DNA指紋圖譜技術(shù)及其在甘蔗育種上的應(yīng)用

吳建濤，王勤南，周 峰，謝 靜，許環(huán)映，常海龍(廣州甘蔗糖業(yè)研究所 廣東省甘蔗改良與生物煉制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東廣州5036；農(nóng)業(yè)部廣東甘蔗種質(zhì)資源與利用科學(xué)觀測實(shí)驗(yàn)站，海南三亞5705)

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DNA指紋圖譜技術(shù)及其在甘蔗育種上的應(yīng)用

吳建濤1,2，王勤南1,2，周 峰1,2，謝 靜1,2，許環(huán)映1,2，常海龍1,2
(1廣州甘蔗糖業(yè)研究所 廣東省甘蔗改良與生物煉制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東廣州510316；2農(nóng)業(yè)部廣東甘蔗種質(zhì)資源與利用科學(xué)觀測實(shí)驗(yàn)站，海南三亞572025)

摘 要：隨著分子標(biāo)記的不斷開發(fā)和利用，DNA指紋圖譜技術(shù)得到了快速發(fā)展。本文簡要闡述了幾種常見的構(gòu)建DNA指紋圖譜分子標(biāo)記方法的基本原理、優(yōu)缺點(diǎn)及其在構(gòu)建不同植物DNA指紋圖譜中的應(yīng)用，總結(jié)了構(gòu)建指紋圖譜的指紋代碼的5種方法和在甘蔗育種中應(yīng)用，并對DNA指紋圖譜在甘蔗育種應(yīng)用中存在問題與展望進(jìn)行了簡單的討論。

關(guān)鍵詞：DNA指紋圖譜；分子標(biāo)記；甘蔗育種；應(yīng)用

0 引言

DNA指紋圖譜技術(shù)(DNA Fingerprinting)是1984年由英國科學(xué)家Jeffreys開發(fā)出的。近年來，隨著生物技術(shù)的發(fā)展，新的分子標(biāo)記不斷被開發(fā)和利用，建立在分子標(biāo)記技術(shù)上的DNA指紋圖譜技術(shù)也得到了快速發(fā)展，利用分子標(biāo)記構(gòu)建的DNA指紋圖譜可直接反映甘蔗的遺傳物質(zhì)在DNA分子水平上的差異，具有較高的多態(tài)性和個(gè)體特異性，且不受環(huán)境和生長階段影響，能鑒定形態(tài)標(biāo)記所難以鑒定的個(gè)體[1]。近年來，DNA指紋圖譜技術(shù)廣泛應(yīng)用于作物品種間的親緣關(guān)系分析和分子身份證繪制研究。

本文就構(gòu)建DNA指紋圖譜的分子標(biāo)記類型、指紋代碼及在甘蔗育種中的應(yīng)用作簡要綜述，以期為DNA指紋圖譜技術(shù)在甘蔗育種上的應(yīng)用研究提供參考。

1 構(gòu)建DNA指紋圖譜的分子標(biāo)記

DNA分子標(biāo)記是指能反映生物個(gè)體或種群間基因組中某些差異特征的DNA片段。目前，經(jīng)過幾十年的發(fā)展，現(xiàn)在的DNA標(biāo)記技術(shù)已有幾十種，主要有以下幾大類：第1類以Southern雜交為基礎(chǔ)，如限制性片段長度多態(tài)性(Restriction Fragment Length Polymorphism, RFLP)、原位雜交(In Situ Hybridization, ISH)；第2類以PCR技術(shù)為基礎(chǔ)，如隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性DNA(Random Amplified Polymorphic DNA, RAPD)、任意引物PCR(Arbitrary Primer-PCR, AP-PCR)、DNA指紋技術(shù)(DNA Fingerprinting, DAF)、擴(kuò)增片段長度多態(tài)性(Amplified Fragment Length Polymorphism, AFLP)、相關(guān)序列擴(kuò)增多態(tài)性(Sequence-Related Amplified Polymorphism, SRAP)、靶位區(qū)域擴(kuò)增多態(tài)性(Target Region Amplified Polymorphism, TRAP)、插入/缺失多態(tài)性(Insertion/deletion Polymorphism, Indel或I/D)；第3類以重復(fù)序列為基礎(chǔ)，如簡單重復(fù)序列(Simple Sequence Repeat, SSR)、簡單序列重復(fù)間擴(kuò)增多態(tài)性(Inter-simple Sequence Repeat, ISSR)；第4類以mRNA為基礎(chǔ)，如逆轉(zhuǎn)錄PCR(Reverse Transcription PCR, RT-PCR)、表達(dá)序列標(biāo)簽(Expressed Sequence Tag, EST)；第5類以單核苷酸多態(tài)性為基礎(chǔ)，如單核苷酸多態(tài)性(Single Nucleotide Polymorphism, SNP)。

本文簡要介紹用于構(gòu)建DNA指紋圖譜的一些分子標(biāo)記，如RFLP、RAPD、AFLP、SSR、ISSR、SRAP和SNP等。

1.1 限制性片段長度多態(tài)性(RFLP)

RFLP是以Southern雜交為基礎(chǔ)的第1代遺傳標(biāo)記，1975年由美國科學(xué)家Grodzicker等[2]創(chuàng)立的，其基本原理是利用特定的限制性內(nèi)切酶將基因組DNA進(jìn)行酶切，利用凝膠電泳分析所形成的不同的DNA片段，經(jīng)轉(zhuǎn)膜和Southern雜交，分析DNA多態(tài)性。RFLP標(biāo)記是共顯性標(biāo)記，呈孟德爾遺傳，不受環(huán)境條件的影響；檢測可靠性高，重復(fù)性好。目前，RFLP標(biāo)記已應(yīng)用于家蠶[3]、細(xì)菌[4]等生物的指紋圖譜構(gòu)建。但是，RFLP的技術(shù)要求高，DNA需要量大，步驟較多，檢測時(shí)間長，成本高，需使用放射性同位素，難以大規(guī)模推廣應(yīng)用。

1.2 隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性DNA(RAPD)

RAPD是1990年由美國杜邦公司科學(xué)家Williams等[5]和加利福尼亞生物研究所Welsh等[6]發(fā)明的一種分子標(biāo)記技術(shù)，它以基因組DNA為模板，以一個(gè)隨機(jī)多態(tài)核苷酸序列(8～10 bp)為引物，經(jīng)PCR擴(kuò)增產(chǎn)生不同的DNA片段，通過瓊脂糖或聚丙烯酰胺電泳分離檢測擴(kuò)增DNA多態(tài)性。RAPD技術(shù)DNA用量少，顯性遺傳，簡單快速，引物設(shè)計(jì)隨機(jī)，不使用放射性同位素，可對未知序列的基因組進(jìn)行多態(tài)性分析，進(jìn)而構(gòu)建指紋圖譜。目前，RAPD已應(yīng)用于茶樹[7]、鳶尾[8]等植物DNA指紋圖譜構(gòu)建。但是，RAPD技術(shù)穩(wěn)定性差、不同物種效果不同、不能鑒定雜合子、信息量較少。

1.3 擴(kuò)增片段長度多態(tài)性(AFLP)

AFLP是1993年由荷蘭科學(xué)家Zabeau等[9]發(fā)明的，其基本原理是用2種限制性內(nèi)切酶對基因組DNA進(jìn)行酶切，然后再將特定的雙鏈接頭連接在酶切片段的兩側(cè)，形成帶接頭的特異性片段，以此為模板，以接頭序列和相鄰的限制性位點(diǎn)序列為基礎(chǔ)設(shè)計(jì)引物進(jìn)行擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)放射性同位素標(biāo)記、聚丙烯酰胺凝膠電泳分離后檢測DNA多態(tài)性。AFLP結(jié)合了RFLP和PCR技術(shù)特點(diǎn)，多態(tài)性豐富，結(jié)果穩(wěn)定可靠，重復(fù)性好，是典型的孟德爾遺傳，所需DNA量少，可以不知基因序列的情況下進(jìn)行研究，在一次單個(gè)反應(yīng)能檢測到大量的片段，可以分析基因組較大的作物，適合構(gòu)建復(fù)雜基因組植物的指紋圖譜。目前，己應(yīng)用于水稻[10]、玉米[11]、棉花[12]等作物的指紋圖譜構(gòu)建。但是，AFLP是顯性標(biāo)記，只顯示擴(kuò)展片段的有或無，容易出現(xiàn)假陽性帶、技術(shù)復(fù)雜、成本高。

1.4 簡單重復(fù)序列(SSR)

SSR又稱微衛(wèi)星DNA(Microsatallite DNA)，是1982年由美國人Hamade等[13]創(chuàng)立的基于PCR的第2代分子標(biāo)記。SSR是一種真核生物基因組中普遍存在的重復(fù)序列，一般由1～6個(gè)堿基組成，重復(fù)次數(shù)在不同物種或同一物種不同基因型之間是高度可變的，兩端是保守的單拷貝序列，可用于設(shè)計(jì)特異引物擴(kuò)增中間的重復(fù)序列，通過瓊脂糖電泳或聚丙烯酰胺凝膠電泳分析DNA多態(tài)性。SSR具有RFLP的優(yōu)點(diǎn)且不需要使用放射性同位素，同時(shí)比RAPD重復(fù)性和穩(wěn)定性高。SSR標(biāo)記數(shù)量豐富，多態(tài)性高，呈共顯性，可鑒別雜合子和純合子，所需DNA量少，在構(gòu)建DNA指紋圖譜方面顯示了獨(dú)特的優(yōu)越性。國際植物新品種權(quán)保護(hù)聯(lián)盟(UPOV)在BMT分子測試指南中，已將構(gòu)建DNA指紋數(shù)據(jù)庫的標(biāo)記方法確定為SSR和SNP[14]，其中SSR標(biāo)記因其技術(shù)比較成熟，成為當(dāng)前各個(gè)作物建庫的首選標(biāo)記。不同研究者利用SSR標(biāo)記構(gòu)建了水稻[15]、玉米[16]、柑橘[17]等作物的指紋圖譜。然而，SSR技術(shù)必須知道重復(fù)序列兩端的單拷貝序列才能設(shè)計(jì)特異引物用于擴(kuò)展檢測，因此其開發(fā)費(fèi)用較高。

1.5 簡單序列重復(fù)間擴(kuò)增多態(tài)性(ISSR)

ISSR是在SSR基礎(chǔ)上發(fā)展的一種新型分子標(biāo)記，1994年由加拿大蒙特利爾大學(xué)的Zietkiewicz 等[18]提出。ISSR標(biāo)記以基因組中SSR本身為引物，在SSR序列的3’或5’端加錨2～4個(gè)隨機(jī)核苷酸，利用錨定引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，通過瓊脂糖電泳或聚丙烯酰胺凝膠電泳分離DNA片段。ISSR結(jié)合了RAPD和SSR的優(yōu)點(diǎn)，成本低，DNA用量少；試驗(yàn)操作簡單、快速、高效；遺傳多態(tài)性高，重復(fù)性好；顯性標(biāo)記，呈孟德爾式遺傳；不需要知道任何靶標(biāo)序列的SSR背景信息。目前，利用ISSR構(gòu)建了水稻[19]、玉米[20]、小菊[21]等作物指紋圖譜。但是它與RAPD相似，不能區(qū)分顯性純合基因型和雜合基因型。

1.6 相關(guān)序列擴(kuò)增多態(tài)性(SRAP)

SRAP是2001年由美國加州大學(xué)科學(xué)家Li等[22]開發(fā)的，其基本原理是根據(jù)基因外顯子GC含量豐富而啟動(dòng)子和內(nèi)含子AT含量豐富的特點(diǎn)設(shè)計(jì)引物，對基因組開放閱讀框(Open Reading Frames, ORFs)進(jìn)行擴(kuò)增，上下游引物分別對外顯子區(qū)域和內(nèi)含子、啟動(dòng)子區(qū)域進(jìn)行特異擴(kuò)增，因不同個(gè)體或物種的內(nèi)含子、啟動(dòng)子與間隔區(qū)長度不同產(chǎn)生多態(tài)性。SRAP分布均勻，多態(tài)性強(qiáng)，DNA需要量少，共顯性，簡單且花費(fèi)少。目前已成功地應(yīng)用于多種作物的指紋圖譜構(gòu)建，如國蘭[23]、南瓜[24]等。但是，SRAP是對ORFs進(jìn)行擴(kuò)增，對著絲粒附近以及端粒的擴(kuò)增會(huì)較少。同時(shí)，沒有利用擴(kuò)增區(qū)域序列的任何信息，產(chǎn)生的分子標(biāo)記是隨機(jī)地分布在染色體上的。

1.7 單核苷酸多態(tài)性(SNP)

1996年，美國學(xué)者Lander[25]提出SNP為新一代分子標(biāo)記，SNP是指基因組單個(gè)核苷酸(A，T，C，G)的置換或顛換所引起的DNA序列多態(tài)性，通常所說的SNP不包括堿基的插入、缺失以及重復(fù)序列拷貝數(shù)的變化[26]。SNP是繼RFLP和SSR之后發(fā)展起來的第3代標(biāo)記技術(shù)，具有以下優(yōu)點(diǎn)：數(shù)量多，分布廣泛；遺傳穩(wěn)定性高；二態(tài)性，非此即彼，易于快速且高通量地進(jìn)行基因型分型。SNP是國際植物新品種權(quán)保護(hù)聯(lián)盟(UPOV)BMT分子測試指南中構(gòu)建DNA指紋數(shù)據(jù)庫的推薦標(biāo)記之一。SNP已在油菜[27]、甜菜[28]等作物指紋圖譜構(gòu)建中使用。利用DNA芯片技術(shù)是檢測SNP的最佳方法，隨著DNA芯片技術(shù)的發(fā)展，SNP有望成為最重要最有效的分子標(biāo)記技術(shù)。但是，制作SNP圖譜要求個(gè)體多，成本高；功能難以確定；涉及專利問題。

2 構(gòu)建指紋圖譜的指紋代碼方法

2.1 標(biāo)記擴(kuò)增圖譜中位點(diǎn)條帶直接轉(zhuǎn)化為“0, 1”數(shù)字串指紋

該方法是根據(jù)每個(gè)品種DNA擴(kuò)增圖譜中標(biāo)記位點(diǎn)條帶的有無或缺失用0和1進(jìn)行數(shù)字化統(tǒng)計(jì)，結(jié)果為由0和1排列形成的字符串，構(gòu)成一個(gè)品種的數(shù)字指紋圖譜。如繆恒彬等[21]采用此方法構(gòu)建了25個(gè)小菊品種的ISSR指紋圖譜，張婉等[29]利用該方法構(gòu)建了70個(gè)白菜品種的SSR指紋圖譜數(shù)據(jù)庫。該方法較為簡單，但數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)工作量較大，并且對不同大小條帶的統(tǒng)計(jì)存在誤差，對未知樣品進(jìn)行鑒定時(shí)需要逐一對比“0, 1”數(shù)字串，比較麻煩。

2.2 標(biāo)記擴(kuò)增特征帶、特異譜帶類型和多引物組合，共同組成“0, 1”數(shù)字串指紋

該方法是統(tǒng)計(jì)的譜帶結(jié)果，篩選具有特征帶的特異標(biāo)記和擴(kuò)增產(chǎn)物多態(tài)性好、產(chǎn)生豐富的譜帶類型，然后再利用不同的引物擴(kuò)增產(chǎn)生的譜帶組合，確定核心引物，將核心引物的特征譜帶轉(zhuǎn)化為“0, 1”數(shù)字串指紋。如李雪蓮等[30]應(yīng)用該法構(gòu)建了23個(gè)兩用桃品種(系)的指紋圖譜；匡猛等[31]采用該方法構(gòu)建了32份棉花主栽品種的指紋圖譜。該方法構(gòu)建圖譜、鑒定未知樣品均較簡單，但其需要較多的引物才能取得足夠的特異位點(diǎn)，試驗(yàn)成本高，工作量大。

2.3 十進(jìn)制數(shù)字串條形碼

該方法根據(jù)電泳結(jié)果采用“0, 1”系統(tǒng)記錄譜帶位置，將每對引物在品種間擴(kuò)增得到“0, 1”(二進(jìn)制)數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)化成十進(jìn)制數(shù)據(jù)，該十進(jìn)制數(shù)據(jù)代表每個(gè)引物擴(kuò)增的結(jié)果，核心引物組合的十進(jìn)制數(shù)字串作為每一個(gè)品種的數(shù)字指紋。如聶新輝等[32]利用該方法構(gòu)建了51個(gè)新陸早系列常規(guī)棉花新品種的DNA指紋圖譜；潘兆娥等[33]采用此法構(gòu)建了中棉所48的數(shù)字指紋圖譜。該方法實(shí)際上是本文2.1小節(jié)所述方法的改進(jìn)，方便數(shù)據(jù)觀察和比對，但統(tǒng)計(jì)條帶時(shí)較為麻煩。

2.4 標(biāo)記字母編號和分子量相結(jié)合編碼

該方法首先統(tǒng)計(jì)每份材料引物擴(kuò)增條帶分子量大小，再將引物進(jìn)行編號，如果一份材料經(jīng)同一引物擴(kuò)增同時(shí)出現(xiàn)多條條帶，則用“-”連接，無條帶則為0，每個(gè)材料的DNA經(jīng)不同的引物擴(kuò)增后會(huì)形成由字母和數(shù)字組成的一系列帶型編號，便形成了該材料的指紋圖譜代碼。如宋海斌等[34]應(yīng)用該方法構(gòu)建了105份甜瓜品種(系)的指紋圖譜庫；王靜毅等[35]采用該法繪制了56份香蕉種質(zhì)的指紋圖譜。該方法也是對本文2.1小節(jié)所述方法的改進(jìn)，方便記錄和數(shù)據(jù)參考利用，但仍需繁瑣的統(tǒng)計(jì)條帶。

2.5 指紋圖譜分析軟件自動(dòng)編碼

該方法是首先將實(shí)驗(yàn)中獲得的電泳圖轉(zhuǎn)化為由“0, 1”描述的數(shù)據(jù)，構(gòu)建二元數(shù)據(jù)矩陣，然后導(dǎo)入DNA指紋圖譜分析軟件進(jìn)行多態(tài)性與特異性分析，獲得個(gè)體的指紋圖譜。劉娟等[36]應(yīng)用該方法構(gòu)建了48個(gè)新疆杏品種(系)指紋圖譜；徐宗大等[37]利用該方法構(gòu)建了50個(gè)玫瑰種質(zhì)的分子指紋圖譜。該方法分析快速準(zhǔn)確，減少了指紋圖譜繪制時(shí)間，降低了人工觀察可能產(chǎn)生的誤差，但需要開發(fā)軟件。

3 DNA指紋圖譜在甘蔗育種中的應(yīng)用

3.1 甘蔗品種鑒定和真實(shí)性檢測

目前，在中國種植的主要甘蔗栽培品種遺傳胞質(zhì)基本來自“甘蔗高貴化育種”過程的后代，品種間生物學(xué)特性差異較小。再加上骨干親本的重復(fù)使用，新基因資源的缺乏，甘蔗品種間的遺傳差異越來越小，使得單純依據(jù)形態(tài)性狀進(jìn)行品種田間檢驗(yàn)越來越困難。利用分子標(biāo)記構(gòu)建甘蔗DNA指紋圖譜為甘蔗品種鑒定和真實(shí)性檢測提供了一種有效的手段，不少學(xué)者利用分子標(biāo)記構(gòu)建指紋圖譜對甘蔗品種進(jìn)行了鑒定，Piperidis等[38]利用SSR標(biāo)記構(gòu)建了180個(gè)甘蔗品種的指紋圖譜庫并應(yīng)用于品種鑒定；Da Silva[39]等利用SSR標(biāo)記構(gòu)建指紋圖譜對3個(gè)甘蔗品種(系)進(jìn)行了鑒定；劉新龍等[40]從120對SSR標(biāo)記中篩選出8對核心引物，構(gòu)建了27份云南自育品種DNA指紋圖譜，并用10個(gè)甘蔗主栽品種對3個(gè)高效引物組合進(jìn)行驗(yàn)證。

3.2 甘蔗品種親緣關(guān)系和分類研究

現(xiàn)代栽培甘蔗品種是遺傳背景非常復(fù)雜的多倍體或非整倍體，均由種間雜交育成。甘蔗親本系譜在一定程度上能反映品種之間的親緣關(guān)系，是雜交組合選配的重要依據(jù)之一，但由于自交、串粉等因素，存在一定的局限性?；诜肿铀降挠H緣關(guān)系較基于系譜的親緣關(guān)系具有更高的可靠性[41-42]。根據(jù)品種間DNA指紋圖譜的差異程度可判斷品種間親緣關(guān)系的遠(yuǎn)近和測量品種間遺傳距離，進(jìn)行系譜分析，并可據(jù)此進(jìn)行分類研究。一些研究人員利用甘蔗DNA指紋圖譜對甘蔗種質(zhì)進(jìn)行了親緣關(guān)系和分類研究，莊南生等[43]采用AFLP構(gòu)建了54份種質(zhì)(14份祖親種、40份栽培品種或品系)的指紋圖譜，并分析了不同種質(zhì)的相似系數(shù)和親緣關(guān)系，探討了甘蔗種質(zhì)系譜與聚類分析的關(guān)系以及斑茅種的分類地位問題；王英等[44]采用ISSR分子標(biāo)記技術(shù)構(gòu)建了96份甘蔗種質(zhì)(39份祖親種、57份栽培品種或品系)的ISSR指紋圖譜，以及不同種質(zhì)的親緣關(guān)系；Pan等[45]利用21個(gè)SSR標(biāo)記對116個(gè)甘蔗品種進(jìn)行了遺傳多樣性分析和親緣關(guān)系分析；鄭益鳳[41]利用SSR熒光標(biāo)記構(gòu)建了116個(gè)甘蔗常用親本、創(chuàng)新親本或新親本的DNA指紋圖譜，并對這些種質(zhì)材料進(jìn)行了聚類分析、主成分分析和遺傳相似性分析，獲得了這些甘蔗親本的遺傳多樣性信息；王英等[46]采用RAMP分子標(biāo)記技術(shù)對80份甘蔗種質(zhì)(32份祖親種、48份栽培品種或品系)的遺傳基礎(chǔ)進(jìn)行了分析，構(gòu)建了甘蔗80份種質(zhì)的RAMP指紋圖譜，并分析了不同種質(zhì)的遺傳關(guān)系，同時(shí)在栽培種中檢測到部分熱帶種、野生種及斑茅種特異片段，初步證明了外源基因已導(dǎo)入甘蔗栽培種中；姚春雪等[47]利用SSR技術(shù)構(gòu)建了67份甘蔗與蔗茅雜交不同世代的指紋圖譜，討論了品種之間同源關(guān)系與聚類分析；昝逢剛等[48]利用AFLP技術(shù)分析了98份甘蔗種質(zhì)遺傳多樣性及親緣關(guān)系。

4 存在問題及展望

DNA指紋圖譜技術(shù)在作物品種資源中己得到廣泛地應(yīng)用，但甘蔗基因組龐大，結(jié)構(gòu)復(fù)雜，甘蔗分子育種研究進(jìn)展較為緩慢[49]，阻礙了DNA指紋圖譜在甘蔗種質(zhì)資源中的應(yīng)用。隨著DNA標(biāo)記技術(shù)的發(fā)展，甘蔗種質(zhì)遺傳多樣性分析、DNA指紋圖譜構(gòu)建、分子標(biāo)記鑒定品種等也會(huì)得到快速發(fā)展。目前，大多數(shù)DNA指紋圖譜檢測技術(shù)仍比較煩瑣，限制了該技術(shù)在育種中的大規(guī)模應(yīng)用。隨著分子生物學(xué)新儀器的研制和生物信息學(xué)的應(yīng)用，一些研究單位研發(fā)了自動(dòng)化程度的檢測儀器，開發(fā)了指紋圖譜分析軟件，從加樣到數(shù)據(jù)分析全過程實(shí)現(xiàn)人工智能控制，大大提高了DNA指紋圖譜檢測的效率與準(zhǔn)確性[1]。

甘蔗是我國主要的糖料作物，甘蔗蔗糖產(chǎn)量約占中國食糖總量的92%，我國甘蔗品種遺傳基礎(chǔ)極為狹窄，嚴(yán)重制約甘蔗產(chǎn)業(yè)的進(jìn)一步發(fā)展[50]。同時(shí)，中國在甘蔗品種資源生產(chǎn)和經(jīng)營方面尚不規(guī)范，品種引種混亂或品種造假的現(xiàn)象時(shí)有發(fā)生。構(gòu)建甘蔗品種DNA指紋圖譜能夠準(zhǔn)確和全面地了解中國甘蔗品種的遺傳多樣性，為針對性地開展親本引進(jìn)、創(chuàng)新和配置雜交組合提供重要參考，促進(jìn)甘蔗育種發(fā)展；通過構(gòu)建中國甘蔗品種身份證，為種質(zhì)資源的保護(hù)、完善系譜、品種鑒定提供支撐。

參考文獻(xiàn)

[1] 王忠華. DNA指紋圖譜技術(shù)及其在作物品種資源中的應(yīng)用[J]. 分子植物育種，2006，4(3)：425-430.

[2] GRODZICKER T, WILLIAMS J, SHARP P, et al. Physical mapping of temperature-sensitive mutations of adenoviruses [J]. Cold Spring Harb Symp Quant Biol, 1975, 39 Pt 1：439-446.

[3] 程道軍，曾華明. RFLP技術(shù)構(gòu)建家蠶現(xiàn)行品種DNA指紋圖譜的研究[J]. 西南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2000，22(6)：484-486.

[4] 牟海青，趙文軍，鄧中亮，等．植原體16S rDNA RFLP指紋圖譜分析軟件研究[J]. 植物病理學(xué)報(bào)，2010，40(5)：522-529.

[5] WILLIAMS J G, KUBELIK A R, LIVAK K J, et al. DNA polymorphisms amplified by arbitrary primers are useful as genetic markers [J]. Nucleic Acids Research, 1990, 18(22)：6531-6535.

[6] WELSH J, MCCLELLAND M. Fingerprinting genomes using PCR with arbitrary primers [J]. Nucleic Acids Research, 1990, 18(24)：7213-7218.

[7] 陳志丹，李振剛，孫威江．閩南烏龍茶茶樹種質(zhì)資源RAPD指紋圖譜構(gòu)建及遺傳多樣性分析[J]. 分子植物育種，2012，10(6)：731-739.

[8] 李宇偉，王文靜，連瑞麗．RAPD法構(gòu)建鳶尾種質(zhì)資源的DNA指紋圖譜[J]. 河南農(nóng)業(yè)科學(xué)，2008(8)：112-115.

[9] ZABEAU M, VOS P. Selective restriction fragment amplification: a general method for DNA fingerprinting：92402629.7 [P]. 1993.

[10] 胡侃，余夏夏，余金洪，等．云南紫稻細(xì)胞質(zhì)無花粉型三系及雜種F1的AFLP指紋圖譜的構(gòu)建與分析[J].中國水稻科學(xué)，2007，21(4)：345-349.

[11] 高世斌，李晚忱，榮廷昭，等．玉米骨干自交系A(chǔ)FLP指紋圖譜鑒定[J]. 四川農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2001，19(2)： 126-128.

[12] 孫寧，付小瓊，王秀玲，等．棉花區(qū)試品種的AFLP指紋圖譜分析[J]. 中國農(nóng)學(xué)通報(bào)，2012，28(15)：36-41.

[13] HAMADA H, PETRINO M G, KAKUNAGA T. Molecular structure and evolutionary origin of human cardiac muscle actin gene [J]. Proc. Nati Acad. Sci. USA, 1982, 79(19)：5901-5905.

[14] UPOV. Guidelines for DNA-profiling: Molecular marker selection and database construction: BMT Guidelines (proj.9) [S]. Geneva：UPOV, 2007.

[15] 朱勇良，謝裕林，黃凌哲，等．太湖稻區(qū)及國內(nèi)部分香稻SSR指紋圖譜構(gòu)建及遺傳多樣性初析[J]. 植物遺傳資源學(xué)報(bào)，2012，13(4)：666-671.

[16] 李麗華，魏昕，潘光堂．20個(gè)骨干玉米自交系的SSR指紋圖譜構(gòu)建[J]. 西南農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)，2007，20(6)：1172-1175.

[17] 雷天剛，何永睿，吳鑫，等．柑橘栽培品種(系)DNA指紋圖譜庫的構(gòu)建[J]. 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)，2009，42(8)：2852-2861.

[18] ZIETKIEWICZ E, RAFALSKI A, LABUDA D. Genome fingerprinting by simple sequence repeat (SSR)-anchored polymerase chain reaction amplification [J]. Genomics, 1994, 20(2)：176-183.

[19] 黃亮，李雨馨．常見水稻品種的DNA指紋圖譜構(gòu)建及其遺傳[J]. 糧食與油脂，2014，27(10)：25-28.

[20] 郭長奎，羅淑萍，王希東，等．新疆主要玉米雜交種及親本ISSR鑒定和指紋圖譜數(shù)據(jù)庫的構(gòu)建[J]. 新疆農(nóng)業(yè)科學(xué)，2009，46(1)：34-39.

[21] 繆恒彬，陳發(fā)棣，趙宏波，等．應(yīng)用ISSR對25個(gè)小菊品種進(jìn)行遺傳多樣性分析及指紋圖譜構(gòu)建[J]. 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)，2008，41(11)：3735-3740.

[22] LI G, QUIROS C F. Sequence-related amplified polymorphism (SRAP), a new marker system based on a simple PCR reaction： its application to mapping and gene tagging in Brassica [J]. Theor Appl Genet, 2001, 103(2-3)：455-461.

[23] 唐源江，曹雯靜，吳坤林．基于SRAP標(biāo)記的國蘭種質(zhì)資源遺傳多樣性分析及分子身份證構(gòu)建[J]. 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)，2015，48(9)：1795-1806.

[24] 云天海，鄭道君，謝良商，等．中國南瓜海南農(nóng)家品種間的遺傳特異性分析和DNA指紋圖譜構(gòu)建[J]. 植物遺傳資源學(xué)報(bào)，2013，14(4)：679-685.

[25] LANDER E S. The new genomics: global views of biology [J]. Science, 274(5287)：536-539.

[26] BROOKES A J. The essence of SNPs [J]. Gene, 1999, 234(2)：177-186.

[27] 張昆鵬. 利用SNP標(biāo)記構(gòu)建油菜品種指紋圖譜及定位下卷葉性狀基因的研究[M]. 南京：南京農(nóng)業(yè)大學(xué)，2013.

[28] 吳則東. 甜菜栽培品種的DNA指紋圖譜構(gòu)建及遺傳多樣性分析[D]. 北京：中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院，2013.

[29] 張婉，崔繼哲，于拴倉，等．白菜品種的SSR指紋圖譜數(shù)據(jù)庫的構(gòu)建[J]. 分子植物育種，2013，11(6)：843-857.

[30] 李雪蓮，王尚德，劉佳棽，等．部分兩用桃品種(系)指紋圖譜的建立[J]. 西北植物學(xué)報(bào)，2010，30(3)：505-511.

[31] 匡猛，楊偉華，許紅霞，等．中國棉花主栽品種DNA指紋圖譜構(gòu)建及SSR標(biāo)記遺傳多樣性分析[J]. 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)，2011，44(1)：20-27.

[32] 聶新輝，尤春源，李曉方，等．新陸早棉花品種DNA指紋圖譜的構(gòu)建及遺傳多樣性分析[J]. 作物學(xué)報(bào)，2014，40(12)：2104-2117.

[33] 潘兆娥，王希文，孫君靈，等．中棉所48的SSR數(shù)字指紋圖譜的構(gòu)建[J]. 中國農(nóng)學(xué)通報(bào)，2010，26(7)：31-35. [34] 宋海斌，崔喜波，馬鴻艷，等．基于SSR標(biāo)記的甜瓜品種(系)DNA指紋圖譜庫的構(gòu)建[J]. 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)，2012，45(13)：2676-2689.

[35] 王靜毅，陳業(yè)淵，黃秉智，等．部分香蕉品種SSR指紋圖譜的構(gòu)建[J]. 果樹學(xué)報(bào)，2009，26(5)：733-738.

[36] 劉娟，廖康，曼蘇爾·那斯?fàn)?，等．新疆杏品種(系)遺傳多樣性分析及DNA指紋圖譜庫構(gòu)建[J]. 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)，2015，48(4)：748-758.

[37] 徐宗大，趙蘭勇，張玲，等．玫瑰SRAP遺傳多樣性分析與品種指紋圖譜構(gòu)建[J]. 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)，2011，44(8)：1662-1669.

[38] PIPERIDIS G, RATTEY A R, TAYLOR G O, et al. DNA markers：a tool for identifying sugarcane varieties [J]. Austral Sugarcane, 2004, 8(supp1)：1-8.

[39] DA SILVA J A, SOLIS-GRACIA N, SILVA P R, et al. Sugarcane variety identification through DNA fingerprinting with microsatellites markers [J]. Subtropical Plant Science, 2008, 60：1-7.

[40] 劉新龍，馬麗，陳學(xué)寬，等．云南甘蔗自育品種DNA指紋身份證構(gòu)建[J]. 作物學(xué)報(bào)，2010，36(2)：202-210.

[41] 鄭益鳳. 甘蔗親本遺傳多樣性的SSR熒光標(biāo)記分析與指紋圖譜構(gòu)建[M]. 福州：福建農(nóng)林大學(xué)，2009.

[42] LIMA M, GARCIA A, OLIVEIRA K M, et al. Analysis of genetic similarity detected by AFLP and coefficient of parentage among genotypes of sugarcane (Saccharum spp.) [J]. Theor Appl Genet, 2002, 104(1)：30-38.

[43] 莊南生，鄭成木，黃東益，等．甘蔗種質(zhì)遺傳基礎(chǔ)的AFLP分析[J]. 作物學(xué)報(bào)，2005，31(4)：444-450.

[44] 王英，莊南生，高和瓊，等．甘蔗種質(zhì)遺傳基礎(chǔ)的ISSR分析[J]. 湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版)，2007，33(8)：176-183.

[45] PAN Y B, SCHEFFLER B E, RICHARD JR E P. High-throughput molecular genotyping of commercial sugarcane clones with microsatellite (SSR) markers [J]. Sugar Tech, 2007, 9(2-3)：176-181.

[46] 王英，陳守俊，朱相成，等．80份甘蔗種質(zhì)RAMP標(biāo)記遺傳多樣性分析[J]. 植物遺傳資源學(xué)報(bào)，2011，12(4)：525-532.

[47] 姚春雪，王先宏，何麗蓮，等．甘蔗與蔗茅雜交不同世代的SSR指紋圖譜構(gòu)建[J]. 分子植物育種，2011，9(3)：381-389.

[48] 昝逢剛，應(yīng)雄美，吳才文，等．98份甘蔗種質(zhì)資源遺傳多樣性的AFLP分析[J]. 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)，2015，48(5)：1002-1010.

[49] 吳建濤，楊俊賢，劉福業(yè)，等．甘蔗基因定位研究進(jìn)展及展望[J]. 分子植物育種(網(wǎng)絡(luò)版)，2011，9：1591-1596.

[50] 鄧海華，李奇?zhèn)?，陳子云．甘蔗親本的創(chuàng)新與利用[J]. 甘蔗，2004，11(3)：7-12.

(本篇責(zé)任編校：李金玉)

DNA Fingerprinting Technology and Its Application in Sugarcane Breeding

WU Jian-tao1,2, WANG Qin-nan1,2, ZHOU Feng1,2, XIE Jing1,2, XU Huan-yin1,2, CHANG Hai-long1,2
(1Guangzhou Sugarcane Industry Research Institute/Guangdong Key Lab of Sugarcane Improvement & Biorefinery, Guangzhou 510316;2Scientific Observation Test Station of Sugarcane Germplasm Resources and Utilization, Ministry of Agriculture, Sanya, Hainan 572025)

Abstract:DNA fingerprinting technologies have been rapidly developed with the development and utilization of kinds of new DNA molecular markers recently. This paper briefly reviewed the basic principle, advantages and disadvantages, application of several molecular markers in constructing DNA fingerprinting. Five methods to build fingerprint code and their application in sugarcane breeding were summarized. In addition, the problems existing in the application of DNA fingerprinting technology and outlook were also briefly discussed.

Keywords:DNA fingerprinting; Molecular marker; Sugarcane breeding; Application

作者簡介：吳建濤(1983-)，男，農(nóng)藝師；E-mail：wujiantao2010@163.com

基金項(xiàng)目：現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系建設(shè)專項(xiàng)資金(CARS-20-1-6)；廣東省科技計(jì)劃項(xiàng)目(2015A030303005?2014A030304026?2013B020311002?2013B060400027和粵科財(cái)字[2013]82號)；廣州市科技計(jì)劃項(xiàng)目(2014J4100227)

收稿日期：2015-12-26；修回日期：2016-02-02

中圖分類號：S566.1

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

文章編號：1005-9695(2016)01-0001-06

引文格式：吳建濤，王勤南，周峰，等. DNA指紋圖譜技術(shù)及其在甘蔗育種上的應(yīng)用[J]. 甘蔗糖業(yè)，2016(1)：1-6.