不同產(chǎn)地延齡草中延齡草總皂苷的含量測(cè)定

不同產(chǎn)地延齡草中延齡草總皂苷的含量測(cè)定

高昕1，黃仟照1，江雨霖1，孫衛(wèi)1，屈鈳楠1，孫文軍2*

(1.西安交通大學(xué)藥學(xué)院，西安710061；2.西安新通藥物研究有限公司，西安710077)

摘要：目的建立延齡草中總皂苷的含量測(cè)定方法，比較研究不同產(chǎn)地延齡草中總皂苷的含量。方法以薯蕷皂苷元為對(duì)照品，采用分光光度法，高氯酸顯色，在410 nm處測(cè)定吸光度，計(jì)算延齡草中總皂苷的含量。結(jié)果薯蕷皂苷元在4.12~49.44 μg范圍內(nèi)與吸光度值呈良好的線(xiàn)性關(guān)系(r=0.998 9)，平均回收率為97.3%，RSD為2.5%。結(jié)論該方法操作簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確、靈敏、重復(fù)性好，可用于延齡草樣品中總皂苷的含量測(cè)定，不同產(chǎn)地樣品，總皂苷含量有差異。

關(guān)鍵詞：延齡草；總皂苷；薯蕷皂苷元；分光光度法

doi:10.3969/j.issn.1004-2407.2015.03.005

中圖分類(lèi)號(hào)：R284

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號(hào)：1004-2407(2015)03-0234-03

Abstract:ObjectiveTo establish a method for the determination and comparison of total saponins in Trillium tschonoskii Maxim from different origins. MethodsWith diosgenin as a reference substance, HClO4 as a coloration reagent, the content of total saponins in Trillium tschonoskii Maxim was determined at 410 nm by UV spectrophotometry. ResultsDiosgenin showed a good linear curve in the range of 4.12-49.44 μg (r=0.998 9). The recovery of total saponins was 97.3% with RSD 2.5%(n=6). Conclusion The method is simple, rapid and accuracy. The content of total saponins in Trillium tschonoskii Maxim varied in origins.

基金項(xiàng)目：中央高?；究蒲袠I(yè)務(wù)費(fèi)專(zhuān)項(xiàng)資助項(xiàng)目(編號(hào).Xjj2012051);必康制藥科研基金培育項(xiàng)目；西安交通大學(xué)新教師科研支持計(jì)劃

作者簡(jiǎn)介：高昕，女，博士，講師

收稿日期：(2014-12-17)

Determination of total saponins ofTrilliumtschonoskiiMaxim from different origins

GAO Xin1，HUANG Qianzhao1，JIANG Yulin1，SUN Wei1，QU Kenan1，SUN Wenjun2*(1.School of Pharmacy， Xi′an Jiaotong University， Xi′an 710061， China； 2. Information Department of Science and Technology， Xi′an Xintong Pharmaceutical Research Limited Company， Xi′an 710077，China)

Key words:TrilliumtschonoskiiMaxim； total saponins； diosgenin； spectrophotometry

*通信作者：孫文軍，男，博士，助理研究員

延齡草又名頭頂一顆珠、芋兒七，為百合科延齡草屬植物延齡草(TrilliumtschonoskiiMaxim，TTM)的干燥根和根莖，主要分布在中國(guó)及日本，生長(zhǎng)在海拔1 600～3 200 m的林下、山谷陰濕的環(huán)境下。在傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，內(nèi)外婦兒皆有應(yīng)用，尤其對(duì)一些疑難雜癥，療效顯著，如：常年的高血壓性眩暈、頭痛，長(zhǎng)期用腦的血虛、神經(jīng)衰弱、失眠，腦震蕩后遺癥，血管性癡呆等。延齡草的相關(guān)研究多集中在20世紀(jì)80年代，主要為化學(xué)成分研究。近年來(lái)，由于發(fā)現(xiàn)其對(duì)老年癡呆、腫瘤、免疫調(diào)節(jié)等方面的作用[1-4]，對(duì)其的研究與開(kāi)發(fā)日益受到重視。延齡草為國(guó)家三級(jí)重點(diǎn)保護(hù)野生植物，是珍稀瀕危物種，人工培育等相關(guān)研究也取得了一定的進(jìn)展，為資源的保護(hù)和開(kāi)發(fā)提供了保證。研究表明，甾體皂苷是其主要成分，類(lèi)型以偏諾皂苷和薯蕷皂苷為主，延齡草總皂苷已被證實(shí)具有抗腫瘤、抗老年癡呆等多方面的藥理作用[5-6]。為了合理利用延齡草資源，本研究建立延齡草中總皂苷的含量測(cè)定方法，比較不同產(chǎn)地的延齡草中總皂苷的含量，為其質(zhì)量控制及有效成分的綜合開(kāi)發(fā)和利用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1儀器與試藥

1.1儀器SCILOGEX臺(tái)式高速離心機(jī)(美國(guó)SCILOGEX公司)；722N可見(jiàn)分光光度計(jì)(上海佑科儀器儀表有限公司)；Eppendorf Research? plus移液器(德國(guó)Eppendorf公司)；電子天平(常州萬(wàn)泰天平儀器有限公司)；RE-5299型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器(上海亞榮生化儀器廠(chǎng))。

1.2試藥延齡草藥材來(lái)自陜西秦嶺太白山、佛坪、河北、湖北、四川等地，經(jīng)西安交通大學(xué)生藥教研室牛曉峰教授鑒定為延齡草(TrilliumtschonoskiiMaxim.)的干燥根和根莖；薯蕷皂苷元對(duì)照品(美國(guó)Sigma公司)；水為蒸餾水；甲醇、乙醇、高氯酸、香草醛、冰醋酸等試劑均為分析純。

2方法與結(jié)果

2.1對(duì)照品溶液的配制精密稱(chēng)取減壓干燥至恒定質(zhì)量的薯蕷皂苷元對(duì)照品20.6 mg，加甲醇適量溶解并定容至50 mL量瓶中，作為對(duì)照品母液，精密吸取適量于量瓶中，甲醇稀釋?zhuān)玫胶硎氃碥赵?.041 2 mg·mL-1的對(duì)照品溶液。

2.2供試品溶液的制備精密稱(chēng)取延齡草藥材粗粉，每份0.25 g，加入體積分?jǐn)?shù)70%乙醇20 mL，回流提取2次，每次1 h，合并提取液，定容至50 mL量瓶中，作為供試品溶液。

2.3方法學(xué)考察

秀容川栽落草地，不動(dòng)了。老砍頭走上前，略一探查，發(fā)覺(jué)秀容川心不跳了，脈搏也停止了，再看他眼睛，兩只瞳孔也散了。

2.3.1顯色方法及波長(zhǎng)的選擇精密吸取對(duì)照品溶液和供試品溶液各0.5 mL各2份，分別置于10 mL具塞試管中，加熱揮干溶劑，分別用2種顯色劑顯色，按照分光光度法于350~600 nm波長(zhǎng)測(cè)定吸光度。比較供試品與對(duì)照品光譜在可見(jiàn)光區(qū)吸收?qǐng)D譜的一致性，確定最大吸收波長(zhǎng)，并考察1 h內(nèi)的穩(wěn)定性。方法A：精密加入高氯酸5 mL，搖勻，置室溫反應(yīng)25 min，高氯酸為空白溶劑。方法 B：精密加入新配制的50 mg·mL-1香草醛冰乙酸溶液、高氯酸(2∶8)混合液5 mL，搖勻，置于60 ℃水浴中保溫15 min，取出冰水迅速冷卻至室溫，加冰乙酸5 mL，混勻，顯色劑為空白溶劑[7-8]。結(jié)果表明，用高氯酸作為顯色劑，對(duì)照品溶液和供試品溶液在可見(jiàn)光區(qū)吸收波譜的一致性較好，且均在410 nm處有最大吸收，空白對(duì)照無(wú)干擾，故檢測(cè)波長(zhǎng)選擇410 nm。見(jiàn)圖1。

圖12種顯色方法的可見(jiàn)光吸收光譜圖

A.高氯酸顯色； B.香草醛冰乙酸溶液-高氯酸顯色

Fig.1 Visible absorption spectra with two different coloration reagents

A.perchloric acid；B.Vanillin-ice acetic acid-perchloric acid

2.3.2標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的繪制精密吸取對(duì)照品溶液0.1，0.2，0.4，0.6，0.8，1.0和1.2 mL,分別置于10 mL具塞試管中，按2.3.1項(xiàng)下方法操作，于410 nm處測(cè)定吸光度(A)，以A為縱坐標(biāo)，以對(duì)照品質(zhì)量(μg)為橫坐標(biāo)，得回歸方程：Y=0.019 3X-0.012 9(r=0.998 9)，線(xiàn)性范圍4.12~49.44 μg。

2.3.3精密度實(shí)驗(yàn)精密吸取對(duì)照品溶液0.5 mL，按照2.3.1 項(xiàng)下方法顯色，測(cè)定吸光度，連續(xù)測(cè)定5次，結(jié)果RSD為1.10%，說(shuō)明儀器的精密度良好。

2.3.4穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)精密吸取供試品溶液0.5 mL，按照2.3.1項(xiàng)下方法操作，于不同時(shí)間測(cè)定其吸光度值，放置5，15，30，60，90，120，180和1 440 min后，吸光度分別為0.495，0.494，0.495，0.501，0.506，0.508，0.512和0.539，RSD為1.48%。結(jié)果表明該方法在1 440 min內(nèi)，溶液有較好的穩(wěn)定性。

2.3.5重復(fù)性實(shí)驗(yàn)精密吸取延齡草提取液0.5 mL，6份，按照2.3.1項(xiàng)下方法操作，測(cè)定吸光度值，RSD為2.26%，表明該顯色方法的重復(fù)性良好。

2.3.6加樣回收率實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)確稱(chēng)取已知含量的延齡草藥材干燥粗粉6份，每份0.125 g，加入薯蕷皂苷元適量，按照2.2項(xiàng)下方法制備樣品溶液，各取0.5 mL樣品液，按照2.3.1項(xiàng)下方法顯色后測(cè)定吸光度，計(jì)算回收率，結(jié)果見(jiàn)表1。平均加樣回收率為97.3%，RSD為2.5%。

表1回收率實(shí)驗(yàn)結(jié)果

Tab.1 Results of recovery rate by standard addition method

( n=6)

2.4.1提取方法的比較A浸漬法：精密稱(chēng)取延齡草藥材干燥粗粉0.25 g，用乙醇20 mL浸漬24 h，時(shí)時(shí)振搖，濾過(guò)，濾液用乙醇定容。

B超聲法：精密稱(chēng)取延齡草藥材干燥粗粉0.25 g，用乙醇20 mL超聲處理(功率250 W，頻率33 kHz) 30 min，濾過(guò)，濾液用乙醇定容。

C加熱回流法：精密稱(chēng)取延齡草藥材干燥粗粉0.25 g，加入乙醇20 mL，回流提取1 h，濾過(guò)，濾液用乙醇定容。每個(gè)條件進(jìn)行3個(gè)平行實(shí)驗(yàn)。

結(jié)果比較，取3種提取液，分別測(cè)定總皂苷含量(總皂苷含量=提取液中的總皂苷測(cè)得量/稱(chēng)樣量×100%)。結(jié)果浸漬法、超聲法和回流法樣品中測(cè)得總皂苷含量分別為0.46%，0.89%和1.05%。可知3種提取方法中，加熱回流法提取所得總皂苷的含量最高，超聲法次之，浸漬法最低，故宜選用加熱回流法對(duì)延齡草藥材進(jìn)行提取。

2.4.2提取溶媒考察精密稱(chēng)取延齡草藥材粗粉15份，每份0.25 g，精密稱(chēng)定，分別用水、體積分?jǐn)?shù)分別為30%乙醇、50%乙醇、70%乙醇和乙醇回流提取1 h，溶媒用量均為20 mL，濾液定容后，分別測(cè)定總皂苷含量。每個(gè)條件進(jìn)行3個(gè)平行實(shí)驗(yàn)。結(jié)果上述不同提取溶媒的樣品中測(cè)得總皂苷含量分別為0.30%，0.99%，0.92%，1.25%和1.04%。結(jié)果表明，用體積分?jǐn)?shù)70%乙醇提取時(shí)延齡草總皂苷的得率最高，因此選擇體積分?jǐn)?shù)70%乙醇為提取溶媒。

2.4.3提取次數(shù)考察精密稱(chēng)取延齡草藥材粗粉0.25 g，加入20 mL 體積分?jǐn)?shù)70%乙醇回流提取1 h，分別提取1，2和3次，濾液合并濃縮，定容至50 mL。每個(gè)條件進(jìn)行3個(gè)平行實(shí)驗(yàn)。分別測(cè)定總皂苷含量。結(jié)果上述提取次數(shù)的總皂苷含量分別為1.27%，1.56%和1.61%。從充分提取和操作時(shí)間上綜合考慮，選擇提取2次為最佳提取次數(shù)。

2.5延齡草樣品中總皂苷含量測(cè)定精確稱(chēng)取不同產(chǎn)地的樣品，各3份，按2.2項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按2.3.1項(xiàng)下方法顯色后測(cè)定吸光度，由回歸方程計(jì)算供試品延齡草中總皂苷的含量，測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表2。

表2不同產(chǎn)地延齡草中總皂苷含量測(cè)定結(jié)果

Tab.2 Contents of total saponins inTrilliumtschonoskiiMaxim from different origins

產(chǎn)地批號(hào)總皂苷含量/%RSD/%陜西太白山區(qū)201310231.692.35陜西佛坪201310121.582.59湖北神農(nóng)架201311291.371.87河北安國(guó)藥材市場(chǎng)201312021.332.67四川荷花池藥材市場(chǎng)201312161.253.14安徽亳州藥材市場(chǎng)201206250.862.91江西樟樹(shù)藥材市場(chǎng)201212291.122.48

3討論

為使樣品中的總皂苷得到充分提取，首先對(duì)樣品的制備方法進(jìn)行了考察，分別比較了不同提取方法(冷浸、回流和超聲提取法)，不同提取時(shí)間(1，2和3 h)和不同體積分?jǐn)?shù)提取溶媒(水、體積分?jǐn)?shù)30%乙醇、50%乙醇、70%乙醇和乙醇)對(duì)總皂苷含量的影響。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，采用體積分?jǐn)?shù)70%乙醇回流提取2次，每次1 h，可使藥材中的總皂苷得到較充分地提取，而且提取方法簡(jiǎn)便易行，時(shí)間短，效率高。

本文比較研究了高氯酸及50 g·L-1香草醛-冰醋酸-高氯酸(2∶8)2種顯色方法，結(jié)果顯示，以高氯酸為顯色劑，對(duì)照品和供試品的吸收波譜一致性和重復(fù)性較好。本研究還考察了實(shí)驗(yàn)過(guò)程中水浴加熱對(duì)高氯酸顯色的影響，結(jié)果表明，無(wú)論是室溫放置25 min，還是加熱至60 ℃反應(yīng)后冷水浴充分冷卻，吸光度值沒(méi)有顯著性差異，都可獲得良好的重復(fù)性和穩(wěn)定性。因此，選擇室溫放置反應(yīng)的方式，顯色穩(wěn)定，操作簡(jiǎn)單，符合定量要求。

產(chǎn)地是中藥質(zhì)量的本草學(xué)屬性，在中藥質(zhì)量評(píng)價(jià)中有著不可或缺的重要地位。優(yōu)質(zhì)藥材的產(chǎn)地稱(chēng)為“道地”產(chǎn)區(qū)。延齡草在中國(guó)主要分布于陜西、湖北、四川、云南等地，為著名的陜西七藥，民間應(yīng)用較多，延齡草皂苷類(lèi)成分是延齡草中重要的活性成分。實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，不同產(chǎn)區(qū)的延齡藥材草中總皂苷含量不同，含量最高的為陜西太白山區(qū)的延齡草藥材，含量最低的來(lái)自于安徽亳州藥材市場(chǎng)。不同產(chǎn)區(qū)藥材中延齡草皂苷的含量差異較大，這為深入研究和確定藥材的道地產(chǎn)區(qū)提供科學(xué)依據(jù)，也為延齡草質(zhì)量評(píng)價(jià)和質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)的制定奠定基礎(chǔ)。

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