基因分型技術在院內(nèi)感染銅綠假單胞菌中的應用研究進展*

張 偉，徐益恒 綜述，邰文琳 校審

(昆明醫(yī)科大學第二附屬醫(yī)院檢驗科,昆明 650101)

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·綜 述·

基因分型技術在院內(nèi)感染銅綠假單胞菌中的應用研究進展*

張 偉，徐益恒 綜述，邰文琳△校審

(昆明醫(yī)科大學第二附屬醫(yī)院檢驗科,昆明 650101)

銅綠假單胞菌； 基因分型； 院內(nèi)感染

銅綠假單胞菌是世界范圍內(nèi)醫(yī)院獲得性感染的重要病原菌。對引起疾病的病原菌基因分型的傳染源確定、阻止病原菌的傳播、潛在病原菌危險的控制和醫(yī)院耐藥監(jiān)測有很重要的作用。細菌分型作為分子流行病學研究調查的主要研究內(nèi)容,其結果的準確性依賴于分型方法是否穩(wěn)定可靠、準確[1]。細菌分型的方法包括依靠生理、生化特征的表型分型法和近年來流行使用的基因分型法。表型分型方法是根據(jù)細菌的生理、生化等表型特征進行分類包括噬菌體分型法、血清型法、營養(yǎng)分型法和藥物敏感試驗等，這些分型的方法由于受到細菌本身復雜因素及方法的敏感性因素影響，往往就無法有效對不同的菌株進行區(qū)分，因此其應用受到很大限制。運用分子生物學方法檢測細菌基因型來鑒別菌株的基因分型法，是1980年起逐漸被引入微生物鑒定領域，成為目前較主流的流行病學研究工具，在基因組水平對細菌進行鑒定與分類，與表型分型相比更加細化，對院內(nèi)引起感染的銅綠假單胞菌近親緣性，即克隆性菌株鑒定有重要意義，從根本上確定菌株遺傳基礎的相互聯(lián)系和變異，為流行病調查工作中確定菌株間的遺傳親緣關系等方面提供更為有力的實驗室證據(jù)[2]。基因分型法目前運用較多的有：重復序列聚合酶鏈反應(PCR)、隨機擴增多態(tài)性DNA(RAPD)、多位點可變數(shù)目串聯(lián)重復序列分析(VNTR)、限制性片段長度多態(tài)性PCR(RFLP)、多位點序列分型(MLST)、脈沖場凝膠電泳(PFGE)。分型方法是在微生物學、遺傳學、流行病學等交叉學科一系列研究中的工具，選擇合適的方法，有效監(jiān)測院內(nèi)病原菌的分子流行病學變化，如此研究預期和最終目的才能達到?，F(xiàn)就目前常用于銅綠假單胞菌基因分型的技術進行簡要介紹。

1 重復序列PCR

重復序列PCR是采用特定引物對細菌基因組重復序列的DNA進行擴增，高度保守的重復序列之間的不同區(qū)域可表現(xiàn)不同的圖譜，然后經(jīng)凝膠電泳分析其多態(tài)性。目前，運用最多的是腸桿菌基因間重復共有序列(ERIC)PCR，應用于細菌分類和菌種鑒別。ERIC是最常用的一類引物，長度為126 bp，位于染色體非編碼轉錄區(qū)，ERIC-PCR分辨效果好，可重復性好，特別適用于基因型的辨別。PFGE目前被認為是細菌基因分型技術的“金標準”[3]。孫晶等[4]在對銅綠假單胞菌ERIC-PCR和PFGE方法學比較分析發(fā)現(xiàn)，兩種方法的符合率近90%，在ERIC-PCR方法重復5次的結果相似度高于75%；Han等[5]報道對銅綠假單胞菌研究中發(fā)現(xiàn)，在同一血清型中采用ERIC-PCR分出多個不同型別銅綠假單胞菌，采用ERIC-PCR分辨能力和重復性與PFGE很相近，均較血清分型方法較好，但ERIC-PCR用時短，操作簡單，成本低，值得在流行分子病學研究中推廣。在院內(nèi)感染耐藥監(jiān)測研究中，張勇等[6]對75株耐碳青霉烯類銅綠假單胞菌ERIC-PCR同源性分析，結果顯示分型為8種，但以A、B型為主，分別占34.7%和22.7%，表明耐碳青霉烯類銅綠假單胞菌在院內(nèi)以克隆株傳播，ERIC-PCR是銅綠假單胞菌同源性分析有效工具，以其多種優(yōu)點在耐藥監(jiān)測和預防等方面有明顯的優(yōu)勢[7]。盡管ERIC-PCR有很多優(yōu)勢，但在近緣菌株分析中分辨力還有待加強，且此方法對軟件的要求和數(shù)據(jù)分析能力較高，普通實驗室還難普及[8]。

2 RAPD

RAPD是20世紀90年代末發(fā)展起來的一種新方法，該法使得對非血清型菌株從基因多態(tài)性的水平進行分型的鑒定成為可能[9-10]。以基因組DNA為模板，以單個人工合成的隨機多態(tài)核苷酸序列(通常為10個堿基對)為引物，在熱穩(wěn)定的DNA 聚合酶(Taq酶)作用下，進行PCR擴增。這種方法可對物種基因背景不清楚的情況下對基因組DNA水平進行研究[11]。目前研究銅綠假單胞菌的特點主要在遺傳學分型、抗生素表型和血清學分型，主要是評價多種分離株關系的分型能力[12]。近來出現(xiàn)的RAPD-PCR方法對銅綠假單胞菌的多種細菌分型則成為可靠的手段，與傳統(tǒng)的對細菌鑒定分型方法比較，具有簡便、快速、靈敏度高，不需要已知基因組序列的優(yōu)勢[11-12]。RAPD技術是在基因水平上對菌株間差異進行研究，最終可以表現(xiàn)出克隆間的差別和種系發(fā)育中的相互關系[13]。相異指數(shù)是RAPD技術中重要的指標，是指對2個分離株進行比較，相異指數(shù)越小，相似性越大。在聶道海等[14]報道中，采用Phylip和TREEview等軟件對RAPD指紋圖譜相異指數(shù)分析。患者不同時間的分離株相異指數(shù)最小為零，說明有可能克隆菌株。最大為89.47%，說明兩次感染來源不同。同一克隆株于空間上分布集中的趨勢,提示可能存在通過某一未識別的共同傳播源傳播同一病區(qū)來自不同患者的銅綠假單胞菌顯示相同的RAPD 型別,提供了醫(yī)院感染局部流行的證據(jù)。RAPD分型和耐藥譜分型比較研究中，RAPD分型譜相同，其耐藥譜也大致一樣，耐藥譜分型一致的，其RAPD分型可不同，說明RAPD分型譜和藥譜分型遺傳關系有一定的差異。所以，耐藥譜分型可作為RAPD分型進一步補充分型。雖然RAPD技術簡便、對試驗條件要求低的廣泛使用，但研究人員也慢慢意識該技術存在試驗條件影響大、可重復性低等一系列問題。國內(nèi)外仍有很多實驗采用該方法對菌株進行流行病學研究和分型判斷[12]。

3 VNTR

VNTR是在原核和真核生物基因中一種重復DNA小序列，為10到幾百核苷酸，以首尾相連的方式串聯(lián)一起，拷貝數(shù)在10～1 000的PCR技術[15]。多態(tài)性指數(shù)(DI)是VNTR分型能力的一個指標，DI值低，說明分型能力不好，特別是對近緣性菌株區(qū)分能力不足，DI值高，可導致非同源性相似。DI值在0.48～0.89，即可避免非同源性相似性，又有分型能力。近年來已有國內(nèi)外關于VNTR對銅綠假單胞菌基因分型的報道[16]。李艷君等[17]在銅綠假單胞菌院內(nèi)感染溯源性研究中采用VNTR方法，建立DI分布適中的12個VNTR新篩選位點方法，對98株銅綠假單胞菌進行分型，共分類為5群，88個基因型，認為同病房分離菌株有一定同源性。MLVA是基于VNTR方法發(fā)展起來的新技術。近來有研究以銅綠假單胞菌的全基因組序列為參考的多個VNTR 位點的MLVA 方法[18]。隨后有人在這基礎上建立15個VNTR位點的MLVA方法使分型更簡單、便捷，是目前MLVA對銅綠假單胞菌基因分型的主要研究方法[19]。不同的銅綠假單胞菌VNTR位點的數(shù)目數(shù)字化后，在數(shù)據(jù)庫中比對，菌株的差異就能用數(shù)字表達[20]。盡管采用數(shù)量不同的位點，都能進行分型，且隨著技術的進步分型能力越來好，但缺點是數(shù)量有限，而且在基因組上分布不均勻，這就極大限制其在基因定位中的應用，VNTR也存在實驗操作繁瑣、檢測時間長、成本高的不足。

4 RFLP

RFLP是指用不同的限制性內(nèi)切酶對DNA分子處理后，通過瓊脂糖凝膠電泳對DNA片段進行分析。國外報道，RFLP也可以篩選出銅綠假單胞菌的超廣譜β-內(nèi)酰胺酶(ESBLs)基因，在流行病學基因研究、檢測新的變異有重要意義[21]。RFLP己被用于構建基因組遺傳圖譜、基因定位、生物進化和分類的研究。由于只對單拷貝基因組序列進行鑒定，且需要多種內(nèi)切酶及探針，操作步驟繁瑣，但RFLP較之RAPD的優(yōu)勢是突變類型可以確定是由堿基突變或倒位、還是由插入缺失造成的。在RFLP技術基礎上發(fā)展起來的擴增片段長度多態(tài)性分析(AFLP)是一種新的標記技術，是先采用限制性內(nèi)切酶對基因組DNA進行切割，然后再將切割后的雙鏈接到DNA的末端，使鄰近的限制性內(nèi)切酶位點和短的接頭序列作為結合位點。它擁有了RFLP的高效性和可靠性，但目前這一技術使用還不廣泛。

5 MLST

MLST方法近年來成為流行的基因分型方法，通過采取測定菌株多個管家基因的DNA序列進行分型，管家基因幾乎不會發(fā)生遺傳漂變而存在于所有菌株中，所以采用管家基因進行MLST分型[22]。測定7個管家基因(acsA、aroE、guaA、mutL、nuoD、ppsA 和trpE)500 bp左右DNA序列片段代表基因組的分子多樣性，每個管家基因的等位基因由發(fā)現(xiàn)和遞呈的時間順序分配，每類菌株所有的等位基因號按照規(guī)定順序排列成為等位基因譜，也叫序列型(ST)[23]。此種方法不需要培養(yǎng)病原菌，可直接從標本中進行擴增，獲得等位基因圖譜，有群體遺傳學分析的功能，且能夠準確提供菌種評估的信息，比傳統(tǒng)的免疫學方法更可靠和準確，自從Gomila等[24]運用此方法分析銅綠假單胞菌的遺傳多樣性，現(xiàn)MLST數(shù)據(jù)庫已建立且不斷完善，結果的可比性高，適合國際實驗室間的數(shù)據(jù)進行比較，可以對局部感染爆發(fā)的評估和菌群結果的評價。目前運用MLST分型對銅綠假單胞菌的研究越來越多。研究稱銅綠假單胞菌的遺傳背景是多樣性的。國外報道銅綠假單胞菌以ST235型最為常見，但也伴其他ST型[25]。銅綠假單胞菌容易引起暴發(fā)流行，在西班牙2007～2008年暴發(fā)兩起感染，是ST235所致[26]。韓國也有此型的多重耐藥菌株傳播。雖然MLST與PFGE和MLVA比較分辨力一般，但其結果可在全世界進行比較，發(fā)現(xiàn)傳播現(xiàn)象和分子流行病學研究，受到研究者的青睞。

6 PFGE

PFGE是采用限制性內(nèi)切酶(SpeⅠ酶)將DNA識別并內(nèi)切成若干片段，再脈沖場凝膠電泳，電場不斷在兩種方向(有一定夾角，而不是相反的兩個方向)變動，來分離大小從10 kb至10 Mb的DNA分子。因其分辨率高，重復性好被公認為銅綠假單胞菌基因分型的金標準[27]。其結果可作為控制醫(yī)院感染的重要基礎。能幫助臨床工作者發(fā)現(xiàn)潛在的危險因素，進而及時切斷流行菌株的來源和傳播途徑。對不同患者分離的同一病原菌進行親緣性分析，是判斷醫(yī)院是否存在散在性感染和暴發(fā)流行性感染的有效工具。自1984年報道了脈沖場電泳的方法以來，目前已得到全面發(fā)展，各種條件得到優(yōu)化，PulseNet細菌分子分型網(wǎng)絡提供技術下載，且Tenover等研究了結果的解釋標準，統(tǒng)一技術對結果解釋的影響，利于PFGE技術的運用，但是操作相對耗費時間和精力且檢測通量小，導致其不能對大量菌株進行研究，是其應用的不足。

7 小 結

銅綠假單胞菌在院內(nèi)感染由于濫用抗菌藥物從而導致的變異，容易引起院內(nèi)的暴發(fā)流行，表型分型的不足采用基因分型方法彌補，但基因分型方法也存在不足，特別是不能解決院內(nèi)銅綠假單胞菌感染暴發(fā)流行的實時在線分析能力，也沒有統(tǒng)一的標準來對分型方法進行指導，導致各種方法均有優(yōu)缺點。理想的分型方法有以下特征：對不同患者同一菌株的分型能力強且操作簡便、費用低；對同一患者不同時期同一菌株高分辨能力，即將同一克隆或遺傳相近的菌株分辨出來；最重要的一點是具有良好的復現(xiàn)性。但目前的技術還不能做到。

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云南省衛(wèi)生科技計劃項目(2014NS114)；昆明醫(yī)科大學研究生創(chuàng)新基金項目(2015S31)。

10.3969/j.issn.1673-4130.2016.23.032

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2016-05-28

2016-08-18)

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