miR-20b直接靶向3′-UTR負性調(diào)節(jié)VEGF的表達*

陶象男，　汪憶夢，　宋傳旺△

1蚌埠醫(yī)學院第二附屬醫(yī)院檢驗科，蚌埠　233040

2蚌埠醫(yī)學院免疫學教研室，安徽省感染與免疫重點實驗室，蚌埠　233030

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miR-20b直接靶向3′-UTR負性調(diào)節(jié)VEGF的表達*

陶象男1，汪憶夢2，宋傳旺2△

1蚌埠醫(yī)學院第二附屬醫(yī)院檢驗科，蚌埠233040

2蚌埠醫(yī)學院免疫學教研室，安徽省感染與免疫重點實驗室，蚌埠233030

摘要：目的探討miR-20b是否直接靶向VEGF 3′-非編碼區(qū)(3′-UTR)而調(diào)控其表達。方法采用miRanda軟件預測VEGF 3′-UTR是否存在miR-20b的結(jié)合位點；使用PCR方法擴增RAW264.7細胞VEGF基因3′-UTR序列，經(jīng)雙酶切后克隆到pmiR-RB-ReportTM質(zhì)粒海腎熒光素酶的下游，得到pmiR-RB-ReportTM-VEGF 3′-UTR雙熒光素酶重組質(zhì)粒，使用電泳法和測序法進行驗證；將重組質(zhì)?；蚩召|(zhì)粒與miR-20b模擬物或其對照共轉(zhuǎn)染HeLa細胞，24 h后檢測相應(yīng)熒光素酶活性。結(jié)果VEGF 3′-UTR存在miR-20b的結(jié)合位點；獲得了含VEGF 3′-UTR的雙熒光素酶報告載體；重組質(zhì)粒與miR-20b模擬物共轉(zhuǎn)染組HeLa細胞的熒光素酶活性明顯低于空質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組(P<0.05)。結(jié)論成功構(gòu)建小鼠VEGF基因3′-UTR雙熒光素酶報告載體，miR-20b可以直接靶向VEGF 3′-UTR而負性調(diào)控其表達。

關(guān)鍵詞：血管內(nèi)皮生長因子；3′-非編碼區(qū)；miR-20b；雙熒光素酶報告載體

血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)在生理性和病理性的血管生成中均起到重要作用，對于血管內(nèi)皮細胞來說，它是一種分泌性的有絲分裂原，是最具潛能的促血管生成因子[1]。VEGF家族包括VEGF-A、VEGF-B、VEGF-C、VEGF-D、VEGF-E、VEGF-F、PIGF-1和PIGF-12等8個成員，VEGF-A即通常我們所指的VEGF，它是含有二硫化物的同源二聚體糖蛋白[2]。VEGF與腫瘤、膿毒癥、糖尿病、類風濕關(guān)節(jié)炎等多種疾病有密切的聯(lián)系[3]，而最近的研究表明，VEGF在哮喘的發(fā)病中也起到了關(guān)鍵作用，并且VEGF的表達水平與疾病的進展與預后相關(guān)[4]。VEGF表達的調(diào)控既可以發(fā)生在轉(zhuǎn)錄水平，也可以發(fā)生在轉(zhuǎn)錄后水平，HIF-1、STAT3、SP-1等多種轉(zhuǎn)錄因子已被證明可調(diào)控VEGF的表達[5]，但關(guān)于其轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控的研究較少。目前microRNA(miRNA)在哮喘發(fā)病中的作用已引起了人們的關(guān)注，我們前期的研究表明，慢性哮喘小鼠肺組織中miR-20b的表達較正常小鼠減少，并且miR-20b可以負性調(diào)節(jié)VEGF的表達[6]。但miR-20b究竟通過何種機制調(diào)控VEGF表達仍不清楚。本研究通過miRanda軟件預測VEGF 3′-UTR是否存在miR-20b的結(jié)合靶點，并構(gòu)建含有VEGF基因3′-UTR(Untranslated Regions，非編碼區(qū))的雙熒光素酶報告載體，以觀察miR-20b是否在轉(zhuǎn)錄后水平直接靶向VEGF而調(diào)控其表達。

1材料和方法

1.1材料

pmiR-RB-ReportTM質(zhì)粒(6 720 bp)購于廣州銳博公司，大腸埃希菌DH5α購自碧云天公司，Dual-Luciferase?Reporter Assay System購于Promega公司，LipofectamineTM2000、Trizol試劑由Invitrogen公司提供，TransStart Fast Pfu DNA Polymerase試劑盒、TransScriptTMFirst-strand cDNA Synthesis SuperMix試劑盒購于北京全式金公司，AxyPrep DNA凝膠回收試劑盒、AxyPrep質(zhì)粒DNA小量試劑盒購于康寧公司，DNA連接酶、XhoⅠ、NotⅠ內(nèi)切酶購自TaKaRa公司。miR-20b模擬物及其對照購于上海吉瑪公司，miR-20b模擬物序列(上游：5′-CAAAGUGCUCAUAGUGCAGGUAG-3′，下游：5′-ACCUGCACUAUGAGCACUUUGUU-3′)，miR-20b模擬物對照序列(上游：5′-UUCUCCGAACGUGUCACGUTT-3′，下游：5′-ACGUGACACGUUCGGAGAATT-3′)。

1.2方法

1.2.1小鼠VEGF基因3′-UTR序列的擴增采用Trizol試劑提取RAW 264.7細胞總RNA，根據(jù)TransScript First-strand cDNA Synthesis Super Mix試劑盒說明書進行第一鏈cDNA合成，然后進行PCR擴增VEGF基因3′-UTR序列，由于VEGF 3′-UTR下游多聚A信號較長，不利于克隆，而miRNA的結(jié)合位點多集中在上游300 bp以內(nèi)，因此我們設(shè)計的引物最后擴增的是VEGF 3′-UTR上游約350 bp長度的序列。設(shè)計的上游引物：5′-CCGCTCGAGGCCAGGCTGCAGGAAGGAG-3′，下游引物：5′-GAATGCGGCCGCGTGTATGTGG-GTGGGTGTGTC-3′。其中上游引物下劃線處為XhoⅠ酶切位點，下游引物下劃線處為NotⅠ酶切位點，擴增產(chǎn)物長度334 bp。PCR反應(yīng)遵照TransStart Fast Pfu DNA Polymerase試劑盒說明書進行，反應(yīng)條件：95℃預變性1 min，95℃變性20 s，57℃退火20 s，72℃，延伸30 s，40個循環(huán)。

1.2.2pmiR-RB-ReportTM-VEGF 3′-UTR雙熒光素酶重組質(zhì)粒的構(gòu)建將pmiR-RB-ReportTM質(zhì)粒與回收純化的VEGF基因3′-UTR序列PCR擴增產(chǎn)物進行XhoⅠ、NotⅠ雙酶切，酶切產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠電泳，并切膠回收純化。按照TaKaRa DNA Ligation Kit Ver.2.0說明書進行連接反應(yīng)，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化感受態(tài)DH5α進行擴增培養(yǎng)，濃集菌液后抽提重組質(zhì)粒。重組質(zhì)粒進行XhoⅠ、NotⅠ雙酶切鑒定并送上海生工測序。

1.2.3細胞的轉(zhuǎn)染轉(zhuǎn)染前1 d，將HeLa細胞(2×105/孔)接種24孔板，用高糖DMEM(含10%胎牛血清)培養(yǎng)，轉(zhuǎn)染當天細胞約70%~90%融合。按照LipofectamineTM2000說明書進行轉(zhuǎn)染，用250 μL Opti-MEMⅠ稀釋3 μL 20 μmol/L miR-20b模擬物及其對照儲存液(V1)，用100 μL Opti-MEMⅠ稀釋3 μL Lipo2000(V2)，用150 μL Opti-MEMⅠ稀釋1 μg質(zhì)粒(V3)，將V1、V2、V3溶液混合，輕輕混勻，室溫孵育20 min；將轉(zhuǎn)染復合物(V1+V2+V3)加入HeLa細胞(500 μL)在培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4~6 h，更換含10%血清的DMEM完全培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)24 h后進行熒光素酶活性的測定。實驗分4組：①pmiR-RB-ReportTM空載體+miR-20b模擬物；②pmiR-RB-ReportTM空載體+miR-20b模擬物對照；③pmiR-RB-ReportTM-VEGF-3′-UTR重組載體+miR-20b模擬物；④pmiR-RB-ReportTM-VEGF-3′-UTR重組載體+miR-20b模擬物對照。

1.2.4熒光素酶活性的檢測按照Promega公司的雙熒光素酶活性檢測試劑盒說明書進行。檢測前用1×PBS洗滌HeLa細胞2~3次，每孔(24孔板)加入150 μL新鮮配制的被動細胞裂解液，反復吹打，使細胞充分裂解；13 000 g離心1 min取上清，在96孔非透明板中進行熒光素酶活性的測定，每孔加入20 μL上清，然后加入100 μL LARⅡ，檢測螢火蟲熒光素酶熒光值，再加100 μL Stop & Glo?試劑，檢測海腎熒光素酶的熒光值。測量時，使用1~2 s延遲和5~10 s讀數(shù)。最后的熒光素酶活性以海腎熒光素酶的熒光值與螢火蟲熒光素酶熒光值之比表示。

1.3統(tǒng)計學處理

2結(jié)果

2.1miRanda軟件預測VEGF 3′-UTR存在miR-20b的結(jié)合位點

根據(jù)miRBase網(wǎng)站(http：//www.mirbase.org/)數(shù)據(jù)，小鼠miR-20b結(jié)合靶基因3′-UTR的種子區(qū)域序列是AAAGUGC，其互補區(qū)序列應(yīng)是GCACUUU，按照miRanda算法(http：//www.microrna.org/microrna/home.do)顯示，在VEGF 3′-UTR上游處存在GCACUUU序列，是miR-20b結(jié)合的一個靶點，如圖1。

圖1　miRanda算法預測VEGF 3′-UTR的miR-20b結(jié)合位點Fig.1 Prediction of binding sites of miR-20b to 3′-UTR in VEGF gene using miRanda algorithm

2.2pmiR-RB-ReportTM-VEGF-3′-UTR重組質(zhì)粒的構(gòu)建

我們以RAW 264.7細胞為模板，擴增VEGF基因3′-UTR序列，產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠電泳，結(jié)果見圖2，PCR擴增長度大小約334 bp，與設(shè)計相符。將PCR擴增產(chǎn)物克隆到pmiR-RB-ReportTM質(zhì)粒海腎熒光素酶的下游，得到pmiR-RB-ReportTM-VEGF 3′-UTR雙熒光素酶報告載體，重組質(zhì)粒XhoⅠ、NotⅠ酶切簽定結(jié)果如圖3，在334 bp處有一條帶，說明VEGF 3′-UTR序列擴增產(chǎn)物被成功克隆到pmiR-RB-ReportTM質(zhì)粒。重組質(zhì)粒測序結(jié)果如圖4，VEGF 3′-UTR插入方向正確，序列也與GenBank數(shù)據(jù)庫一致。因此，pmiR-RB-ReportTM-VEGF 3′-UTR重組質(zhì)粒成功構(gòu)建。

M：100 bp DNA ladder；1：VEGF 3′-UTR PCR擴增產(chǎn)物圖2　VEGF基因3′-UTR PCR擴增產(chǎn)物電泳圖Fig.2 Electrophoregram of PCR amplification products of 3′-UTR in VEGF gene

M1：DL 10 000 bp DNA marker；1：pmiR-RB-ReportTM-VEGF 3′-UTR重組質(zhì)粒；2：重組質(zhì)粒XhoⅠ酶切簽定；3：重組質(zhì)粒XhoⅠ和NotⅠ雙酶切簽定；M2：100 bp DNA ladder圖3　pmiR-RB-ReportTM-VEGF 3′-UTR重組質(zhì)粒酶切鑒定圖Fig.3 Identification of pmiR-RB-ReportTM-VEGF 3′-UTR recombinant plasmid by enzyme digestion

圖4　pmiR-RB-ReportTM-VEGF 3′-UTR重組質(zhì)粒部分測序圖Fig.4 Map for partial sequences of pmiR-RB-ReportTM-VEGF 3′-UTR recombinant plasmid

2.3熒光素酶活性檢測的結(jié)果

本研究體系使用的報告基因檢測系統(tǒng)是pmiR-RB-ReportTM質(zhì)粒(圖5)，與其他雙熒光素酶報告載體不同，它的報告基因是海腎熒光素酶(hRLuc)，內(nèi)參基因是螢火蟲熒光素酶(hLuc)，因此最后的熒光素酶活性檢測結(jié)果以hRLuc/hLuc表示，結(jié)果如圖6，重組質(zhì)粒+miR-20b模擬物共轉(zhuǎn)染組HeLa細胞的熒光素酶活性明顯低于空質(zhì)粒+miR-20b模擬物及空質(zhì)粒+miR-20b對照共轉(zhuǎn)染組(均P<0.05)，而重組質(zhì)粒+miR-20b對照共轉(zhuǎn)染組熒光素酶活性與2個空質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染組相比差異無統(tǒng)計學意義。這說明miR-20b可以直接靶向VEGF 3′-UTR而負性調(diào)節(jié)其表達。

3討論

VEGF是內(nèi)皮細胞特異的有絲分裂原，在血管發(fā)生中起到關(guān)鍵作用。VEGF也可以增加血管的通透性而引起肺部炎癥，Lee等[7]證明VEGF是引起哮喘發(fā)病的主要決定因素。多項研究表明臨床哮喘患者血清及痰液中VEGF的表達升高，并且其病情嚴重程度與VEGF表達的量呈正相關(guān)[8-9]。因此關(guān)于VEGF表達調(diào)控的研究異常重要，目前此方面的研究多集中在轉(zhuǎn)錄水平，而關(guān)于轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控VEGF表達的研究較少。

hLuc：螢火蟲熒光素酶內(nèi)參基因;hRLuc：海腎熒光素酶報告基因;miR Target Gene 3′-UTR：miRNA靶基因的3′-UTR序列圖5　pmiR-RB-ReportTM質(zhì)粒結(jié)構(gòu)示意圖Fig.5 Structure diagram of pmiR-RB-ReportTMplasmid

①空質(zhì)粒+miR-20b模擬物；②空質(zhì)粒+miR-20b對照；③重組質(zhì)粒+miR-20b模擬物；④重組質(zhì)粒+miR-20b對照;與空質(zhì)粒對照組比較*P<0.05圖6　miR-20b對pmiR-RB-ReportTM報告基因系統(tǒng)熒光素酶活性的影響Fig.6 Effect of miR-20b on the luciferase activity of pmiR-RB-ReportTMreporter gene system

本研究旨在觀察microRNA是否可在轉(zhuǎn)錄后水平直接靶向VEGF 3′-UTR而調(diào)控其表達，實驗結(jié)果表明：miRanda軟件從理論上分析出VEGF 3′-UTR存在miR-20b的結(jié)合位點，通過構(gòu)建的含VEGF 3′-UTR的雙熒光素酶報告載體，證明miR-20b模擬物抑制了pmiR-RB-ReportTM-VEGF 3′-UTR雙熒光素酶重組質(zhì)粒報告基因的活性，這說明miR-20b可以直接靶向VEGF 3′-UTR而調(diào)控其表達。

熒光素酶有很多種，最常應(yīng)用的是螢火蟲熒光素酶和海腎熒光素酶，前者的發(fā)射波長是562 nm，后者的發(fā)射波長是460~540 nm。常規(guī)的熒光素酶報告系統(tǒng)的檢測，是向系統(tǒng)中同時或分開轉(zhuǎn)染獨立含單熒光素酶的質(zhì)粒，但每種質(zhì)粒的結(jié)構(gòu)、大小、特點都不同，再加上靶細胞的狀態(tài)、數(shù)目等因素，會相互影響轉(zhuǎn)染的效率，而最終的結(jié)果是計算報告熒光素酶活性與內(nèi)參熒光素酶活性的比值，轉(zhuǎn)染效率的差異會影響實驗結(jié)果的準確性。在我們的實驗體系中，使用的是同時含有螢火蟲熒光素酶和海腎熒光素酶的pmiR-RB-ReportTM雙熒光素酶報告載體，這就避免了2種質(zhì)粒轉(zhuǎn)染所造成的轉(zhuǎn)染效率的差異，提高了實驗的精度和重復性，我們的實驗結(jié)果即表明同組不同復孔之間差異較小。因此使用這種雙熒光素酶報告基因的檢測系統(tǒng)正成為一種趨勢。

miRNA是一種小片段非編碼RNA，它可以在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控靶基因的表達。miRNA的調(diào)控依賴其5′端約7個核苷酸長度的種子區(qū)域與靶基因3′-UTR互補序列的結(jié)合，這種結(jié)合會導致靶基因mRNA翻譯的受抑或降解[10-12]。Collison等[13]在最近的研究顯示，使用miR-126的拮抗劑抑制了變應(yīng)性哮喘小鼠的氣道高反應(yīng)性等表型特點。我們前期的研究也顯示哮喘小鼠肺泡巨噬細胞miR-20b的表達下調(diào)。miR-20b是miR-106a-363基因簇成員，定位在X染色體，目前相關(guān)研究很少。Lei等[14]的研究顯示肝癌細胞中，miR-20b可以調(diào)節(jié)VEGF的表達。Cascio等[15]的研究進一步表明miR-20b可以通過靶向HIF-1與STAT3間接調(diào)控VEGF的表達。本研究使用miRanda算法預測到VEGF 3′-UTR含有miR-20b種子區(qū)域的互補序列，并通過miRNA靶基因3′-UTR雙熒光素酶質(zhì)粒載體技術(shù)證明miR-20b可以直接靶向VEGF 3′-UTR而調(diào)控其表達。我們的實驗與Cascio等的結(jié)果表明miR-20b既可以直接靶向VEGF，也可以通過調(diào)節(jié)HIF-1與STAT3等轉(zhuǎn)錄因子間接負向調(diào)節(jié)VEGF的表達。

綜上所述，本研究成功構(gòu)建了pmiR-RB-ReportTM-VEGF 3′-UTR雙熒光素酶重組質(zhì)粒，并證明miR-20b可以直接靶向VEGF 3′-UTR而負性調(diào)節(jié)其表達，這將為臨床哮喘治療發(fā)現(xiàn)新靶點提供理論和實驗依據(jù)。

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(2015-03-19收稿)

miR-20b Directly Targets 3′-untranslated Region of VEGF and Negatively Regulates Its Expression

Tao Xiangnan1，Wang Yimeng2，Song Chuanwang2△

1DepartmentofClinicalLaboratory，TheSecondAffiliatedHospitalofBengbu

MedicalCollege，Bengbu233040，China2DepartmentofImmunology，AnhuiProvincialKeyLaboratoryofInfectionandImmunity，BengbuMedicalCollege，Bengbu233030，China

AbstractObjectiveTo investigate whether miR-20b directly targets VEGF 3′-untranslated region(3′-UTR) and regulates its expression.MethodsMiRanda software was used to predict the binding sites of miR-20b to VEGF 3′-UTR.3′-UTR sequence of VEGF gene was amplified using polymerase chain reaction(PCR) in RAW264.7 cells.PCR products were cloned into the downstream of Renilla luciferase in pmiR-RB-ReportTMplasmid to obtain pmiR-RB-ReportTM-VEGF 3′-UTR recombinant vector.Electrophoresis and DNA sequencing methods were used to verify the recombinant plasmid.The recombinant plasmid or empty plasmid and miR-20b mimic or its control were co-transfected into HeLa cells and 24 h later，the corresponding luciferase activity was detected by Dual-Luciferase?Reporter Assay System.ResultsThe recombinant dual luciferase reporter vectors with VEGF 3′-UTR were acquired.There was a binding site of miR-20b to 3′-UTR of VEGF gene.The luciferase activity in HeLa cells transfected with recombinant plasmid and miR-20b mimics was significantly lower than in the empty plasmid group(P<0.05).ConclusionMouse VEGF gene 3′-UTR dual luciferase reporter vector was successfully constructed.miR-20b could directly target VEGF gene 3′-UTR and negatively regulate its expression.

Key wordsvascular endothelial growth factor；3′-untranslated region；miR-20b；dual luciferase reporter vector

中圖分類號：R392.3

DOI：10.3870/j.issn.1672-0741.2016.01.005

通訊作者△，Corresponding author，E-mail：chuanwangsong@163.com

*國家自然科學基金資助項目(No.81273273)；安徽省自然科學基金資助項目(No.1308085MH114)

陶象男，女，1987年生，碩士研究生，E-mail：taoxiangnan@aliyun.com