共表達豬流行性腹瀉病毒S1與GM-CSF蛋白重組腺病毒的構建

趙攀登，董建國，鄧同煒，陳　益，徐耀輝，蔣增海，盧建洲，王曉曄，王　巖*

(1.河南牧業(yè)經濟學院 動物醫(yī)學院，河南鄭州 450046；2.信陽農林學院 牧醫(yī)工程學院，河南信陽 464000；3.廣西大學 動物科學技術學院，廣西南寧 530004)

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共表達豬流行性腹瀉病毒S1與GM-CSF蛋白重組腺病毒的構建

趙攀登1，董建國2，鄧同煒1，陳益1，徐耀輝1，蔣增海1，盧建洲1，王曉曄3*，王巖1*

(1.河南牧業(yè)經濟學院 動物醫(yī)學院，河南鄭州 450046；2.信陽農林學院 牧醫(yī)工程學院，河南信陽 464000；3.廣西大學 動物科學技術學院，廣西南寧 530004)

摘要：為構建表達豬流行性腹瀉病毒(PEDV)S1與GM-CSF融合基因的重組腺病毒，通過FMDV的2A基因序列做為Linker將密碼子優(yōu)化的S1基因和粒細胞巨噬細胞集落刺激因子(GM-CSF)基因連接。構建重組穿梭質粒pShuttle-GM-CSF 2A-S1(m)，并將其電轉化至含有腺病毒骨架載體pAdEasy-1的大腸埃希菌BJ5183感受態(tài)細胞中，通過同源重組制備重組腺病毒質粒pAd-GMCSF2A-S1(m)。重組腺病毒質粒經PacI線性化后轉染HEK-293A細胞，獲得重組腺病毒rAd- GMCSF2A-S1。間接免疫熒光和Western blot結果顯示，S1和GMCSF蛋白在重組腺病毒感染的HEK-293A細胞中獲得表達。該重組腺病毒的制備為PEDV重組活載體疫苗的研究奠定了基礎。

關鍵詞：豬流行性腹瀉病毒；S1基因；粒細胞巨噬細胞集落刺激因子；重組腺病毒

豬流行性腹瀉(Porcine epidemic diarrhea,PED)是由豬流行性腹瀉病毒(Porcine epidemic diarrhea virus,PEDV)引起的以腹瀉、嘔吐、脫水為特征的一種腸道急性傳染病[1]。自2010年冬天開始，PED在中國大范圍流行，此次暴發(fā)具有感染性強、流行性廣、致死率高、不易防控等特點，給我國的養(yǎng)豬業(yè)帶來了巨大的經濟損失[2]。

PEDV屬于冠狀病毒，是有囊膜的單股正鏈RNA病毒[3]。PEDV編碼4個結構蛋白，即S蛋白(spike protein)、E蛋白(small member protein)、M蛋白(member protein)和N蛋白(nucleoprotein)。S蛋白是Ⅰ型膜蛋白，在病毒結合細胞、誘導產生中和抗體、促進病毒和細胞融合、促進病毒從細胞表面釋放等方面發(fā)揮著重要的作用，是新型疫苗研究的候選蛋白[4]。

粒細胞巨噬細胞集落刺激因子(granulocyte-macrophage colony-stimulating factor,GM-CSF)屬于造血生長因子，在機體免疫調節(jié)中起著重要作用，能夠刺激免疫細胞產生細胞因子，增加黏附分子和協(xié)同刺激分子的表達，增強抗原遞呈細胞功能，增加淋巴細胞MHC分子表達。已有研究報道，GM-CSF能夠增強疫苗的免疫效果，具有免疫佐劑的功能[5-8]。

人5型腺病毒載體已被廣泛用于疫苗開發(fā)，是一種安全有效的活病毒載體。由于其基因組缺失E1區(qū)，重組腺病毒不能自主復制，安全性比較高[9]。本研究利用腺病毒表達系統(tǒng)，構建了由FMDV 2A蛋白串聯(lián)表達GM-CSF和PEDV S1蛋白的重組腺病毒，為PEDV重組病毒活載體疫苗的研究奠定基礎。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1菌株、質粒和細胞大腸埃希菌BJ5183菌株、pShuttle-CMV質粒、pAdEasy-1質粒、HEK-293A細胞均購自QbioGen公司；經密碼子優(yōu)化的S1(m)質粒、含有GM-CSF和2A序列的pShuttle-GMCSF2A質粒、E.coliDH5α由本實驗室保存。

1.1.2試劑T4 DNA連接酶、限制性內切酶、高保真DNA聚合酶primerSTAR購自Takara公司；質粒提取試劑盒購自QIAGEN公司；DNA回收試劑盒購自BIOMEGA公司；辣根過氧化物酶標記兔抗鼠IgG、FITC-羊抗兔IgG購自博士德公司；PacI和PmeI購自New England Biolabs公司；反轉錄試劑盒購自Invitrogen公司；TransFastTMTransfection Reagent 購自Promega公司；GM-CSF蛋白多抗和PEDV S1蛋白多抗由本實驗室制備保存。

1.2方法

1.2.1重組腺病毒穿梭載體的構建以S1(m)質粒為模板，引物Ad-S1(m)-F/Ad-S1(m)-R(表1)經PCR擴增目的片段S1(m)；以pShttle-GMCSF2A質粒為模板，引物Ad-GMCSF2A-F/ Ad-GMCSF2A-R(見表1)經PCR擴增含有FMDV 2A基因的GM-CSF基因(GMCSF2A)。將目的基因GMCSF2A和S1(m)定向克隆至pShuttle-CMV載體獲得重組穿梭質粒，轉化至DH5α感受態(tài)細胞，將疑似克隆進行測序，正確的命名為pShuttle-GMCSF2A-S1(m)。

表1　用于構建重組載體pShuttle-GMCSF2A-S1(m)的引物

1.2.2重組腺病毒質粒的構建用限制性內切酶PmeI線性化重組穿梭質粒pShuttle-GMCSF2A-S1(m)，電轉化至含有腺病毒骨架載體pAdEasy-1的大腸埃希菌BJ5183感受態(tài)細胞中。用QIGEN質粒提取試劑盒提取重組質粒，限制性內切酶PacI酶切鑒定，命名為pAd-GMCSF2A-S1(m)。

1.2.3重組腺病毒質粒的轉染提取重組腺病毒質粒pAd-GMCSF2A-S1(m)，經PacI酶切后，用 Trans FastTMTransfection Reagent轉染HEK-293A細胞。在滅菌的離心管中先后加入200 μL不含血清的DMEM、5 μg重組腺病毒質粒和6 μL轉染試劑，渦旋混勻，室溫靜置15 min；從細胞培養(yǎng)箱中取出24孔細胞板，棄去細胞培養(yǎng)基；將混合液輕輕加入細胞表面上；輕輕混勻使混合液覆蓋整個細胞表面，將細胞板置于細胞培養(yǎng)箱中作用1.0 h，輕輕加入500 μL預熱的含有50 mL/L胎牛血清的DMEM；將細胞板置于細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)14 d左右，直至產生細胞病變。

1.2.4重組腺病毒的PCR鑒定將初代出現(xiàn)病變的細胞培養(yǎng)物反復凍融，離心取上清，接種HEK-293A細胞，連續(xù)傳9代，觀察細胞病變(CPE)。取第3代和第9代病變細胞培養(yǎng)物，抽提DNA，用PCR檢測目的基因。同時將第9代重組腺病毒感染HEK-293A細胞，用GM-CSF和S1蛋白多抗進行Western blot和間接免疫熒光(IFA)檢測目的基因的表達情況。將鑒定為陽性的重組腺病毒命名為rAd- GMCSF2A-S1(m)。

1.2.5重組腺病毒的IFA鑒定將10 mol重組腺病毒rAd-GMCSF2A-S1(m)感染HEK-293A細胞，培養(yǎng)24 h后，棄去細胞液，用預冷的無水乙醇固定，一抗為GM-CSF多抗或者S1蛋白多抗，二抗為熒光標記羊抗兔IgG，熒光顯微鏡下觀察結果。

1.2.6重組腺病毒的Western blot鑒定收集rAd-GMCSF2A-S1(m)感染的HEK-293A細胞，進行SDS-PAGE電泳及轉印，設立HEK-293A細胞和wtAd感染的HEK-293A細胞做為陰性對照。一抗為GM-CSF多抗或者S1蛋白多抗，二抗為熒光標記羊抗兔IgG。

1.2.7重組腺病毒的一步生長曲線分別用10 mol rAd-GMCSF2A-S1(m)和wtAd接種HEK-293A細胞，在接種后12、24、36、48、60 h和72h收取病毒并進行毒價測定，建立rAd-GMCSF2A-S1(m)和wtAd一步生長曲線。

2結果

2.1重組腺病毒的制備

將重組腺病毒質粒pAd-GMCSF2A-S1(m)經PacI線性化后轉染HEK-293A細胞，轉染10 d出現(xiàn)細胞病變，細胞變圓、脫落、拉絲、出現(xiàn)空洞。第12天收獲病毒進行傳代。提取第3代和第9代重組腺病毒DNA，經PCR擴增均能檢測出約為2 397 bp的S1基因和475 bp的GM-CSF基因，而wtAd和HEK-293A細胞中均未檢測這兩種基因(圖1)。

2.2IFA鑒定重組腺病毒中S1和GMCSF蛋白表達

將第9代重組腺病毒rAd-GMCSF2A-S1(m)感染HEK-293A細胞，以S1蛋白多抗或GMCSF蛋白多抗為一抗，F(xiàn)ITC-IgG為二抗，通過IFA鑒定S1和GM-CSF蛋白表達。結果表明，S1和GM-CSF蛋白在重組腺病毒感染的HEK-293A細胞中獲得有效表達(圖2)。

2.3Western blot鑒定重組腺病毒中S1和GMCSF蛋白表達

將重組腺病毒rAd-GMCSF2A-S1(m)和wtAd分別感染HEK-293A細胞，收獲細胞，經裂解后通過S1蛋白多抗或GM-CSF蛋白多抗進行Western blot鑒定。結果表明，重組腺病毒rAd-GMCSF2A-S1(m)在HEK-293A細胞能夠表達S1蛋白和GM-CSF蛋白，分子質量分別約為86 ku和17 ku，而wtAd在HEK-293A細胞沒有蛋白表達(圖3和圖4)。

M.DNA 標準 DL 5 000；1.HEK-293A細胞；2.野生型腺病毒；3.第3代rAd-GMCSF2A-S1(m)的S1基因PCR產物；4.第3代rAd-GMCSF2A-S1(m)的GM-CSF基因PCR產物；5.第9代rAd-GMCSF2A-S1(m)的S1基因PCR產物；6.第9代rAd-GMCSF2A-S1(m)的GM-CSF基因PCR產物

M.DNA Marker DL 5 000; 1.HEK-293A cell; 2.wtAd; 3.S1 gene of 3rd generation rAd-GMCSF2A-S1(m); 4.GM-CSF gene of 3rd generation rAd-GMCSF2A-S1(m); 5.GM-CSF gene of 9rd generation rAd-GMCSF2A-S1(m) ; 6.S1 gene of 9rd generation rAd-GMCSF2A-S1(m)

圖1重組腺病毒rAd-GMCSF2A-S1(m)的PCR鑒定

Fig.1Identification of the recombinant adenovirus

rAd-GMCSF2A-S1(m) by PCR

2.4重組腺病毒的生長特性

將重組腺病毒rAd-GMCSF2A-S1(m)和wtAd以10 mol劑量分別接種HEK-293A細胞，每隔12 h進行病毒滴度測定，繪制一步生長曲線。結果表明，隨著重組腺病毒感染細胞培養(yǎng)時間的延長，病毒滴度逐漸升高，在60 h病毒滴度達到峰值，隨后開始下降(圖5)。

3討論

豬流行性腹瀉病毒 S蛋白是一種纖突蛋白，位于病毒粒子表面，具有受體結合、誘導中和抗體、促進病毒和細胞融合等作用。研究表明S蛋白含有1個中和表位區(qū)域COE和3個線性表位，只有1個線性表位位于S2，其余均位于S1。將近年來流行毒株和疫苗毒株CV777全基因組比對分析發(fā)現(xiàn)，S蛋白變異性最大，包括氨基酸插入和缺失、糖基化位點改變和中和表位區(qū)域及線性表位中氨基酸變異[10-12]。粒細胞巨噬細胞集落刺激因子(GM-CSF)是能夠促進樹突狀細胞和巨噬細胞的分化和成熟，增強巨噬細胞和中性粒細胞的吞噬和殺傷功能和抗體依賴性細胞介導的細胞毒作用，增強抗原遞呈細胞(antigen presenting cell,APC)的抗原遞呈作用及促進APC向疫苗接種或病原感染部位遷移[13-14]。

圖2　IFA檢測S1和GM-CSF蛋白在rAd-GMCSF2A-S1(m)感染HEK-293A細胞中表達

1.HEK-293A細胞；2.野生型腺病毒；3.重組腺病毒rAd-GMCSF2A-S1(m)

1.HEK-293A cells; 2.wtAd; 3.recombinant adenovirus rAd-GMCSF2A-S1(m)

圖3Western blot檢測S1蛋白在rAd-GMCSF2A-

S1(m)感染HEK-293A細胞中表達

Fig.3Detection of S1 gene expression in HEK-293A cells infected

with rAd-GMCSF2A-S1(m) by Western blot

1.HEK-293A細胞；2.野生型腺病毒；3.重組腺病毒rAd-GMCSF2A-S1(m)

1.HEK-293A cells; 2.wtAd; 3.Recombinant adenovirus rAd-GMCSF2A-S1(m)

圖4Western blot檢測GM-CSF蛋白在rAd-GMCSF2A-

S1(m)感染HEK-293A細胞中表達

Fig.4Detection of GM-CSF gene expression in HEK-293A

cells infected with rAd-GMCSF2A-S1(m) by Western blot

圖5　rAd-GMCSF2A-S1(m)與wtAd的一步生長曲線

本研究以FMDV的2A蛋白作為連接肽將S1和GMCSF基因串聯(lián)后構建重組腺病毒活載體疫苗。S1基因為PEDV變異毒株基因，進行密碼子，采用宿主偏愛的密碼子以提高外源蛋白的表達。FMDV 2A是一個順式裂解元件，含有16個氨基酸殘基，可以用于幾種抗原基因的同時表達，并且可以使其上游和下游蛋白表達量相當[15]。本研究中重組腺病毒表達的S1蛋白和GM-CSF蛋白，經IFA鑒定，均出現(xiàn)熒光，表明重組腺病毒成功表達外源蛋白；經Western blot鑒定，重組腺病毒表達的S1蛋白和GM-CSF蛋白大小分別約為86 ku和17 ku，表明FMDV的2A蛋白實現(xiàn)了自我剪切。通過病

毒滴度測定，重組腺病毒rAd-GMCSF2A-S1與其親本病毒的一步生長曲線并無明顯差異，表明rAd-GMCSF2A-S1復制能力較好。本研究構建的重組腺病毒rAd-GMCSF2A-S1為進行豬體免疫效果評價和PEDV新型疫苗研制奠定了基礎。

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Construction of Recombinant Adenovirus Co-expressing PEDV S1 and GM-CSF Proteins

ZHAO Pan-deng1,DONG Jan-guo2，DENG Tong-wei1，CHEN Yi1，XU Yao-hui1，JIANG Zeng-hai1，LU Jian-zhou1，WANG Xiao-ye3，WANG Yan1

(1.CollegeofVeterinaryMedicine,HenanUniversityofAnimalHusbandryandEconomy,Zhengzhou,Henan450046,China;2.CollegeofAnimalScienceandVeterinaryMedicine,XinyangCollegeofAgricultureandForestry,Xinyang,Henan464000,China;3.CollegeofAnimalScienceandTechnology,GuangxiUniversity,Nanning,Guangxi,530004,China)

Abstract:In order to construct the recombinant adenovirus expressing PEDV S1 and GM-CSF genes,the codon optimized S1 gene was linked with GM-CSF gene by FMDV 2A gene.Recombinant shuttle plasmid pShuttle-GMCSF2A-S1(m) was constructed and transformed intoEscherichiacoliBJ5183 competent cells containing adenovirus backbone vector pAdEasy-1 to produce pAd-GMCSF2A-S1(m) by homologous recombination.The recombinant adenovirus plasmid was linearized byPacI and was transfected into HEK-293A cells.The recombinant adenovirus rAd-GMCSF2A-S1 was rescued and identified by indirect immunofluorescence and Western blot assay.The results showed that S1 and GM-CSF proteins were expressed in HEK-293A cells infected with rAd-GMCSF2A-S1.This study laid a foundation for the development of recombinant live vector vaccine against PEDV.

Key words:Porcine epidemic diarrhea virus; S1 gene; GM-CSF; recombinant adenovirus

收稿日期：2016-01-20

作者簡介：趙攀登(1986-)，男，河南商丘人，講師，博士,主要從事動物醫(yī)學研究。*通訊作者

中圖分類號:S852.65

文獻標識碼:A

文章編號:1007-5038(2016)06-0068-05