蛋白質(zhì)互作研究技術(shù)

吳　健，朱海霞，趙志荀，顏新敏，趙銀龍，吳　娜，李　健，張志東，張　強(qiáng)，李　影，吳國(guó)華*

(1.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州獸醫(yī)研究所，家畜疫病病原生物學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，農(nóng)業(yè)部畜禽病毒學(xué)重點(diǎn)開放實(shí)驗(yàn)室，甘肅蘭州 730046；2.吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，吉林長(zhǎng)春 130118；3.西北民族大學(xué)生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院，甘肅蘭州 730124)

?

蛋白質(zhì)互作研究技術(shù)

吳健1,2，朱海霞1，趙志荀1，顏新敏1，趙銀龍3，吳娜1，李健1，張志東1，張強(qiáng)1，李影2*，吳國(guó)華1*

(1.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州獸醫(yī)研究所，家畜疫病病原生物學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，農(nóng)業(yè)部畜禽病毒學(xué)重點(diǎn)開放實(shí)驗(yàn)室，甘肅蘭州 730046；2.吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，吉林長(zhǎng)春 130118；3.西北民族大學(xué)生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院，甘肅蘭州 730124)

摘要：蛋白質(zhì)在生物體的機(jī)制中是必不可少的，擔(dān)任著生物系統(tǒng)內(nèi)啟動(dòng)以及執(zhí)行的任務(wù)。生物體的每一個(gè)生物過(guò)程，從遺傳物質(zhì)復(fù)制到細(xì)胞衰老與死亡，依賴于幾種甚至幾百種蛋白質(zhì)之間的功能協(xié)調(diào)。蛋白質(zhì)的功能，結(jié)構(gòu)的改變會(huì)破壞這種平衡，導(dǎo)致疾病的發(fā)生，通常這種情況是由于蛋白間的相互作用引起的。目前有很多蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)功能是未知的，所以蛋白質(zhì)組學(xué)發(fā)展的也尤為迅速。論文主要綜述了雙向電泳、噬菌體展示技術(shù)、GST pull-down、酵母雙雜交、串聯(lián)親和純化、雙分子熒光互補(bǔ)技術(shù)、蛋白質(zhì)芯片、Far Western blot、免疫共沉淀9個(gè)蛋白質(zhì)組學(xué)相關(guān)研究技術(shù)，并簡(jiǎn)單介紹了近幾年這些技術(shù)在生物學(xué)中的應(yīng)用。

關(guān)鍵詞：蛋白質(zhì)相互作用；蛋白互作抑制劑；生物信息學(xué)

人類基因組序列早在本世紀(jì)初成功解碼，生物學(xué)領(lǐng)域的研究正式邁入后基因組時(shí)代，對(duì)基因研究的重心也轉(zhuǎn)移到了翻譯后的蛋白質(zhì)上[1]。蛋白質(zhì)作為生命活動(dòng)的主要承擔(dān)者，在近年來(lái)越發(fā)地成為研究的熱點(diǎn)，而在蛋白質(zhì)組學(xué)方面，對(duì)蛋白質(zhì)的研究多停留在蛋白質(zhì)間的相互作用(protein-protein interaction，PPI)，蛋白間的互作會(huì)產(chǎn)生蛋白質(zhì)復(fù)合體，并且會(huì)調(diào)控生物體的生命活動(dòng)，監(jiān)測(cè)蛋白質(zhì)間的互作是了解生物機(jī)制過(guò)程的關(guān)鍵。研究表明，許多疾病的誘因都是由于蛋白間的互作引起，如豬繁殖與呼吸綜合征、阿爾茨海默病、亨廷頓舞蹈癥、胰腺癌等等，所以詳細(xì)的了解并有效的阻斷這些蛋白間的互作對(duì)于臨床疾病的治療具有重大而深遠(yuǎn)的意義[2]。隨著科學(xué)技術(shù)手段不斷的成熟，蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)也得到了高速的發(fā)展，包括雙向電泳、噬菌體展示技術(shù)、GST pull-down、酵母雙雜交、串聯(lián)親和純化、雙分子熒光互補(bǔ)技術(shù)、蛋白質(zhì)芯片、Far Western blot、免疫共沉淀等等。

1雙向電泳技術(shù)

雙向電泳(two-dimensional electrophoresis,2-DE)最早是1975年提出用于分離分析蛋白的技術(shù)，最初并非是為驗(yàn)證蛋白間的互作，但經(jīng)過(guò)不斷的發(fā)展及改良，該技術(shù)可以同TAP等技術(shù)及儀器的協(xié)同來(lái)進(jìn)行蛋白互作的驗(yàn)證，結(jié)果還可以反映出蛋白翻譯后的修飾狀態(tài)[3]。雙向電泳原理是根據(jù)預(yù)測(cè)蛋白的等電點(diǎn)先進(jìn)行等電聚焦電泳，然后再根據(jù)分子質(zhì)量大小進(jìn)行SDS-PAGE電泳進(jìn)行二次分離，經(jīng)染色得到二維分布的蛋白質(zhì)電泳圖，隨后通過(guò)圖像分析軟件來(lái)對(duì)蛋白質(zhì)的性質(zhì)進(jìn)行分析。該技術(shù)優(yōu)點(diǎn)是可以高分辨，高靈敏的檢測(cè)出蛋白之間的性質(zhì)差異。缺點(diǎn)是后期凝膠染色如熒光染料或銀染分別需要昂貴的設(shè)備或成本，所以實(shí)驗(yàn)室大多采用低成本的考馬斯亮藍(lán)染色法。

有時(shí)，電泳的電解液中成分的改變會(huì)對(duì)試驗(yàn)造成不良影響，且極端酸/堿性蛋白的篩選相對(duì)比較困難，減少或消除這方面不利因素就可以大大提高試驗(yàn)成功率，Guo C G等[4]通過(guò)對(duì)電解液的改變有效的消除了定量時(shí)蛋白質(zhì)沉淀對(duì)試驗(yàn)的干擾，并增加了試驗(yàn)的分辨率(多分辨約16.4%的蛋白質(zhì))與靈敏度(較原始方法約提高2.7倍)。此進(jìn)步有益于復(fù)雜蛋白質(zhì)組的研究，尤其是極端酸/堿性蛋白的分析篩選。而雙向電泳與免疫印記法的聯(lián)用也在寄生蟲領(lǐng)域有新進(jìn)展。Cui J等[5]通過(guò)雙向電泳及免疫印記成功檢測(cè)到與旋毛蟲表面抗原相關(guān)聯(lián)的15種不同蛋白質(zhì)，經(jīng)過(guò)篩選，確定其中5個(gè)蛋白質(zhì)與旋毛蟲代謝相關(guān)并且這5個(gè)中的2個(gè)蛋白與細(xì)胞過(guò)程關(guān)聯(lián)。這為闡明宿主-寄生蟲相互作用，識(shí)別入侵相關(guān)蛋白，診斷早期抗原以及設(shè)計(jì)相關(guān)疫苗打下了堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。

2噬菌體展示技術(shù)

該技術(shù)最早是由美國(guó)Missouri大學(xué)的Smith G P建立。在過(guò)去的幾年里該技術(shù)發(fā)展迅猛，在各種領(lǐng)域大放異彩，如驗(yàn)證蛋白間互作、臨床應(yīng)用[6]、藥物發(fā)現(xiàn)[7]、疫苗開發(fā)[8]、抗體工程分離技術(shù)[9]、表位作圖[10]等等。該技術(shù)原理是將目的基因完整的閱讀框克隆到噬菌體外殼蛋白結(jié)構(gòu)的基因位置，使外源基因與噬菌體外殼蛋白進(jìn)行融合表達(dá)，融合蛋白隨子代噬菌體的重組而顯示在噬菌體表面。顯示的分子或蛋白保持相對(duì)獨(dú)立的結(jié)構(gòu)及活性，肽庫(kù)與固相上的靶蛋白分子經(jīng)過(guò)一定時(shí)間孵育后，洗去未結(jié)合的游離噬菌體，然后以競(jìng)爭(zhēng)受體或酸洗脫下與靶分子結(jié)合吸附的噬菌體，洗脫的噬菌體感染宿主細(xì)胞后經(jīng)繁殖擴(kuò)增，進(jìn)行下一輪洗脫，經(jīng)過(guò)3輪～5輪的“吸附-洗脫-擴(kuò)增”后，與靶分子特異結(jié)合的噬菌體得到高度富集。所得的噬菌體制劑可用來(lái)做進(jìn)一步富集有期望結(jié)合特性的目標(biāo)噬菌體。噬菌體展示技術(shù)系統(tǒng)又可詳細(xì)分為絲狀噬菌體展示系統(tǒng)、λ噬菌體展示系統(tǒng)、T4噬菌體展示系統(tǒng)、T7噬菌體展示系統(tǒng)。此技術(shù)優(yōu)點(diǎn)是篩選高效，操作簡(jiǎn)單，成本低廉。缺點(diǎn)是拷貝數(shù)低，表達(dá)量小，并且噬菌體展示系統(tǒng)依賴于細(xì)胞內(nèi)基因的表達(dá)，所以，一些對(duì)細(xì)胞有毒性的分子如生物毒素分子，很難得到有效表達(dá)和展示，限制了分子的多樣性。由于噬菌體展示技術(shù)操作便利、成本低，很多人熱衷于此技術(shù)并進(jìn)行了一定的改良，如Celik E等[11]利用糖陣列設(shè)計(jì)的噬菌體展示成功建立了高通量檢測(cè)的多糖 - 蛋白相互作用方法，為大規(guī)模篩選及臨床應(yīng)用鋪平道路。而近幾年報(bào)道也充分說(shuō)明了噬菌體展示技術(shù)的廣泛應(yīng)用，如Malini E等[12]使用噬菌體展示技術(shù)成功發(fā)現(xiàn)了衰老纖維原細(xì)胞的染色質(zhì)上有高遷移率蛋白A(high-mobility group A，HMGA)的相互作用分子及蛋白，還有相互作用的特定氨基酸區(qū)域E-R-K，闡述了該技術(shù)在驗(yàn)證蛋白間相互作用的高效與敏感。并首次證明了E-R-L區(qū)域肽序列結(jié)合到HMGA，為研究相關(guān)肽與HMGA的相互作用提供依據(jù)，并進(jìn)一步為開發(fā)癌癥抑制劑(抑制HMGA族蛋白)奠定了堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。

3GST pull-down技術(shù)

此技術(shù)目的用來(lái)驗(yàn)證在體外蛋白質(zhì)之間的互作關(guān)系，現(xiàn)已經(jīng)廣泛用于分子生物學(xué)領(lǐng)域[13]。此技術(shù)原理是先構(gòu)建帶有GST標(biāo)簽的融合表達(dá)載體，后經(jīng)過(guò)GST親和純化柱將蛋白純化，最后將待測(cè)蛋白過(guò)柱，若標(biāo)簽蛋白與待測(cè)蛋白間有相互作用，待測(cè)蛋白就可以結(jié)合到柱上，隨后經(jīng)過(guò)洗脫就可以得到相互作用蛋白。該技術(shù)優(yōu)點(diǎn)是特異性極高。缺點(diǎn)是無(wú)法大規(guī)模篩選蛋白間的相互作用，且有些內(nèi)源性蛋白會(huì)干擾試驗(yàn)導(dǎo)致假陽(yáng)性結(jié)果。

GST pull-down技術(shù)優(yōu)勢(shì)就在于其可以使靶蛋白保持“天然”的狀態(tài)，活性很高，對(duì)于要求活性的互作試驗(yàn)來(lái)說(shuō)意義重大，所以應(yīng)用極為廣泛。Luo L等[14]對(duì)GST pull-down技術(shù)進(jìn)行了改進(jìn)，進(jìn)一步增加了試驗(yàn)的敏感性，降低背景水平并使蛋白酶裂解步驟更容易。對(duì)于有內(nèi)源性蛋白干擾的GST pull-down 技術(shù)來(lái)說(shuō)，蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)間的協(xié)作可以使試驗(yàn)結(jié)果更準(zhǔn)確、更可信。如Wang X等[15]通過(guò)GST pull-down協(xié)同酵母雙雜交、免疫共沉淀等技術(shù)證實(shí)了豬繁殖與呼吸綜合征病毒(PPRSV)的N蛋白與PABP之間的相互作用，確定了PABP的調(diào)節(jié)對(duì)于PRRSV復(fù)制過(guò)程起重要作用，并且為研發(fā)PPRSV疫苗提供了理論基礎(chǔ)，此外，調(diào)查PRRSV細(xì)胞增殖蛋白會(huì)提高我們對(duì)分子級(jí)病毒感染病理現(xiàn)象的理解。

4酵母雙雜交技術(shù)

酵母雙雜交最早由Field S等[16]在1989通過(guò)轉(zhuǎn)錄因子GAL4的研究結(jié)果建立。是在體內(nèi)驗(yàn)證蛋白間相互作用的經(jīng)典方法。原理是酵母內(nèi)有2個(gè)特殊結(jié)構(gòu)域：特異性結(jié)合結(jié)構(gòu)域(binding domin,BD)和轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域(AD)。這2個(gè)結(jié)構(gòu)域即使分開時(shí)也仍具有功能，互不影響。當(dāng)BD結(jié)合某段基因需要表達(dá)時(shí)就必須識(shí)別AD進(jìn)行結(jié)合，這樣才能轉(zhuǎn)錄翻譯構(gòu)成完整的真核表達(dá)系統(tǒng)。所以只要將待測(cè)的倆個(gè)蛋白基因分別連接到AD與BD上，若靶蛋白之間有相互作用則AD與BD就可以結(jié)合完成轉(zhuǎn)錄并激活下游報(bào)告基因，根據(jù)報(bào)告基因就可以判斷互作結(jié)果。同時(shí)，報(bào)告基因的選擇建議使用倆種或倆種以上(如ADE2和URA3)，這樣可以使試驗(yàn)結(jié)果更準(zhǔn)確。酵母雙雜交的優(yōu)勢(shì)在于可以建立cDNA文庫(kù)，從中大規(guī)模篩選與目標(biāo)蛋白相互作用的多種蛋白，還可以建立基因組蛋白連鎖圖(genome protein linkage map，GPLM)。酵母雙雜交的優(yōu)點(diǎn)是效率高，蛋白間的瞬時(shí)與穩(wěn)定結(jié)合都有良好的敏感性，結(jié)果便于觀察，最重要的是酵母雙雜交是在體內(nèi)進(jìn)行，可以有效的排出體外因素的干擾使結(jié)果更可信。缺點(diǎn)是不能檢測(cè)細(xì)胞膜、胞漿以及分泌到細(xì)胞外的蛋白，另外試驗(yàn)周期略長(zhǎng)，而且結(jié)果容易出現(xiàn)假陽(yáng)性，需要進(jìn)行多重篩選以及回轉(zhuǎn)酵母等試驗(yàn)進(jìn)行排除。鑒于酵母雙雜交技術(shù)的高效、敏感，尤其是在酵母體內(nèi)驗(yàn)證互作排出外界干擾的情況下，酵母雙雜交在很多領(lǐng)域大放異彩，如Silva J V等[17]通過(guò)對(duì)酵母雙雜交技術(shù)改良驗(yàn)證了磷蛋白與磷酸酶1的相互作用，使其在制藥領(lǐng)域發(fā)揮作用。Mahajan S等[18]成功建立了衍生于感染口蹄疫病毒的豬腎細(xì)胞系(LFBK) 的cDNA文庫(kù)，并用口蹄疫病毒的2C蛋白做誘餌蛋白，從LFBK的cDNA文庫(kù)進(jìn)行酵母雙雜交篩選互作蛋白，并深入的研究了口蹄疫病毒與豬腎細(xì)胞的關(guān)系。最近幾年酵母雙雜交技術(shù)發(fā)展迅速，衍生出了單雜交系統(tǒng)、三雜交系統(tǒng)核外雙雜交系統(tǒng)、反向雙雜交系統(tǒng)、哺乳動(dòng)物雙雜交系統(tǒng)等[19]相信在蛋白質(zhì)組學(xué)領(lǐng)域未來(lái)酵母雙雜交技術(shù)可以發(fā)揮更大的作用。

5串聯(lián)親和純化技術(shù)

串聯(lián)親和純化技術(shù)(tandem affinity purification,TAP)最早是由Rigaut G等[20]提出的接近原始自然狀態(tài)下測(cè)定蛋白互作的方法。最早用于酵母。原理是通過(guò)特殊設(shè)計(jì)的蛋白標(biāo)簽，將其與目標(biāo)蛋白進(jìn)行連接且不會(huì)對(duì)目標(biāo)蛋白調(diào)控造成影響，因此不會(huì)對(duì)蛋白表達(dá)及表達(dá)量造成不利，在經(jīng)過(guò)連續(xù)倆步的親和純化獲得活性接近自然狀態(tài)的蛋白復(fù)合物，隨后用Edman降解法或質(zhì)譜技術(shù)進(jìn)行蛋白質(zhì)鑒定。該方法優(yōu)點(diǎn)是假陽(yáng)性率低、周期短、特異性高，可分析復(fù)合物中蛋白間穩(wěn)定以及瞬時(shí)結(jié)合的互作情況。缺點(diǎn)是TAP標(biāo)簽會(huì)影響目標(biāo)蛋白與親和柱的結(jié)合，并干擾蛋白復(fù)合物的活性狀態(tài)。

TAP的優(yōu)點(diǎn)是接近原始自然狀態(tài)下測(cè)定蛋白互作，受到很多研究人員的推崇，但標(biāo)簽會(huì)在一定程度上干擾試驗(yàn)，如何排除標(biāo)簽帶來(lái)的干擾對(duì)于提升TAP技術(shù)有重要意義。Gong W等[21]通過(guò)串聯(lián)親和純化與雙向電泳技術(shù)的結(jié)合，并借助電鏡等儀器成功發(fā)現(xiàn)5個(gè)新的立氏立克次體體感誘發(fā)電位，尤其是Adr1、Adr2及OmpW都與血管內(nèi)皮細(xì)胞有相互作用。而另一些人則通過(guò)對(duì)試驗(yàn)本身，通過(guò)對(duì)標(biāo)簽的改善提高TAP的靈敏度，如Higo T等[22]開發(fā)了用于高效標(biāo)記畢赤酵母中染色體的方法，通過(guò)使用串聯(lián)親和純化標(biāo)簽在特定位置進(jìn)行標(biāo)記，并用HIS及FLAG序列反標(biāo)記標(biāo)簽后進(jìn)行親和純化，成功從P.pastoris畢赤酵母中純化出RNA聚合酶123,為后續(xù)快速大規(guī)模制備真核生物結(jié)晶級(jí)多亞基蛋白復(fù)合物奠定基礎(chǔ)。

6雙分子熒光互補(bǔ)技術(shù)

雙分子熒光互補(bǔ)技術(shù)(bimolecular fluorescence complementation,BiFC)最早是由Hu C D等[23]報(bào)道的一種準(zhǔn)確直觀的判斷靶蛋白在活細(xì)胞中的定位以及相互作用的新技術(shù)。雙分子熒光互補(bǔ)技術(shù)原理為將熒光蛋白(GFP、YFP、CFP等)切開形成N-端與C-末端的倆段不發(fā)光的多肽鏈，然后分別將這倆段多肽鏈連接到要驗(yàn)證的相互作用的靶蛋白上，當(dāng)靶蛋白在體內(nèi)或體外共同表達(dá)并相互作用融合，被分割開來(lái)的熒光蛋白肽鏈就可以互補(bǔ)重新連接到一起形成完整的熒光蛋白。該方法優(yōu)點(diǎn)是簡(jiǎn)單快速，適用范圍廣。缺點(diǎn)易出現(xiàn)假陽(yáng)性與假陰性的結(jié)果，需多次重復(fù)確定結(jié)果。盡管該技術(shù)有所限制，但是經(jīng)過(guò)不斷的改良，其后更是發(fā)展出了多色熒光互補(bǔ)技術(shù)(multicolor BiFC)，可以同時(shí)對(duì)多種蛋白間的相互作用進(jìn)行驗(yàn)證，并且可以比對(duì)蛋白互作程度的強(qiáng)弱，非常便利。

隨著BiFC的深入研究和性能的不斷發(fā)掘，現(xiàn)在可以應(yīng)用到多種細(xì)胞及生物體內(nèi)的蛋白間互作的研究，并可確定互作在細(xì)胞中的發(fā)生部位，簡(jiǎn)單、耗時(shí)短使近幾年有許多相關(guān)報(bào)道，如Chen M等[24]通過(guò)BiFC檢測(cè)到了HIV-1與輔助因子蛋白以及上皮衍生生長(zhǎng)因子之間的相互作用，并且是一種強(qiáng)的相互作用。這項(xiàng)研究提供了新的蛋白質(zhì)生理?xiàng)l件下的成像系統(tǒng)，并為抗HIV療法的蛋白抑制劑類藥物研發(fā)提供信息。Nickerson A等[25]更是將雙分子熒光與PALM相結(jié)合，證實(shí)了GTPase Ras與Raf之間的相互作用，這個(gè)結(jié)果在分子級(jí)上為Ras/Raf之間的互作調(diào)節(jié)提供了新的方向。

7蛋白質(zhì)芯片技術(shù)

蛋白質(zhì)芯片又稱蛋白質(zhì)微列陣，根據(jù)制作方法和應(yīng)用的不同將蛋白質(zhì)芯片分為2種：①蛋白質(zhì)檢測(cè)芯片，類似于較早出現(xiàn)的基因芯片，即在固相支持物表面高度密集的排列探針蛋白點(diǎn)陣，當(dāng)待測(cè)靶蛋白與其反應(yīng)時(shí)，可特異性的捕獲靶蛋白，然后通過(guò)檢測(cè)系統(tǒng)對(duì)其進(jìn)行分析，常用的是表面增強(qiáng)激光解析離子化-飛行時(shí)間質(zhì)譜技術(shù)(SELD-TOF-MS)將靶蛋白離子化，直接對(duì)其進(jìn)行定性、定量分析。②蛋白質(zhì)功能芯片，即樣品中待測(cè)蛋白在電場(chǎng)作用下通過(guò)芯片上的微型孔道進(jìn)行分離，后經(jīng)過(guò)噴射進(jìn)入質(zhì)譜儀中來(lái)檢測(cè)靶蛋白。該技術(shù)的優(yōu)點(diǎn)是簡(jiǎn)單快捷，高通量，重復(fù)性與敏感性好，可以檢測(cè)一些難以鑒定的低豐度，小分子質(zhì)量蛋白。缺點(diǎn)是進(jìn)行大量樣品測(cè)定時(shí)，需制備大量探針，另外芯片與靶蛋白結(jié)合特異性不高。蛋白質(zhì)芯片是近年來(lái)發(fā)展起來(lái)的新興生物檢測(cè)技術(shù)，經(jīng)過(guò)不斷的摸索與完善，該技術(shù)已經(jīng)在生物領(lǐng)域中廣泛使用。

目前，很多人著手于蛋白互作的課題，需要高通量、高敏感篩選互作蛋白時(shí)，蛋白質(zhì)芯片技術(shù)的優(yōu)勢(shì)就體現(xiàn)出來(lái)了，如Zhu H等[26]為深層探索酵母蛋白質(zhì)組，制備了多達(dá)5 800種的蛋白質(zhì)芯片，篩選它們與蛋白質(zhì)、磷脂質(zhì)等的互作能力，結(jié)果發(fā)現(xiàn)了很多新的相互作用蛋白。而通過(guò)第二種功能芯片還可以進(jìn)一步的了解靶蛋白相關(guān)功能，如Jiang B等[27]也通過(guò)該方法將核因子κB誘導(dǎo)激酶(nuclear factor κB-inducing kinase,NIK)結(jié)合到芯片上確定了NIK的負(fù)調(diào)控可以阻止肝損傷。

8Far Western blot

Far Western blot與Western blot相似，區(qū)別在于Far Western blot的一抗用帶有標(biāo)記物的待測(cè)蛋白來(lái)代替，如果膜上蛋白與帶標(biāo)記蛋白間有相互作用，就可以達(dá)到Western blot一抗的效果，最終結(jié)果就可以證明目的蛋白間的相互作用，用這種分析方法使用合成肽作為探針檢查交互序列(interaction sequences，IS)可以對(duì)翻譯后修飾蛋白間的互作進(jìn)行研究，并確定在不使用抗原特異性抗體時(shí)的蛋白與蛋白之間的相互作用。該方法優(yōu)點(diǎn)是靈敏度高，將陽(yáng)性率低，已經(jīng)在蛋白質(zhì)組學(xué)中廣泛應(yīng)用。缺點(diǎn)是每個(gè)試驗(yàn)需要的單抗如果買不到都要單獨(dú)制備，成本較高。

對(duì)于弱結(jié)合的互作來(lái)說(shuō)，該技術(shù)未必能準(zhǔn)確檢測(cè)到，但由于技術(shù)不斷的成熟，使得弱結(jié)合也可以準(zhǔn)確檢測(cè)到。Sato Y等[28]通過(guò)far Western blot 檢測(cè)到微弱的蛋白質(zhì)相互作用并使微弱的條帶得到增強(qiáng)。通過(guò)該方法檢測(cè)倆種蛋白質(zhì)之間是否有穩(wěn)定結(jié)合互作，如果是瞬時(shí)結(jié)合，可以用候補(bǔ)蛋白進(jìn)一步檢查，確保結(jié)果的準(zhǔn)確性，為瞬時(shí)結(jié)合不易被檢測(cè)到的問(wèn)題進(jìn)行了優(yōu)化。近幾年該技術(shù)不斷改進(jìn)，由于其試驗(yàn)方便、快捷，使其應(yīng)用頻繁，有關(guān)報(bào)道如Liu Q H等[29]使用far Western blot證明了南美白對(duì)蝦核衣殼蛋白VP51與核糖體蛋白L7的相互作用，同時(shí)說(shuō)明了L7參與對(duì)蝦白斑綜合(White spot syndrome,WSSV)感染，為進(jìn)一步研究探索L7在WSSV作用機(jī)制打下基礎(chǔ)。

9免疫共沉淀

免疫共沉淀(co-immunoprecipitation，Co-IP)是根據(jù)抗原抗體專一性驗(yàn)證蛋白之間相互作用的經(jīng)典手段。該技術(shù)的原理是使用非變性劑對(duì)細(xì)胞進(jìn)行裂解，這樣原細(xì)胞內(nèi)的相互作用蛋白會(huì)很完整的保留下來(lái)，隨后加入靶蛋白的對(duì)應(yīng)抗體使之形成抗原抗體復(fù)合物沉淀，這樣與靶蛋白在細(xì)胞內(nèi)相互作用的蛋白也會(huì)一同被沉淀下來(lái)，故稱免疫共沉淀。該技術(shù)優(yōu)點(diǎn)是保持了蛋白的天然狀態(tài)，真實(shí)的反應(yīng)互作結(jié)果。缺點(diǎn)是不易檢測(cè)到瞬時(shí)以及不穩(wěn)定的互作關(guān)系(因?yàn)樗矔r(shí)以及不穩(wěn)定的互作無(wú)法形成穩(wěn)定的沉淀)，且由于蛋白并未經(jīng)過(guò)純化所以不能證明蛋白間的相互作用是直接的還是間接的。

當(dāng)確定某種互作關(guān)系后，形成的復(fù)合物的功能和性質(zhì)也將成為研究的目標(biāo)，而復(fù)合物的作用機(jī)制也需進(jìn)一步探究。Bilusic I等[30]通過(guò)免疫共沉淀檢測(cè)到大腸埃希菌RNA分子伴侶(host factor for RNA phage QB replicase,HFQ)與體內(nèi)許多sRNAs的結(jié)合并確定了25種新型RNA，另通過(guò)Northern blot發(fā)現(xiàn)了與HFQ結(jié)合的RNA形成的復(fù)合物均受HFQ的調(diào)控。Co-IP一般用于倆倆間的蛋白互作驗(yàn)證，無(wú)法大規(guī)模進(jìn)行驗(yàn)證，而凌夢(mèng)婷等[31]以液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法(liquid chromatograph-mass spectrometer,LC-MS/MS)鑒定技術(shù)為基礎(chǔ)，通過(guò)Co-IP大規(guī)模的篩選了45個(gè)與HBV病毒POL蛋白的互作蛋白，其中有11個(gè)已經(jīng)有過(guò)報(bào)道，在這些蛋白中有4種蛋白可能參與了3種主要分子機(jī)制，為進(jìn)一步探索HBV蛋白功能結(jié)構(gòu)提供理論依據(jù)，也看出蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)間的聯(lián)用可以對(duì)試驗(yàn)有很大改善。

10BIAcore

在蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)不斷更新?lián)Q代時(shí)，相關(guān)儀器設(shè)備也在不斷改良，測(cè)定偏向于蛋白互作弱結(jié)合的儀器設(shè)備是奧弗豪塞爾核效應(yīng)(nuclear overhauser effect,transfer-NOE)和等溫滴定量熱法(isothermal titration calorimetry,ITC)，偏向于測(cè)定強(qiáng)的蛋白互作比較流行的便是以表面離子共振(surface plasmon resonance,SPR)技術(shù)為基礎(chǔ)的生物分子相互作用分析(Biomolecular interaction analysis,BIAcore)，這里著重介紹BIAcore。

Amersham Bioscience公司是實(shí)現(xiàn)該技術(shù)商業(yè)化最成功的公司，其推出的儀器商品即為BIAcore,現(xiàn)有BIAcore1000/2000/3000/X等產(chǎn)品系列，BIAcore系統(tǒng)由微射流卡盤、傳感器芯片和SPR光學(xué)檢測(cè)系統(tǒng)3個(gè)核心部分組成，它的工作原理是基于SPR技術(shù)來(lái)實(shí)時(shí)追蹤生物分子間的相互作用。試驗(yàn)開始是先將一種生物分子固定在傳感器芯片表面，再通過(guò)微射流卡盤將待測(cè)相互作用的分子溶液傳送至傳感器芯片表面，SPR光學(xué)檢測(cè)系統(tǒng)則跟蹤檢測(cè)溶液與芯片表面的分子結(jié)合和解離的全過(guò)程，試驗(yàn)過(guò)程中獲取的各種特異性信號(hào)全部通過(guò)數(shù)據(jù)分析軟件BIAEvaluation處理，并整合成最終結(jié)果。在超過(guò)17年的時(shí)間里，BIAcore 系統(tǒng)為科學(xué)家們提供了獨(dú)到的洞察力來(lái)揭示蛋白質(zhì)的相互作用，發(fā)表文獻(xiàn)超過(guò)6 500篇，而近幾年國(guó)外也不斷有應(yīng)用BIAcore來(lái)進(jìn)行蛋白互作驗(yàn)證的例子[32-33]。由于其高度的自動(dòng)化和靈敏特異性且具常規(guī)儀器方法難以比擬的實(shí)時(shí)、動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)優(yōu)點(diǎn)，而且該儀器可以與質(zhì)譜技術(shù)相結(jié)合使用，使BIAcore廣泛地應(yīng)用于蛋白質(zhì)組學(xué)領(lǐng)域的研究。

11小結(jié)與展望

蛋白質(zhì)之間的互作是直接的還是間接的，瞬時(shí)的還是緩慢的，強(qiáng)結(jié)合還是弱結(jié)合，這些都與生物體內(nèi)機(jī)制息息相關(guān)，探究蛋白間的互作對(duì)于進(jìn)一步了解生物體機(jī)制有著深遠(yuǎn)的意義。蛋白間互作的抑制劑(protein-protein interact inhibitors, PPIIs)由此產(chǎn)生，通過(guò)對(duì)蛋白互作的阻斷達(dá)到病毒機(jī)制“失活”的效果，發(fā)揮抗病毒作用使臨床疾病得以完善治療，而最近幾年抗病毒藥物的快速研發(fā)也說(shuō)明了PPIIs有發(fā)展成為抗癌藥物的潛力[34]。目前對(duì)于少量的蛋白互作檢測(cè)多用幾種方法協(xié)同驗(yàn)證，力求結(jié)果精準(zhǔn)。而對(duì)于未知的物種間蛋白的互作，則可以借用生物信息學(xué)來(lái)進(jìn)行初步篩選判斷，既可節(jié)約時(shí)間也可增加試驗(yàn)成功率。在過(guò)去的幾十年不僅蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)飛速發(fā)展，蛋白質(zhì)組學(xué)的生物信息學(xué)也嶄露頭角，筆者將國(guó)內(nèi)與國(guó)外的部分蛋白質(zhì)互作生物信息學(xué)相關(guān)的蛋白質(zhì)組數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行了整合[35-36](表1)。

可見(jiàn)生物信息學(xué)在蛋白質(zhì)組學(xué)中也占據(jù)了舉足輕重的地位，很多實(shí)驗(yàn)室都將生物信息學(xué)與蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)相結(jié)合獲得更精確的結(jié)果。相信在未來(lái)蛋白質(zhì)組學(xué)研究重心將繼續(xù)向蛋白質(zhì)的互作研究發(fā)展并且協(xié)同生物信息學(xué)會(huì)在生命科學(xué)領(lǐng)域突飛猛進(jìn)，為探索臨床疾病發(fā)生機(jī)制指明新方向。

參考文獻(xiàn):

[1]Sirdeshmukh R. Indian proteomics efforts and human proteome project[J]. J Proteomics, 2015,18(3):1-5.

[2]Feist P, Hummon A B. Proteomic challenges: sample preparation techniques for microgram-quantity protein analysis from biological samples[J]. Int J Mol Sci, 2015, 16(2): 3537-3563.

[3]Barbosa E B, Vidotto A, Polachini G M,et al. Proteomics: methodologies and applications to the study of human diseases[J]. Rev Assoc Med Bras, 2012,58(3):366-375.

[4]Guo C G, Shang Z, Yan J, et al. A tunable isoelectric focusing via moving reaction boundary for two-dimensional gel electrophoresis and proteomics[J]. Talanta, 2015, 137: 197-203.

表1　蛋白質(zhì)互作數(shù)據(jù)庫(kù)

[5]Cui J, Liu R D, Wang L, et al. Proteomic analysis of surface proteins of Trichinella spiralis muscle larvae by two-dimensional gel electrophoresis and mass spectrometry[J]. Parasite Vector, 2013, 6(1): 355.

[6]Ebrahimizadeh W, Rajabibazl M. Bacteriophage vehicles for phage display: biology, mechanism, and application[J]. Curr Microbiol, 2014, 69(2): 109-120.

[7]Alirezapour B, Rajabibazl M, Rasaee M J, et al. Production and characterization of recombinant scFv against digoxin by phage display technology[J]. MoAb Immunodiagn Immunother, 2013, 32(3): 172-179.

[8]Wang L F, Yu M. Epitope identification and discovery using phage display libraries: applications in vaccine development and diagnostics[J]. Curr Drug Target, 2004, 5(1): 1-15.

[9]Mehr K S, Mousavi S L, Rasooli I, et al. A DNA vaccine againstEscherichiacoliO157: H7[J]. Iran Biomed J, 2012, 16(3): 133.

[10]Ardekani L S, Gargari S L M, Rasooli I, et al. A novel nanobody against urease activity ofHelicobacterpylori[J]. Int J Infect Dis, 2013, 17(9): e723-e728.

西藥治療組：黃體酮膠囊與倍美力片聯(lián)合治療。倍美力片，口服，1.25 mg，每日一次，共22天；服用倍美力片第13天起，加服黃體酮膠囊，口服，100 mg，每日2次，共10天。30天為一療程。2～3個(gè)療程為一個(gè)治療周期。

[11]Celik E, Ollis A A, Lasanajak Y, et al. Glycoarrays with engineered phages displaying structurally diverse oligosaccharides enable high‐throughput detection of glycan-protein interactions[J]. Biotechnol J, 2015, 10(1): 199-209.

[12]Malini E, Maurizio E, Bembich S, et al. HMGA Interactome: new insights from phage display technology[J]. Biochemistry, 2011, 50(17): 3462-3468.

[13]Wissmueller S, Font J, Liew C W, et al. Protein-protein interactions: Analysis of a false positive GST pulldown result[J]. Proteins: Structure, Function Bioinformatics, 2011, 79(8): 2365-2371.

[14]Luo L, King N P, Yeo J C, et al. Single-step protease cleavage elution for identification of protein-protein interactions from GST pull‐down and mass spectrometry[J]. Proteomics, 2014, 14(1): 19-23.

[15]Wang X, Bai J, Zhang L, et al. Poly (A)-binding protein interacts with the nucleocapsid protein of porcine reproductive and respiratory syndrome virus and participates in viral replication[J]. Antiviral Res, 2012, 96(3): 315-323.

[16]Fields S, Song O. A novel genetic system to detect protein-protein interactions[J]. Nature, 1989 (340): 245-256.

[17]Silva J V, Freitas M J, Felgueiras J, et al. The power of the yeast two-hybrid system in the identification of novel drug targets: building and modulating PPP1 interactomes[J]. Expert Rev Proteomics, 2015, 12(2): 147-158.

[19]趙靜, 王宏偉, 田二杰, 等. 蛋白質(zhì)組學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)及其應(yīng)用[J]. 動(dòng)物醫(yī)學(xué)進(jìn)展, 2015, 36(1): 116-120.

[20]Rigaut G, Shevchenko A, Rutz B, et al. A generic protein purification method for protein complex characterization and proteome exploration[J]. Nature Biotechnol, 1999, 17(10): 1030-1032.

[21]Gong W P, Xiong X, Qi Y, et al. Identification of novel surface-exposed proteins of Rickettsia rickettsii by affinity purification and proteomics[J]. PLoS One, 2014, 9(6): e100253.

[22]Higo T, Suka N, Ehara H, et al. Development of a hexahistidine-3× FLAG-tandem affinity purification method for endogenous protein complexes in Pichia pastoris[J]. J Struct Funct Genomics, 2014, 15(4): 191-199.

[23]Hu C D, Chinenov Y, Kerppola T K. Visualization of interactions among bZIP and Rel family proteins in living cells using bimolecular fluorescence complementation[J]. Mol Cell, 2002, 9(4): 789-798.

[24]Chen M H, Li W, Zhang Z, et al. Novel near-infrared BiFC systems from a bacterial phytochrome for imaging protein interactions and drug evaluation under physiological conditions[J]. Biomaterials, 2015, 48: 97-107.

[25]Nickerson A, Huang T, Lin L J, et al. Photoactivated localization microscopy with bimolecular fluorescence complementation (BiFC-PALM) for nanoscale imaging of protein-protein interactions in cells[J]. PLoS One, 2014, 9(6): e100589.

[26]Zhu H, Bilgin M, Bangham R, et al. Global analysis of protein activities using proteome chips[J]. Science, 2001, 293(5537): 2101-2105.

[27]Jiang B, Shen H, Chen Z, et al. Carboxyl terminus of HSC70-interacting protein (CHIP) downregulates NF-κB-inducing kinase (NIK) and suppresses NIK-induced liver injury[J]. J Biol Chem, 2015，290(18): 11704-11714.

[28]Sato Y, Kameya M, Arai H, et al. Detecting weak protein-protein interactions by modified far-Western blotting[J]. J Biosci Bioenginee, 2011, 112(3): 304-307.

[29]Liu Q H, Ma F, Guan G K, et al. White spot syndrome virus VP51 interact with ribosomal protein L7 of Litopenaeus vannamei[J]. Fish Shellfish Immunol, 2015, 44(1): 382-388.

[30]Bilusic I, Popitsch N, Rescheneder P, et al. Revisiting the coding potential of theE.coligenome through Hfq co-immunoprecipitation[J]. RNA Biol, 2014, 11(5): 641-654.

[31]凌夢(mèng)婷, 宮君原, 李君武, 等. LTQ-FT-MS 技術(shù)結(jié)合生物信息學(xué)篩選與 HBV Polymerase 存在潛在相互作用的宿主蛋白[J]. 病毒學(xué)報(bào), 2014,30(6): 636-644.

[32]Yau Y H, Shochat S G. Analysis of affinity of dengue virus protein interaction using biacore[M]. Dengue: Springer New York, 2014: 271-284.

[33]Pixley R A, Espinola R G, Ghebrehiwet B, et al. Interaction of high-molecular-weight kininogen with endothelial cell binding proteins suPAR, gC1qR and cytokeratin 1 determined by Surface Plasmon Resonance (BiaCore)[J]. Thrombosis Haemostasis, 2011, 105(6): 1053-1059.

[34]楊立莉, 葉劍. 蛋白-蛋白互作抑制劑在抗 HIV 治療中的研究進(jìn)展[J]. 生物技術(shù)世界, 2014(9): 101.

[35]沈瑤瑤, 嚴(yán)慶豐. 蛋白質(zhì)相互作用研究進(jìn)展[J]. 生命科學(xué), 2013, 25(3): 269-274.

[36]Chen T, Zhao J, Ma J, et al. Web resources for mass spectrometry-based proteomics[J]. Genomics, Proteomics Bioinformatics, 2015, 13(1): 36-39.

動(dòng)物醫(yī)學(xué)進(jìn)展,2016,37(2):116-119ProgressinVeterinaryMedicine

獸醫(yī)臨床

Protein-protein Interaction Technology

WU Jian1,2,ZHU Hai-xia1, ZHAO Zhi-xun1, YAN Xin-min1,ZHAO Yin-long3, WU Na1,LI Jian1,ZHANG Zhi-dong1, ZHANG Qiang1, LI Ying2, WU Guo-hua1

(1.StateKeyLaboratoryofVeterinaryEtiologicalBiology/LanzhouVeterinaryResearchInstitute,ChineseAcademyofAgriculturalScience,Lanzhou,Gansu,730046,China；2.CollegeofAnimalScienceandTechnology,JilinAgricultureUniversity,Changchun,Jilin,130118,China;3.AcademyofLifeScienceandTechnology,NorthwestUniversityforNationalities,Lanzhou,Gansu,730124,China)

Abstract:Protein in the mechanism of the organism is essential as a start within biological systems and perform tasks. Every biological step of the organism, from the genetic material copy to the cell aging and death, depends on a few or even hundreds of protein function coordination. The protein function and structural changes will destroy this balance, leading to the occurrence of disease, usually as a result of protein-protein interactions. There are still a lot of structures and functions of the proteins unknown, so it is particularly rapid in development of proteomics. This article reviewed the proteomics technologies,such as 2-DE, phage display technology, GST pull-down, yeast two-hybrid system,TAP,BiFC, protein chip, Far Western blot,Co-IP,and introducted the application of these technologies in biology in recent years.

Key words:protein-protein interaction; protein-protein interaction inhibitor; bioinformatics

文章編號(hào):1007-5038(2016)02-0109-07

中圖分類號(hào):S852.2

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼:A

作者簡(jiǎn)介：吳健(1990-)，男，吉林長(zhǎng)春人，碩士研究生，主要從事分子免疫學(xué)研究。

基金項(xiàng)目：國(guó)家質(zhì)檢總局公益性行業(yè)科研專項(xiàng)(201310093)；國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(31201892)；甘肅省自然科學(xué)基金項(xiàng)目(1208RJZA101)；國(guó)家863計(jì)劃項(xiàng)目(2012AA101304)；甘肅省科技資助計(jì)劃項(xiàng)目(1504WKCA055)

收稿日期：2015-04-29