誘導(dǎo)表達(dá)，獲得可溶性重組p48蛋白。將純化后的重組p48蛋白與靴酸處理過(guò)的綿羊紅細(xì)胞，建立了檢測(cè)牛支原體抗體的間接血凝試驗(yàn)，牛支原體超免血清抗體效價(jià)達(dá)1∶2 048～1∶4 096。該方法同多種其他病原菌的陽(yáng)性血清檢測(cè)結(jié)果均為陰性。與國(guó)外商品化的牛支原體ELISA試劑盒相比，平均符合率為96.15%。該方法敏感性高、特異性強(qiáng)、重復(fù)性好，可用于牛支原體抗體水平檢測(cè)及流行病學(xué)的調(diào)查[16]。

4.2牛支原體pMB67蛋白

Behrens等于PG45中鑒定了一種新膜蛋白——pMB67，是牛支原體感染的主要抗原。該蛋白是一種在Vsp上具有重要功能的可變抗原成分，但是與Vsp沒有抗原性和結(jié)構(gòu)上的相似性，不是Vsp家族成員[17]。pMB67位于菌體表面，是特異性單克隆抗體的特定抗原表位，與Vsp相比不包含多個(gè)重復(fù)亞單位，但與Vsp結(jié)合后能獨(dú)立表達(dá)，提高了合成能力，并能保持原有的結(jié)構(gòu)性、抗原性和表面功能[18]。同時(shí)重組Vsp也表現(xiàn)出較高的免疫活性。現(xiàn)已證明Vsp和pMB67能表現(xiàn)出多樣化的表達(dá)模式，并且感染牛支原體時(shí)具有高度可變性[19]。因此，可以以混合重組型抗原為基礎(chǔ)，建立一套靈敏的免疫分析系統(tǒng)，用于牛支原體感染的特異性快速檢測(cè)，具有較好的發(fā)展前景。

4.3牛支原體p26蛋白

p26抗原開發(fā)的一種單克隆抗體已建立一種抗原捕獲ELISA方法，能檢測(cè)出牛乳樣中的支原體。雖然p26單克隆抗體與無(wú)乳支原體有交叉反應(yīng)，但只要無(wú)乳支原體不出現(xiàn)在牛奶中，并不影響牛支原體乳房炎的檢測(cè)。在胚胎牛肺細(xì)胞(embryonic lung cells, EBL)中，p26蛋白對(duì)牛支原體的黏附力起重要作用[20]，p26基因的表達(dá)水平與不同菌株黏附力的相對(duì)水平相關(guān)，而單克隆抗體p26對(duì)黏附素有抑制作用。通過(guò)單克隆抗體的制備，能夠有效、迅速、準(zhǔn)確的抑制黏附作用，從而阻斷牛支原體對(duì)宿主細(xì)胞的侵染。

4.4牛支原體的α化酶

牛支原體的α化酶已被證明是一種表面暴露蛋白，能通過(guò)結(jié)合纖維蛋白溶酶原黏附EBL細(xì)胞。它能作為一種纖維蛋白溶酶原的受體，有助于牛支原體在宿主體內(nèi)的侵染和擴(kuò)散。在對(duì)抗重組牛支原體α化酶時(shí)，抗體可在可溶性細(xì)胞質(zhì)部分、細(xì)胞膜部分以及整個(gè)細(xì)胞蛋白中檢測(cè)到[21]。由此可見，α化酶是一種牛支原體膜相關(guān)蛋白，在侵染宿主組織中具有重要作用。該酶分布廣泛，是用于牛支原體檢測(cè)的理想蛋白，但目前在蛋白酶方面的研究較少，缺乏相應(yīng)的檢測(cè)方法，可作為今后研發(fā)的重要方向。

5展望

牛支原體嚴(yán)重影響了我國(guó)乃至全球養(yǎng)牛業(yè)的發(fā)展，雖然距離發(fā)現(xiàn)至今已有半個(gè)世紀(jì)之久，但國(guó)內(nèi)外對(duì)于牛支原體的研究仍沒有突破性的進(jìn)展。由于牛支原體沒有細(xì)胞壁，其致病性高度依賴細(xì)胞質(zhì)膜及其可變表面膜蛋白，它們有利于其形態(tài)性、運(yùn)動(dòng)性以及對(duì)宿主細(xì)胞的黏附性。然而，目前對(duì)牛支原體研究仍然有限，張利等[22]通過(guò)牛支原體的體外MIC藥敏試驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)抗生素類藥物幾乎沒有作用，而市場(chǎng)基本沒有商品化疫苗，所以疫苗成為今后研發(fā)的重中之重。同時(shí)對(duì)牛支原體基因組的測(cè)序和ORF的分類仍然是一項(xiàng)艱巨的任務(wù)，目前還沒有相匹配的數(shù)據(jù)庫(kù)明確ORF的功能，只能通過(guò)預(yù)測(cè)。王艷杰等[23]對(duì)牛支原體分離株全基因組進(jìn)行了序列測(cè)定及初步分析，對(duì)研究其潛在的致病機(jī)制及其調(diào)控機(jī)制提供了依據(jù)。因此，要不斷完善牛支原體PG45型、HB0801型和Hubei-1型菌株基因組序列的分析和鑒定。新發(fā)現(xiàn)的免疫原性蛋白越來(lái)越多，雖然許多預(yù)測(cè)膜蛋白還未被認(rèn)定，其大部分功能也未被證明。但該舉措對(duì)增進(jìn)遺傳特性和發(fā)病機(jī)制的理解，開發(fā)行之有效的疫苗，建立靈敏度高、特異性強(qiáng)、快捷方便的檢測(cè)技術(shù)具有重要意義。

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Progress on Membrane Proteins ofMycoplasmabovis

LI Qiang, ZHAO Ze-hui, NIU Yao-zu ,XU Li-hua

(1.CollegeofAgriculture,NingxiaUniversity,Yinchuan,Ningxia,750001,China)

Abstract:Membrane proteins are significant structures ofMycoplasmabovis, which play an important role in the interactions with host. In recent years,many reports proved that variable surface lipoproteins may be importantly contributing in the adhesion and pathogenesis ofMycoplasmabovis. In this article, we described some research progress on membrane proteins and variable surface lipoproteins ofMycoplasmabovis. Moreover we gave a further description about diagnostic application of adhesion and membrane proteins. This article will provide a frame of help for membrane proteins research, vaccine and diagnostic kits in the future.

Key words:Mycoplasmabovis; membrane proteins adhesion

收稿日期：2015-12-02

基金項(xiàng)目：國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(31560687)；寧夏奶牛育種專項(xiàng)(2013NYYZ0501)

作者簡(jiǎn)介：李強(qiáng)(1991-)，男，河南鄭州人，碩士研究生，主要從事預(yù)防獸醫(yī)微生物研究。 *通訊作者

中圖分類號(hào):S852.62

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼:A

文章編號(hào):1007-5038(2016)06-0084-04