原核微生物基因敲除策略的研究進展

陽燕　楊英明,2　胡濤,2

1.口腔疾病研究國家重點實驗室　華西口腔醫(yī)院牙體牙髓病科（四川大學(xué)） 成都 610041；2.口腔疾病研究國家重點實驗室　華西口腔醫(yī)院預(yù)防科（四川大學(xué)） 成都 610041

原核微生物基因敲除策略的研究進展

陽燕1楊英明1,2胡濤1,2

1.口腔疾病研究國家重點實驗室華西口腔醫(yī)院牙體牙髓病科（四川大學(xué)） 成都 610041；2.口腔疾病研究國家重點實驗室華西口腔醫(yī)院預(yù)防科（四川大學(xué)） 成都 610041

基因敲除是一項20世紀(jì)80年代末發(fā)展起來的新型分子生物學(xué)技術(shù)，在微生物領(lǐng)域的機制和功能研究中，具有極其重要的意義。經(jīng)過數(shù)十年的發(fā)展，基因敲除技術(shù)從最傳統(tǒng)的同源重組策略發(fā)展出λRed重組系統(tǒng)、CreloxP重組系統(tǒng)等方法，近年又誕生了成簇的規(guī)律間隔的短回文重復(fù)序列/Cas9等基于核酸內(nèi)切酶原理的高效打靶技術(shù)，將微生物基因功能研究推向新的高度和方向。本文就這些應(yīng)用于原核微生物的基因敲除策略的原理、現(xiàn)狀和前景等研究進展作一綜述。

基因敲除；聚合酶鏈反應(yīng)；連接誘變技術(shù)；λRed重組系統(tǒng)；Cre-loxP重組系統(tǒng)；成簇的規(guī)律間隔的短回文重復(fù)序列/Cas9技術(shù)

This study was supported by Special Prophase Project on National 973 Program（2012CB526707） and National Natural Science Foundation of China（81100746，81400507）.

［Abstract］Gene knockout is a new molecular technique that developed in 1980s which has plays crucial roles in the microbiology functional and basic research. Through the development of several decades，gene knockout technique has been evolved from traditional homogenous recombination to λRed recombination and Cre-loxP system. Recently，the clustered regulatory interspaced short palindromic repeat/Cas9 system has been thought to be a very promising methods for microbiology manipulation for its' convenience and effectiveness based on the activity of endonuclease. This review will focus on the gene deletion technique that has been applied in the microbiology research from the mechanism，application and prospect.

［Key words］gene knockout；polymerase chain reaction；ligation mutagenesis；λRed recombination；Cre-loxP recombination；clustered regularly interspaced short palindromic repeat/Cas9

基因敲除又稱基因打靶，是一種通過一定途徑使基因去除或失活的遺傳工程技術(shù)，為定向改造細(xì)菌和真菌等微生物提供了重要的技術(shù)支撐，不僅克服了傳統(tǒng)誘變方法的盲目性和偶然性，而且經(jīng)改造的基因能進行穩(wěn)定地復(fù)制遺傳，是微生物遺傳工程研究的重大飛躍。隨著微生物基因組全序列的詮釋和功能基因定位以及分子生物學(xué)技術(shù)的進步，以基因敲除對微生物進行基因功能的研究發(fā)展日益迅速。

基因敲除技術(shù)在基于基因重組技術(shù)的基礎(chǔ)上，衍生出插入突變、RNA干擾、λRed重組系統(tǒng)、Cre-loxP重組系統(tǒng)等成熟且普遍使用的敲除策略，近年來興起的鋅指核酸酶（zinc finger nuclease，ZFN）、轉(zhuǎn)錄激活因子樣效應(yīng)物核酸酶（transcription activator-like effector nucleases，TALEN）、成簇的規(guī)律間隔的短回文重復(fù)序列（clustered regularly interspaced short palindromic repeat，CRISPR）/Cas9等多種具有極高特異性的基因靶向修飾技術(shù)，極大地提高了基因敲除的效率，為基因功能研究創(chuàng)造了新的途徑。這些技術(shù)在胚胎干細(xì)胞和真核細(xì)胞領(lǐng)域的應(yīng)用成為熱點，但在原核微生物領(lǐng)域的應(yīng)用、技術(shù)原理和最新進展卻鮮有報道；因此，本文就原核微生物基因敲除策略的發(fā)展歷程、原理、現(xiàn)狀和前景等研究進展作一綜述。

1　基于同源重組的基因敲除策略

同源重組是指在DNA分子內(nèi)或分子間發(fā)生同源序列聯(lián)會和片段交換的過程。利用DNA轉(zhuǎn)化技術(shù)，將含有外源打靶基因和側(cè)翼同源序列的重組載體轉(zhuǎn)化入靶細(xì)胞，通過側(cè)翼上同源序列的重組配對，使打靶基因整合并替換靶基因，再經(jīng)復(fù)制傳代，篩選出目的打靶菌株。

1.1環(huán)狀自殺質(zhì)粒技術(shù)

環(huán)狀自殺質(zhì)粒技術(shù)通過宿主細(xì)菌的自殺質(zhì)粒載體來攜帶靶基因同源序列進行基因敲除，有單交換和雙交換兩種重組策略。同源單交換只發(fā)生一次同源重組，簡便易行且較穩(wěn)定［1］。單交換發(fā)生后，整個質(zhì)粒載體插入靶基因內(nèi)部并產(chǎn)生無活性靶基因。經(jīng)過兩次單交換才達到敲除靶基因的目的，稱為同源雙交換。同源雙交換可通過缺失靶基因編碼區(qū)中的某區(qū)段，或基因敲除后插入額外基因，如抗生素抗性基因、sacB負(fù)篩選標(biāo)志基因等，達到目的基因失活的目的［2］。

1.2聚合酶鏈反應(yīng)連接誘變技術(shù)

聚合酶鏈反應(yīng)（polymerase chain reaction，PCR）連接誘變技術(shù)是一種能在細(xì)菌中迅速構(gòu)建基因敲除突變體的方法，完全不依賴中間媒介載體，減少了外源性載體在基因功能研究時可能造成的影響。該技術(shù)的基本路線為：首先設(shè)計引物P1/P2、P3/P4，分別擴增靶基因的側(cè)翼序列，引物E1/E2擴增基因破壞盒子EmAM序列并引入酶切位點；對三組分片段進行酶切連接后，將連接片段轉(zhuǎn)化導(dǎo)入宿主細(xì)菌細(xì)胞中，側(cè)翼同源序列進行同源交換；最終EmAM序列替換敲除的目標(biāo)序列。Lau等［3］采用PCR連接誘變技術(shù)在革蘭陽性細(xì)菌中精確刪除了目的基因，從而提供了該技術(shù)在微生物領(lǐng)域得以廣泛應(yīng)用的理論和實踐依據(jù)。PCR連接誘變技術(shù)最大的優(yōu)勢是不需要額外導(dǎo)入載體，減少了外源性載體在基因功能研究時可能造成的影響。

基于同源重組原理進行的基因敲除技術(shù)能精確定點地改造DNA片段，不僅可以用突變基因敲除健康基因，以研究該基因的功能調(diào)控作用；也可用健康基因敲除突變基因，以達到性狀改良或治療遺傳病的目的。由于原核微生物細(xì)胞的結(jié)構(gòu)相對于真核細(xì)胞單一，因而同源重組敲除技術(shù)在微生物中有著更廣泛的應(yīng)用；然而，同源重組效率較低，尤其是大片段基因敲除使實際的工作量增加，載體或抗性基因的加入可能整合出新的未知功能，且載體或連接片段在某些菌種有一定的轉(zhuǎn)化難度，這就極大地限制了該技術(shù)在微生物研究中的應(yīng)用。

2　基于隨機插入的基因敲除策略

插入缺失突變是利用可隨機插入基因序列的病毒、細(xì)菌或其他基因載體，在靶基因中進行隨機插入突變，再通過對相應(yīng)的標(biāo)志物進行篩選或已知的序列標(biāo)簽進行序列分析，從而獲得相應(yīng)基因敲除細(xì)胞的方法。目前應(yīng)用于原核微生物較為有效的插入缺失方法，主要通過噬菌體或轉(zhuǎn)座子插入突變。轉(zhuǎn)座子是一種DNA序列單元，其兩端為兩個顛倒的重復(fù)序列，中間為抗性基因和轉(zhuǎn)座酶轉(zhuǎn)座子可在不同的復(fù)制子間轉(zhuǎn)移，以一種非正常重組的方式隨機插入到細(xì)菌DNA位點上，改變原有基因序列的排序，導(dǎo)致插入位置的基因突變或失活［4］。

基于隨機插入的基因敲除策略，轉(zhuǎn)座子或噬菌體可隨機插入到革蘭陽性菌或革蘭陰性菌染色體的多個位點上，且插入后穩(wěn)定性好，不易回復(fù)突變。基因插入過程是隨機的，一般不能用于特定基因的敲除，通常需將該策略與直接突變的方法，如自殺質(zhì)粒［5］進行互補。

3　基于噬菌體重組系統(tǒng)的敲除策略

3.1λRed重組技術(shù)

λRed重組系統(tǒng)為λ噬菌體重組系統(tǒng)，是利用整合到細(xì)菌染色體上或質(zhì)粒中的Red系統(tǒng)編碼的重組酶來實現(xiàn)外源性PCR片段與基因組中靶基因的同源重組。Red系統(tǒng)編碼基因由exo、bet和gam組成，其中exo基因的產(chǎn)物為λ核酸外切酶，可將雙鏈DNA 5'端切開，產(chǎn)生3'端DNA區(qū)段；bet基因編碼的β蛋白可與單鏈DNA結(jié)合促進互補鏈復(fù)性，并可介導(dǎo)退火和交換反應(yīng)。β蛋白和λ核酸外切酶形成的復(fù)合物具有調(diào)節(jié)核酸溶解和重組啟動的作用。gam基因產(chǎn)物為一個多肽，結(jié)合到宿主的RecBCD蛋白形成二聚體，發(fā)揮外切酶活性［6］。

λRed重組系統(tǒng)的基因敲除策略［7］如下：先根據(jù)宿主染色體上需敲除的片段兩端的序列設(shè)計合成一對引物，使每條引物的5'端有約50 bp的長度與靶序列同源，3'端與篩選基因同源。以含篩選基因的質(zhì)粒為模板，PCR獲得中間為篩選基因、兩端為同源臂A和B的線性打靶DNA。將線性打靶DNA轉(zhuǎn)化入含有Red重組系統(tǒng)的宿主菌，Red重組系統(tǒng)表達，λ核酸外切酶則結(jié)合到線性打靶DNA的同源臂A和B末端進行酶切，產(chǎn)生游離的3' DNA突出。此時，β蛋白則介導(dǎo)DNA鏈復(fù)性，從而使得同源臂和宿主DNA間以鏈入侵的方式重組。宿主DNA上A和B之間的序列被線性打靶DNA同源臂A 和B之間的篩選基因替換，從而完成對靶基因的定向敲除，得到靶基因缺失的突變株。

Red重組系統(tǒng)是一個獨立的重組系統(tǒng)，在同源重組時不依賴細(xì)菌自身的重組系統(tǒng)，利用線性打靶DNA，不需體外構(gòu)建重組質(zhì)粒，縮短了試驗周期，重組效率較傳統(tǒng)方法明顯提高［8］。Red重組系統(tǒng)主要應(yīng)用于結(jié)腸桿菌并有大量報道［7，9］，但因其在其他微生物基因工程中存在同源臂長度過長或效率較低的缺點，僅在綠膿桿菌［10］和沙門菌［11］中被少量報道。在一定的試驗條件下，如與Rac噬菌體系統(tǒng)重組為Red/ET重組系統(tǒng)［12］，或與Cre-loxP系統(tǒng)等其他技術(shù)結(jié)合使用，Red重組系統(tǒng)也可能更廣泛地應(yīng)用于結(jié)腸桿菌以外的微生物中。

3.2Cre-loxP重組系統(tǒng)

Cre-loxP重組系統(tǒng)是應(yīng)用較普遍的一種條件性基因敲除方法，來源于結(jié)腸桿菌噬菌體P1，由Cre重組酶和loxP位點兩部分組成。Cre重組酶可作用于多種結(jié)構(gòu)的DNA底物，且位點專一［13］。loxP位點是一種長34 bp的回文序列結(jié)構(gòu)，包括兩側(cè)13 bp的反向重復(fù)序列和中間8 bp的非對稱間隔序列。Cre重組酶識別并結(jié)合loxP位點兩側(cè)的反向重復(fù)序列，并與中間的間隔區(qū)發(fā)生重組，不需任何輔助因子或蛋白質(zhì)［14］。在Cre酶的介導(dǎo)下，當(dāng)兩個loxP位點同向位于同一個DNA分子上，loxP位點間的序列可被刪除，留下一個loxP位點［13］。

Cre-loxP系統(tǒng)短小專一，特異性敲除基因不攜帶抗性標(biāo)志物，避免了抗生素的應(yīng)用，不影響基因的正常表達和調(diào)控，為后續(xù)研究提供了非常有效的手段。Cre-loxP重組系統(tǒng)目前已成功應(yīng)用于多種真核細(xì)胞［15］，在原核微生物的基因敲除中也有報道，如肺炎鏈球菌［16］、變異鏈球菌［14］、乳酸鏈球菌［17］、傷寒桿菌［18］和炭疽桿菌［19］等，其在微生物基因敲除研究中有著良好的應(yīng)用前景。

4　基于核酸內(nèi)切酶的基因敲除策略——CRISPR/ Cas9技術(shù)

1987年研究者在結(jié)腸埃希菌K12的堿性磷酸酶基因附近發(fā)現(xiàn)了CRISPR，由一系列高度保守的正向重復(fù)序列和間隔序列排列而成［20］。這些間隔序列和一些噬菌體或質(zhì)粒序列存在著同源性，為細(xì)菌和古細(xì)菌細(xì)胞提供了對抗外源基因的能力，從而起到適應(yīng)性免疫的作用［21］。由于缺乏噬菌體和質(zhì)粒的序列信息，所以在很長時間內(nèi)，CRISPR的研究進展緩慢，其作為一種潛在技術(shù)并沒有得到重視和發(fā)展。

伴隨著對CRISPR功能的闡明和基因敲除技術(shù)的深入研究，Qi等［22］認(rèn)為，CRISPR/Cas9可作為一種更為簡便的基因編輯工具?！犊茖W(xué)》于2013年初對CRISPR/Cas9技術(shù)進行了連載，CRISPR/Cas9技術(shù)隨即成為一種成熟的基因組靶向修飾技術(shù)［23］，被廣泛應(yīng)用于各類體系的遺傳學(xué)改造、轉(zhuǎn)基因模式動物構(gòu)建和基因治療領(lǐng)域，成為了科學(xué)界最炙手可熱的熱點之一。

CRISPR/Cas9的作用機制大致分為3個階。

1）CRISPR高度可變間隔區(qū)的獲得。噬菌體或質(zhì)粒間隔序列的5'或3'端延伸的幾個保守堿基序列通常很保守，被稱為PAM域（protospacer adjacent motifs）。當(dāng)宿主細(xì)胞被噬菌體或質(zhì)粒入侵時，宿主細(xì)胞先識別PAM，將其臨近的protospacer序列整合入宿主基因組CRISPR5'端的兩個重復(fù)序列之間，形成新的間隔序列［24］。

2）CRISPR基因座的表達。CRISPR基因座被轉(zhuǎn)錄成前體CRISPR RNA（pre-crRNA）后，在Cas蛋白或RNaseⅢ的作用下被剪切成一些由間隔序列和重復(fù)序列做成的小RNA，即成熟crRNA［25］。

3）CRISPR/Cas系統(tǒng)活性的發(fā)揮（或是對外源遺傳物質(zhì)的干擾）。當(dāng)噬菌體或質(zhì)粒入侵細(xì)胞時，成熟crRNA與Cas蛋白形成核糖核蛋白復(fù)合物，crRNA的間隔序列與外源DNA的靶序列完全或部分互補配對，外源DNA在配對的特定位置被核糖核蛋白復(fù)合物切割［26-27］。

CRISPR/Cas9這種類似于限制性核酸內(nèi)切酶的作用特性，被迅速開發(fā)為各種生物基因位點的修飾。在真核生物中，人工合成的sgRNA能指導(dǎo)Cas9內(nèi)源性核酸酶對斑馬魚胚胎基因的修飾［28］。有學(xué)者［23］利用一個包含2個不同靶向基因的間隔序列的crRNA實現(xiàn)了對2個基因同時進行編輯。至今，CRISPR/Cas技術(shù)已成功應(yīng)用于人類細(xì)胞［29］、模式鼠［30］、植物［31］、斑馬魚［28］、蛙［32］、蠕蟲［33］、果蠅［34］和酵母［35］等真核細(xì)胞的基因編輯。

CRISPR/Cas系統(tǒng)作為第三代基因編輯技術(shù)，操作簡便，可用位置多。理論上基因組每8個堿基便有一個可用CRISPR/Cas9進行編輯的位置，對雙鏈DNA和單鏈DNA均可靈活切開，且其基因編輯效率明顯高于其他基因編輯技術(shù)［36］。在原核生物中，研究者［37］用設(shè)計好的DNA模板改造CRISPR/ Cas系統(tǒng)后，將其成功替換肺炎鏈球菌和結(jié)腸埃希菌相應(yīng)基因?qū)崿F(xiàn)了原核基因的定向修飾。CRISPR/ Cas9技術(shù)在原核微生物基因敲除中，有望成為一種新型高效的策略，有著解決其他技術(shù)難題和高效敲除的應(yīng)用前景。

5　其他的基因敲除策略

5.1RNAi技術(shù)

RNA干擾（RNA interference，RNAi）是一種RNA依賴的基因表達沉默現(xiàn)象，即將雙鏈RNA （double stranded RNA，dsRNA）分子導(dǎo)入細(xì)胞，特異性降解細(xì)胞內(nèi)與其同源的靶mRNA，阻止內(nèi)源性目的基因表達，從而實現(xiàn)目的基因的敲除［38］。RNAi普遍存在于真核生物中，可抑制單個基因、整個基因組甚至基因家族的基因表達，具有操作簡便快捷、穿透性強、特異性強和效率高等特點。

目前，該技術(shù)已在真菌、線蟲、果蠅及擬南芥等真核生物中建立基因敲除模型［39］。隨著對原核生物研究的進一步深入，原核細(xì)胞中同樣存在著類似于小分子干擾RNA （small interfering RNA，siRNA）大小的msRNA［40-41］，其功能可能與siRNA相似，可能存在著類似于RNAi的干擾機制，從而應(yīng)用于原核生物的基因敲除。

5.2ZFN技術(shù)和TALEN技術(shù)

ZFN和TALEN技術(shù)分別是第一代和第二代核酸內(nèi)切酶基因編輯工具，其單體均有特異性識別DNA序列的蛋白質(zhì)和一個非特異性核酸內(nèi)切酶FokⅠ單體融合形成，具有在特異區(qū)域結(jié)合并形成二聚體發(fā)揮切斷DNA雙鏈的功能［42］。目前，ZFN最有效的構(gòu)建策略可能是CompoZr方法。該方法效率高，特異性強［43］；而TALEN主要的組裝方法有三種［44］：標(biāo)準(zhǔn)的限制性酶切、連接組裝、Golden Gate組裝和固相組裝。ZFN和TALEN技術(shù)因其靶點在基因組上的序列高度特異性，而且無細(xì)胞類型限制，可以靶向編輯任意基因的特點，并使其在真菌［45］、植物細(xì)胞［46］、斑馬魚［47］、爪蟾［48］、果蠅［49］、動物細(xì)胞［47］及人類干細(xì)胞［8］等基因敲除中均有應(yīng)用；但因細(xì)菌已經(jīng)有上述高效的靶向技術(shù)，ZFN和TALEN技術(shù)在細(xì)菌基因敲除中的應(yīng)用目前尚無報道。

6　小結(jié)

綜上所述，原核微生物基因敲除技術(shù)是遺傳工程研究的重大飛躍之一，為原核微生物的改造以及功能和疫苗研究提供了重要的技術(shù)支撐。隨著分子生物學(xué)的理論發(fā)展和技術(shù)進步，新的基因敲除策略被不斷發(fā)掘應(yīng)用，使基因敲除成為簡單易行的工具；然而，由于生物體的功能調(diào)節(jié)往往是多基因交互作用的結(jié)果，單個基因的敲除往往具有很大的局限性；因此，依賴原核生物的基因組測序結(jié)果，以功能表現(xiàn)為依據(jù)，利用最新的CRISPR/Cas9技術(shù)進行多基因的組合敲除研究，通過雞尾酒式的方法來對原核生物基因進行敲除和過表達，實現(xiàn)目標(biāo)表型的全局優(yōu)化，可能是未來的一個很有潛力的發(fā)展方向［50］。

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（本文采編王晴）

Research progress on the knockout techniques of prokaryotic microorganisms

Yang Yan1，Yang Yingming1，2，Hu Tao1，2. （1. State Key Laboratory of Oral Diseases，Dept. of Conservative Dentistry and Endodontics，West China Hospital of Stomatology，Chengdu 610041，China；2. State Key Laboratory of Oral Diseases，Dept. of Preventive Dentistry，West China Hospital of Stomatology，Sichuan University，Chengdu 610041，China）

Q 756

A

10.7518/gjkq.2016.05.019

2015-09-19；［修回日期］2016-03-26

973計劃前期研究專項計劃（2012CB526707）；國家自然科學(xué)基金（81100746，81400507）

陽燕，博士，Email：yy.0225@163.com

楊英明，講師，博士，Email：lyra-hscn@163.com