牛傳染性鼻氣管炎疫苗研究進(jìn)展

劉瑞寧 ， 鄧明亮 ，劉玉輝 ，陳穎鈺1,，郭愛珍*

(1.華中農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)業(yè)微生物國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖北武漢 430070；2.華中農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，湖北武漢 430070；3.華中農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，湖北武漢 430070)

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牛傳染性鼻氣管炎疫苗研究進(jìn)展

劉瑞寧1，2， 鄧明亮1,2，劉玉輝3，陳穎鈺1,3，郭愛珍1,2*

(1.華中農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)業(yè)微生物國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖北武漢 430070；2.華中農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，湖北武漢 430070；3.華中農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，湖北武漢 430070)

摘要:牛傳染性鼻氣管炎(IBR)是由牛傳染性鼻氣管炎病毒(IBRV)感染家養(yǎng)牛引起的一種熱性接觸性傳染病。由于缺乏有效的治療性藥物，因此疫苗免疫仍然是防控該病的關(guān)鍵措施。針對(duì)該病常用的疫苗主要有滅活疫苗和活疫苗，而基因缺失活疫苗由于具有免疫標(biāo)識(shí)，已成為新型疫苗研發(fā)的主流方向。一些發(fā)達(dá)國家已利用基因缺失標(biāo)記疫苗，如IBRV gE缺失疫苗，進(jìn)行免疫根除計(jì)劃并凈化了該病。然而，由于現(xiàn)存的疫苗仍存在免疫抑制與潛伏感染等問題，亟需研制更有效的標(biāo)記疫苗。論文就牛傳染性鼻氣管炎病毒的病原學(xué)特征、免疫抑制及疫苗研發(fā)進(jìn)展進(jìn)行綜述，以期為IBR有效疫苗的研發(fā)及其在防控上的應(yīng)用提供參考。

關(guān)鍵詞:牛傳染性鼻氣管炎;牛皰疹病毒Ⅰ型; 疫苗; 流行; 防控

牛傳染性鼻氣管炎(Infectious bovine rhinotracheitis, IBR)是由牛傳染性鼻氣管炎病毒(Infectious bovine rhinotracheitis virus，IBRV)又稱牛皰疹病毒Ⅰ型(Bovine herpes virus type 1, BHV-1)感染家養(yǎng)牛引起的以高熱、上呼吸道黏膜炎癥為主的一種的急性、熱性、接觸性傳染病，又稱“紅鼻病”或“壞死性鼻炎”[1]，是牛呼吸道疾病綜合征(Bovine respiratory disease complex，BRDC)重要的病原之一。IBRV感染牛后可潛伏感染三叉神經(jīng)，使病牛長期攜帶病毒，并在一定條件下(如運(yùn)輸?shù)葢?yīng)激因素導(dǎo)致免疫力下降)激活，通過呼吸道排毒，導(dǎo)致大范圍感染；此外，IBRV還可引起免疫抑制，繼發(fā)其他呼吸道病原感染，導(dǎo)致牛呼吸道疾病綜合征。1956年，Madin S H等[2]首次從患牛中分離出 IBRV，1964年Huck 等確認(rèn)IBRV屬于皰疹病毒。隨后，一些學(xué)者相繼從病牛的眼結(jié)膜、外陰、大腦和流產(chǎn)胎兒等分離到該病毒，此后，很多地區(qū)均有IBR的報(bào)道。IBR主要對(duì)牛群肥育率、產(chǎn)奶量及繁殖帶來極大的影響，因此，給世界養(yǎng)牛業(yè)造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失，僅美國每年就可造成30億美元的經(jīng)濟(jì)損失。

我國于1980年從新西蘭進(jìn)口牛中首次分離到該病毒[3]，此后，該病流行一直呈上升趨勢。近年來，隨著養(yǎng)牛數(shù)量和規(guī)模的增加，IBRV的感染情況更加嚴(yán)重，全國幾乎所有的省市、不同品種的牛都有流行報(bào)道。2007 年對(duì)我國 29個(gè)省區(qū)的1 344份奶牛血清gE-ELISA抗體檢測數(shù)據(jù)顯示，我國IBR血清學(xué)個(gè)體陽性率為 35.8%[4]；此外，牦牛IBR的平均抗體陽性率為 77.4%[5]。

目前，已有奧地利、挪威、丹麥、德國、芬蘭和瑞士等幾個(gè)國家通過禁止疫苗接種、撲殺血清陽性牛、控制移動(dòng)等綜合措施根除了此病，但采取撲殺陽性牛的方法耗資巨大，只能應(yīng)用于陽性率較低的國家或地區(qū)。因此，在一些陽性率較高的國家或地區(qū)則采用疫苗免疫等防控策略?；蛉笔б呙缇哂忻庖邩?biāo)識(shí)可區(qū)分野毒感染和疫苗免疫，因此已成為IBR根除計(jì)劃中重要的疫苗。然而，現(xiàn)存的疫苗依舊存在免疫抑制與潛伏感染等問題，仍需研發(fā)更有效的疫苗。理想的疫苗應(yīng)該具備以下特點(diǎn)：免疫保護(hù)效果好，免疫期長，具有識(shí)別標(biāo)記，無免疫抑制，安全性好，副作用小，生產(chǎn)和使用方便，成本低廉等。IBR的疫苗主要有傳統(tǒng)疫苗(滅活疫苗和活疫苗)、亞單位疫苗、DNA疫苗和基因工程疫苗。

1IBRV的病原學(xué)

IBRV屬皰疹病毒科(Herpesviridae)α-皰疹病毒亞科(Alphaherpesvirinae)水痘病毒屬(Varicellovirus)。目前分離到的IBRV具有相同的抗原性，只有1個(gè)血清型。IBRV的基因組約135 kb，由長獨(dú)特區(qū)(UL，100 kb)、短獨(dú)特區(qū)(US，13 kb)及2個(gè)反向重復(fù)序列(IRS和TRS，各為11 kb)組成，可編碼73個(gè)蛋白質(zhì)。從病毒在體外細(xì)胞培養(yǎng)過程中對(duì)病毒增殖是否必需而言，必需蛋白有33個(gè)，包括糖蛋白gB、gD、gH、gL和gK等；非必需蛋白有36個(gè)，包括糖蛋白(gC、gE、gI、gG和gM)、胸苷激酶蛋白(TK)、脫氧尿苷三磷酸酶蛋白、包膜蛋白(UL49和US9)、膜蛋白(UL49.5)和調(diào)節(jié)蛋白(US3、bICP0、bICP22和Circ)，此外還包括一些蛋白如US2、UL7和UL24編碼的蛋白等[6]。目前研究較多的有g(shù)B、gC、gD、gE、gG和TK，其中編碼TK的基因?yàn)镮BRV重要的毒力基因，常被作為靶基因進(jìn)行敲除；另5種為免疫原性糖蛋白，是中和抗體的主要作用靶位，其中g(shù)D蛋白免疫原性最好，因此最常用于DNA疫苗或亞單位疫苗的研究；gB、gC的免疫原性次之，而gE的抗原性雖略次于gB，gC和gD糖蛋白，但缺失后仍有不錯(cuò)的免疫保護(hù)力，并可作為免疫標(biāo)記，因此gE缺失疫苗被歐洲許多國家廣泛用于IBR的防控。

2IBRV的免疫抑制機(jī)制

IBRV感染機(jī)體后可引起免疫抑制，造成繼發(fā)性細(xì)菌感染，如多殺性巴氏桿菌、溶血性嗜血桿菌感染等，隨著IBRV對(duì)機(jī)體免疫抑制程度的增加，繼發(fā)細(xì)菌感染的嚴(yán)重程度也增加，這些細(xì)菌最終導(dǎo)致肺炎的形成，稱為BRDC，也稱運(yùn)輸熱。IBRV引起免疫抑制的機(jī)制包括病毒通過抑制主要組織相溶性復(fù)合體Ⅰ型(major histocompatibility complex Ⅰ, MHC Ⅰ)分子與抗原遞呈相關(guān)轉(zhuǎn)運(yùn)分子的表達(dá)從而影響CD8+T細(xì)胞識(shí)別受感染的細(xì)胞，或直接感染CD4+T細(xì)胞引起其凋亡，最終損害機(jī)體的免疫系統(tǒng)及其功能[7]。目前已報(bào)道IBRV的免疫抑制相關(guān)基因有UL49.5、bICP0、bICP27和gG等。UL49.5編碼gN蛋白，gN在感染細(xì)胞中可抑制抗原處理相關(guān)轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(transporter associated with antigen processing, TAP)轉(zhuǎn)運(yùn)胞質(zhì)內(nèi)的多肽進(jìn)入高爾基體，進(jìn)而阻斷了MHC-I與多肽的結(jié)合；此外，gN可直接降解TAP復(fù)合物，阻止感染細(xì)胞被CD8+T細(xì)胞殺死。bICP0可以直接或間接的降低干擾素調(diào)節(jié)因子(interferon regulatory factor, IRF)3蛋白水平，進(jìn)而導(dǎo)致干擾素(interferon, IFN)β啟動(dòng)子活性降低；此外，bICP0具有抑制IRF7激活I(lǐng)FN-β啟動(dòng)子的能力[7]。然而最近研究發(fā)現(xiàn)，IBRV還存在另一個(gè)病毒早期基因可抑制IFN信號(hào)通路，即bICP27，它可抑制IFN-β1和IFN-β 3的活性[8]。gG蛋白可與趨化因子廣泛結(jié)合，從而阻止他們與相應(yīng)的特異性受體結(jié)合而阻斷趨化因子的活性[7]。

3傳統(tǒng)疫苗

3.1滅活苗

滅活苗是一類將IBRV病毒滅活配以合適佐劑而制成的疫苗，易保存，生產(chǎn)簡單，安全性好，一般不會(huì)引起流產(chǎn)、免疫抑制或潛伏感染，能夠誘導(dǎo)較好的體液免疫應(yīng)答，可有效減少排毒量和降低IBRV感染率[9]。滅活苗通常需要免疫2次，間隔10 d~14 d，第2次免疫后需要觀察其保護(hù)力7 d~10 d。由于在滅活過程中會(huì)因使抗原發(fā)生烷基化導(dǎo)致保護(hù)性抗原功能受損，同時(shí)因其不能在體內(nèi)增殖，從而不能或很少引起細(xì)胞免疫，導(dǎo)致免疫保護(hù)效力相對(duì)較差，且免疫期較短。此外，由于滅活苗免疫后個(gè)體無法與自然感染個(gè)體進(jìn)行鑒別診斷，因此會(huì)給根除IBR帶來一定的障礙。

3.2弱毒苗

傳統(tǒng)弱毒苗是IBRV強(qiáng)毒株經(jīng)牛腎細(xì)胞(MDBK)等傳代培養(yǎng)致弱后的產(chǎn)物，對(duì)牛失去病原性但仍保持其免疫原性且免疫原性強(qiáng)，具有誘導(dǎo)平衡免疫反應(yīng)(即細(xì)胞免疫和體液免疫反應(yīng))的能力，且誘導(dǎo)的免疫反應(yīng)持續(xù)期長，通過肌肉注射可產(chǎn)生免疫力。近年來，冷雪等[10]用其研制的IBRV LNM株進(jìn)行免疫研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)1月齡左右犢牛和6月齡~8月齡牛接種后臨床癥狀無任何異常，后備母牛接種后無流產(chǎn)、死胎及木乃伊胎出現(xiàn)；強(qiáng)毒攻毒保護(hù)率可達(dá)100%(5/5)。弱毒苗對(duì)帶有母源抗體的犢牛可誘導(dǎo)黏膜免疫應(yīng)答。2012年有學(xué)者對(duì)帶有母源抗體的出生當(dāng)天的犢牛鼻內(nèi)接種弱毒苗，接種后體內(nèi)免疫球蛋白A(immunoglobulinA, IgA)的滴度顯著高于未接種的犢牛，且35日齡再次接種的犢牛IgA的滴度再次升高[11]。2015年有外國學(xué)者用牛病毒性腹瀉病毒(Bovine viral diarrhea virus, BVDV)和IBRV的弱毒苗對(duì)非同期發(fā)情2 d后的小母牛進(jìn)行初免，同期發(fā)情后的10 d和31 d進(jìn)行再次免疫，對(duì)牛處死后并未在黃體組織、卵巢組織和胎兒組織中檢測到BVDV和IBRV，結(jié)果表明再次免疫不會(huì)影響母牛的生殖能力[12]。但傳統(tǒng)弱毒苗不易保存和運(yùn)輸，易污染和引起免疫失敗，且存在毒力返強(qiáng)，從而使免疫牛群成為潛在的傳染源，存在一定的安全隱患，一般不能用于懷孕牛。對(duì)于犢牛，在獲得IBRV免疫力的同時(shí)會(huì)導(dǎo)致對(duì)其他感染的抵抗力降低，或?qū)ζ渌呙绲姆磻?yīng)性降低，因此一般不建議使用到犢牛。目前很多國家已經(jīng)不再使用弱毒疫苗。

4亞單位疫苗

亞單位疫苗是指利用微生物的某種表面結(jié)構(gòu)成分制成不含核酸且能誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生免疫應(yīng)答的疫苗。亞單位疫苗包含病毒能夠引起保護(hù)性免疫的一個(gè)或多個(gè)抗原，由于不存在病毒核酸物質(zhì)和其他組分，因此不會(huì)引起不良反應(yīng)。此外，亞單位疫苗可能還可以區(qū)分免疫動(dòng)物與自然感染動(dòng)物。對(duì)于IBRV，其糖蛋白gB、gC、gD具有不同程度的免疫原性，可從病毒感染的細(xì)胞或是合成的多肽中分離得到，糖蛋白gD是誘導(dǎo)產(chǎn)生中和抗體的主要靶蛋白且免疫原性最好。除此之外，gD誘導(dǎo)的免疫反應(yīng)還可以抑制病毒的復(fù)制及在胞內(nèi)的潛伏性。因此，很多學(xué)者在糖蛋白gD方面做了較多的研究。如gD或其主要結(jié)構(gòu)域已經(jīng)分別在大腸桿菌，酵母、哺乳動(dòng)物細(xì)胞及昆蟲細(xì)胞等得到了高效表達(dá)[13]。一般而言，亞單位疫苗免疫原性較低，需配合佐劑才能產(chǎn)生較好的免疫效果，含CpG基序的寡聚脫氧核苷酸(oligodeoxynucletides containing CpG motifs, CpG ODN)作為開發(fā)中的新型佐劑，因其能夠誘導(dǎo)更平衡的免疫反應(yīng)而被廣泛研究[14]。近年來有學(xué)者對(duì)BVDV E2蛋白、IBRV gD蛋白主要抗原表位進(jìn)行串聯(lián)表達(dá)并研究了其及免疫原性，E2-gD融合蛋白良好的免疫原性、低成本、易操作和工業(yè)化批量生產(chǎn)等特性，使其成為開發(fā)BVDV、IBRV聯(lián)合亞單位疫苗的候選蛋白[15]。盡管亞單位疫苗安全有效，不存在潛伏感染的危險(xiǎn)，但由于其不能在體內(nèi)復(fù)制，所需接種量大，成本高，因而至今未得到廣泛應(yīng)用，仍處于研究中。

5DNA疫苗

DNA疫苗又稱基因疫苗或核酸疫苗，是指將編碼病原體有效免疫原性的基因與真核表達(dá)質(zhì)粒重組構(gòu)建成重組體而制備的疫苗。DNA疫苗有很多優(yōu)點(diǎn)，如與蛋白質(zhì)相比性質(zhì)較穩(wěn)定，無需特別的冷藏設(shè)備；擴(kuò)增簡單，易于生產(chǎn)，且成本較低；利用目的基因可引起細(xì)胞免疫和不同程度的體液免疫；以及一針防多病等諸多優(yōu)點(diǎn)。此外，有研究發(fā)現(xiàn)DNA疫苗可以克服母源抗體的干擾，增強(qiáng)免疫應(yīng)答的持續(xù)時(shí)間。與滅活苗和亞單位疫苗相比，gD截短后制備的 DNA疫苗能夠誘導(dǎo)外周血單個(gè)核細(xì)胞(peripheral blood mononuclear cell, PBMC)產(chǎn)生高水平的IFN-γ，而編碼gD的質(zhì)粒沒有保護(hù)力，但也有報(bào)道證明表達(dá)gC和截短gC或VP8不具有保護(hù)力。牛皰疹病毒Ⅰ型是第一個(gè)用于基因免疫嘗試的動(dòng)物病毒，1993年首次出現(xiàn)關(guān)于IBR DNA疫苗的報(bào)道，此DNA疫苗可誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生中和抗體，且抗體滴度較高。近年來有研究報(bào)道，使用pMASIA-tgD質(zhì)粒與不同濃度的牛中性粒細(xì)胞β防御素(bovine neutrophil β-defensins, BNBD3)合成物進(jìn)行免疫，不僅可以加強(qiáng)輔助性T細(xì)胞(helper T cell，Th)1型細(xì)胞免疫應(yīng)答還可提高體液免疫[16]。也有研究報(bào)道，IBRV的一種gD DNA疫苗配合佐劑Montanide Essai 903110使用，可以誘導(dǎo)牛體產(chǎn)生高水平的IFN-γ，增強(qiáng)細(xì)胞免疫[17]。盡管如此，大多數(shù)的DNA疫苗只能引起部分的體液免疫反應(yīng)[18]，目前關(guān)于IBRV DNA疫苗的研究仍舊處于不斷的開發(fā)中。

6基因工程疫苗

6.1基因缺失疫苗

通過使用分子生物學(xué)技術(shù)將病毒的某一毒力相關(guān)基因部分或完全缺失，或?qū)δ硯讉€(gè)位點(diǎn)進(jìn)行突變而使該基因的表達(dá)產(chǎn)物失去活性，用這種經(jīng)過改造的病毒感染機(jī)體后常不引起臨床癥狀或癥狀較輕，但是機(jī)體感染該病毒后能誘發(fā)機(jī)體產(chǎn)生免疫應(yīng)答，起到保護(hù)的作用，使用這種經(jīng)過改造的病毒制成的疫苗稱作基因缺失疫苗。在過去10年~15年間，由于基因工程缺失疫苗可以使其毒力衰減，通過血清學(xué)與野毒株區(qū)別開來，其應(yīng)用日益廣泛，如基因缺失標(biāo)記疫苗IBRV gE/TK已成為一些發(fā)達(dá)國家防制與凈化IBR的主要手段。

基因工程缺失疫苗的研究主要基于毒力基因、非必需基因、免疫抑制基因以及潛伏感染相關(guān)基因4個(gè)方面：①毒力基因。TK基因?yàn)镮BRV的毒力基因，IBRV基因缺失疫苗最早缺失的就是TK基因，隨后便展開了關(guān)于TK及其他基因缺失的研究。TK基因缺失后，有病毒毒力降低、免疫原性良好、不出現(xiàn)毒力返強(qiáng)等諸多優(yōu)點(diǎn)。張桂紅等1999年構(gòu)建出了攜帶LacZ表達(dá)盒的BHV-1 TK基因缺失突變株[19]，隨后又建立了可以鑒別野毒和TK- IBRV疫苗毒的感染的診斷方法。近年來關(guān)于TK基因的缺失主要是和其他基因進(jìn)行雙缺失研究的。②非必需基因。IBRV的一些病毒復(fù)制和增殖非必需基因包括gC、gE基因等，缺失這些基因不僅對(duì)病毒的復(fù)制和增殖沒有影響，而且可降低病毒毒力。這方面的研究主要是缺失gC 和gE 等一些糖蛋白基因，并取得了相應(yīng)的進(jìn)展。薛飛等構(gòu)建了插入LacZ表達(dá)盒的BHV-1 gC基因缺失突變株[20]。目前關(guān)于gE基因缺失株的研究廣泛，有學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)gE基因缺失在體外試驗(yàn)中保持有良好的復(fù)制和誘導(dǎo)血清學(xué)反應(yīng)能力、穩(wěn)定性和免疫原性，且能鑒別野毒感染和gE缺失株感染，為減少由BHV-1感染引起的經(jīng)濟(jì)損失和區(qū)分野毒感染與自然感染提供了可能性[21-22]。2013年有學(xué)者以BHV-1.1 Abu-Hammad突變株為基礎(chǔ)，構(gòu)建了gE基因缺失突變株，對(duì)小鼠和豚鼠接種14 d后臨床癥狀無任何異樣，通過分離病毒和PCR檢測均在鼻組織中檢測到IBRV。由于其具有良好的安全性和免疫原性，被作為當(dāng)?shù)鼗驑?biāo)記疫苗的候選[23]。許多學(xué)者還在TK基因缺失的基礎(chǔ)上進(jìn)行了和免疫原性非必須基因雙缺失的研究。定明等[24]構(gòu)建了BHV-1TK-/gE-/EGFP+雙缺失突變株，進(jìn)行的動(dòng)物試驗(yàn)結(jié)果表明其對(duì)試驗(yàn)牛有很好的安全性，并能提供很強(qiáng)的保護(hù)力。荷蘭啟動(dòng)撲滅計(jì)劃使用的便是IBRV TK-/gE-雙基因缺失疫苗。③免疫抑制基因。IBR免疫抑制基因缺失的研究目前主要是基于gG和UL49.5。gG與趨化因子廣泛結(jié)合，從而阻止他們與相應(yīng)的特異性受體結(jié)合而阻斷趨化因子的活性，gG缺失后病毒毒力下降且保持著良好的免疫原性，本實(shí)驗(yàn)室張敏敏等構(gòu)建了BHV-1 gG-/TK-雙基因缺失突變株，牛體試驗(yàn)表明病毒毒力明顯減弱，同時(shí)具有較好的免疫原性，并且可以區(qū)分出野毒株與疫苗株[25]。gN基因通過抑制TAP，使MHC Ⅰ抗原呈遞下調(diào)而達(dá)到免疫抑制的目的，gN缺失后，誘導(dǎo)的免疫反應(yīng)和保護(hù)力可得到增強(qiáng)和提高[26]。④潛伏感染相關(guān)基因。主要有g(shù)E、LR基因、US9等基因。gE的胞質(zhì)尾區(qū)與病毒的順行有關(guān)，gE胞質(zhì)尾區(qū)缺失后，病毒不能被地塞米松激活從三叉神經(jīng)節(jié)順行至鼻或眼上皮細(xì)胞，因此gE缺失后可降低病毒激活而向環(huán)境排毒的可能性[27]。潛伏相關(guān)(latency-related, LR)基因轉(zhuǎn)染物的大量出現(xiàn)是潛伏感染的標(biāo)志，這些轉(zhuǎn)錄物可通過抑制細(xì)胞凋亡和病毒基因表達(dá)促進(jìn)潛伏感染的建立，因此LR基因被很多學(xué)者進(jìn)行研究。已有學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)，LR基因突變后會(huì)破壞潛伏感染后再激活的能力[28]。US9作為IBRV的一種包膜蛋白，對(duì)于三叉神經(jīng)內(nèi)的病毒再激活以及病毒從三叉神經(jīng)順行到眼睛和鼻腔是必不可少的。目前已有學(xué)者的研究證明，US9基因缺失后感染牛將失去潛伏感染再激活的能力[29]。

6.2BHV-1為載體的重組疫苗

病毒活載體疫苗是近年來人們十分關(guān)注的諸多新型疫苗中的一類。它利用基因工程方法將改造病毒作為載體，按人們的要求表達(dá)特定保護(hù)性抗原或免疫調(diào)節(jié)因子等，尤為重要的是可以構(gòu)建多價(jià)疫苗以達(dá)到一針防多病的目的。病毒活載體疫苗具有以下優(yōu)點(diǎn)：安全、可靠，不需要?jiǎng)游锝佑|病原體，不需要使用佐劑，可以攜帶多個(gè)外源基因，同時(shí)誘導(dǎo)產(chǎn)生體液免疫和細(xì)胞免疫應(yīng)答。迄今已成功研制出多種病毒和細(xì)菌活載體疫苗。其中BHV-1為研究較多的一種。相對(duì)于其他病毒活載體而言，BHV-1載體疫苗具有以下優(yōu)勢：它可以作為一些能引起重大經(jīng)濟(jì)損失的病毒或細(xì)菌的載體，包括引起B(yǎng)RDC的病原如牛病毒性腹瀉病毒(BVDV)、牛呼吸合胞體病毒(Bovine respiratory syncytial virus, BRSV)等；不會(huì)給牛和人類帶來新的危險(xiǎn)。據(jù)報(bào)道，許多學(xué)者已使用IBRV基因缺失毒株來表達(dá)其他細(xì)菌和病毒的基因編碼序列，并取得一定進(jìn)展。2009年馮軍科構(gòu)建了一株表達(dá) BRSV G 基因的重組BHV-1 病毒，并用Western blot和間接免疫熒光試驗(yàn)(indirect immunoinfluscent assay, IFA)證明 G 蛋白獲得表達(dá)，為研制 BRSV 活載體疫苗奠定了基礎(chǔ)[30]。2009年任憲剛等成功地構(gòu)建了表達(dá)口蹄疫病毒(Foot and mouth disease virus, FMDV) VP1 基因的重組病毒IBRV gE-/VP1， 并通過病毒中和試驗(yàn)和酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ensyme-linked immunosorbent assay, ELISA)證實(shí)在兔子模型體內(nèi)具有免疫原性，使其有可能成為開發(fā)口蹄疫(Foot and mouth disease, FMD)和IBR二價(jià)疫苗的候選疫苗[31]。2013年王銀等[32]以IBRV弱毒株為載體，構(gòu)建了表達(dá)BVDV-1和BVDV-2 E2蛋白的BHV-1 TK基因缺失的重組病毒，經(jīng)IFA和Western blot 試驗(yàn)結(jié)果證明重組病毒能在MDBK細(xì)胞上表達(dá)BVDV-1和 BVDV-2 E2蛋白，不過該重組病毒的生物學(xué)特性及免疫原性、保護(hù)性有待進(jìn)一步的研究。此外，還有學(xué)者將免疫增強(qiáng)劑基因或細(xì)胞因子等插入BHV-1中，以增強(qiáng)BHV-1的免疫反應(yīng)，如紀(jì)素坤等將粒細(xì)胞巨噬細(xì)胞刺激因子(granulocyte-macrophage colony-stimulating factor, GM-CSF)插入BHV-1缺失病毒中構(gòu)建了BHV-1 gG-/TK-/GM-CSF+，該重組病毒能對(duì)兔產(chǎn)生較好的免疫保護(hù)力，攻毒后第3天重組株可分泌出較親本株略少的病毒，且在免疫早期能產(chǎn)生較親本株更高水平的IFN-β。提示在免疫早期重組株刺激機(jī)體產(chǎn)生了更高水平的細(xì)胞免疫反應(yīng)，具有一定的應(yīng)用前景，并為該重組病毒在牛體內(nèi)產(chǎn)生更好的免疫反應(yīng)提供了可能性[33]。同樣的，BHV-1也可以表達(dá)細(xì)菌蛋白，用來免疫接種引起奶牛和肉牛感染的一些細(xì)菌性疾病，如表達(dá)引起肺炎的溶血性曼氏桿菌保護(hù)性抗原的BHV-1重組病毒，以及表達(dá)禽型分支桿菌亞種副結(jié)核(Mycobacteriumaviumsubsp. paratuberculosis, MAP)蛋白的IBRV的重組疫苗[34]。盡管BHV-1可以作為一種活載體承載牛的外源抗原，但對(duì)IBRV免疫抑制的特性和潛伏感染-活化的周期循環(huán)進(jìn)行一個(gè)全面的了解是非常必要的。

7IBR疫苗使用的新趨勢及展望

基因缺失疫苗由于具有免疫標(biāo)識(shí)，可利用缺失基因進(jìn)行野毒感染和疫苗免疫的鑒別診斷，已成為新型疫苗研究開發(fā)的主流方向。一些發(fā)達(dá)國家利用基因缺失標(biāo)記疫苗如IBRV gE-/TK-免疫進(jìn)行該病的防制與凈化。因此，使用基因缺失標(biāo)記疫苗免疫并配套使用鑒別診斷方法對(duì)牛群進(jìn)行IBR的根除和凈化是當(dāng)前IBR防控的主要趨勢。然而，隨著基因缺失標(biāo)記疫苗的廣泛使用，出現(xiàn)了幾個(gè)問題：①一些缺失毒株還保留免疫抑制基因，仍然存在免疫抑制;②仍可建立潛伏感染，并且可在試驗(yàn)條件下或?qū)嶋H應(yīng)用中被激活，導(dǎo)致病毒重排向環(huán)境散播病毒，增加散毒的風(fēng)險(xiǎn);③可與野毒株或其他缺失疫苗株重組，使病毒毒力返強(qiáng)，擾亂了根除計(jì)劃;④血清學(xué)標(biāo)記的鑒別診斷能力不足，如靈敏度低、檢測抗體時(shí)間滯后。因此，未來理想的超級(jí)疫苗將會(huì)是血清學(xué)標(biāo)記基因、免疫抑制基因以及潛伏相關(guān)基因等多基因缺失的疫苗。近年來，直接敲除免疫抑制基因成為改善IBR基因缺失標(biāo)記疫苗的新策略。已有學(xué)者研究了缺失gN-TAP結(jié)合域的病毒突變株，證實(shí)可以更好的誘導(dǎo)細(xì)胞免疫[26]。因此同時(shí)具有US9，gE胞質(zhì)尾區(qū)和gN-TAP結(jié)合域三基因缺失的毒株，由于缺失的gE胞質(zhì)尾區(qū)可以作為免疫標(biāo)記，以及US9基因缺失也使病毒失去潛伏感染再激活的能力，因此可能成為新一代超級(jí)疫苗的研究對(duì)象。因?yàn)樵摱局昃哂幸韵绿攸c(diǎn)：①可以刺激機(jī)體產(chǎn)生抵抗IBRV更好的細(xì)胞免疫應(yīng)答;②包括血清學(xué)標(biāo)記基因;③ 毒力減弱。目前已有學(xué)者研究了US9，gE胞質(zhì)尾區(qū)和UL49.5胞外區(qū)第30-32位氨基酸與胞質(zhì)尾區(qū)同時(shí)缺失的三基因缺失疫苗，該缺失毒株接種動(dòng)物后能比缺失gE的疫苗誘導(dǎo)更高水平的免疫應(yīng)答和保護(hù)力[35]。

由于IBRV感染可引起持續(xù)性感染和免疫抑制等隱性感染，嚴(yán)重影響牛的生產(chǎn)性能和繁殖性能，給養(yǎng)牛業(yè)造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失，因此，IBR必會(huì)成為阻礙世界養(yǎng)牛業(yè)發(fā)展的絆腳石。近年來，隨著我國規(guī)?；B(yǎng)牛業(yè)養(yǎng)牛業(yè)的快速發(fā)展，牛只轉(zhuǎn)運(yùn)頻繁，使得我國的IBRV血清陽性率日益嚴(yán)重。目前，一些國家已實(shí)施了IBR根除計(jì)劃并達(dá)到了凈化的目的。借鑒國外成功的根除經(jīng)驗(yàn)，嚴(yán)格檢疫制度，定期接種疫苗，撲殺發(fā)病牛群，是控制該病的關(guān)鍵和重要措施。然而，目前國內(nèi)市場尚無安全有效的商品化疫苗，因此，研制有效的疫苗和藥物是當(dāng)前面臨的重大挑戰(zhàn)。本實(shí)驗(yàn)室已開展 IBRV 流行病學(xué)調(diào)查，并成功研制了IBRV gG-/TK-基因缺失疫苗[25]，為該病的防控奠定了基礎(chǔ)。此外，我國屬于發(fā)展中國家，全面實(shí)施撲殺計(jì)劃需要付出巨大代價(jià)，因此制定適用于我國的有效的防控措施是關(guān)鍵。

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Advance in Vaccines of Infectious Bovine Rhinotracheitis

LIU Rui-ning1,2,DENG Ming-liang1,2,LIU Yu-hui3,CHEN Ying-yu1,3,GUO Ai-zhen1,2

(1.TheStateKeyLaboratoryofAgriculturalMicrobioogy,HuazhongAgriculturalUniversity,Wuhan,Hubei,430070,China;2.CollegeofVeterinaryMedicine,HuazhongAgriculturalUniversity,Wuhan,Hubei, 430070,China;3.CollegeofAimalScience,HuazhongAgriculturalUniversity,Wuhan,Hubei,430070,China)

Abstract:Infectious bovine rhinotracheitis (IBR)is a feverish and contagious infectious disease of cattle caused by infectious bovine rhinotracheitis virus (IBRV). Since it lacks effective therapeutic drugs, vaccine immunization is an ideal approach against IBR. Currently available vaccines against IBR are modified live attenuated virus (MLV) and killed whole virus (KV). Because the gene-deleted vaccines incorporate immunological markers, they have become a new trend for the new vaccine research and development. Some developed countries have used gene deleted marker vaccines like IBRV gE-deleted marker vaccines to implement successfully IBR control and eradication plan. However, the existent live vaccines exhibit immune suppression to some extent. Therefore, more effective vaccines are urgently needed. This paper reviewed IBRV immunological properties，immune suppression and the recent researchs on IBRV vaccines in order to provide reference for development of more effective vaccines and IBRV control.

Key words:Infectious bovine rhinotracheitis; Bovine herpes virus type 1; vaccine; prevalence; prevention and control

文章編號(hào):1007-5038(2016)02-0085-06

中圖分類號(hào):S852.659.1

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼:A

作者簡介：劉瑞寧(1990-)，女，河南安陽人，碩士，主要從事獸醫(yī)傳染病學(xué)研究。*通訊作者

基金項(xiàng)目：農(nóng)業(yè)公益性行為科研專項(xiàng)(201003060);現(xiàn)代農(nóng)業(yè)(肉牛)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系專項(xiàng)資金(CARS-38)

收稿日期：2015-09-21