代謝綜合征影響退行性主動脈瓣脂肪因子的表達*

謝　霆，　李儒正，　張樹華，　吳朝光，　張　紅，　董　明，　諶　絢，　陳新忠

1海南省人民醫(yī)院心臟外科，?？凇?70311

華中科技大學(xué)同濟醫(yī)學(xué)院附屬協(xié)和醫(yī)院2普外科3心血管外科，武漢　430022

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代謝綜合征影響退行性主動脈瓣脂肪因子的表達*

謝霆1，李儒正1，張樹華2，吳朝光1，張紅1，董明1，諶絢1，陳新忠3

1海南省人民醫(yī)院心臟外科，海口570311

華中科技大學(xué)同濟醫(yī)學(xué)院附屬協(xié)和醫(yī)院2普外科3心血管外科，武漢430022

摘要：目的研究脂肪因子在退行性主動脈瓣疾病(DAVD)患者血液和瓣膜標本中的表達特點。方法收集2012年9月至2015年9月在海南省人民醫(yī)院心外科因退行性主動脈瓣病變行手術(shù)切除的嚴重鈣化主動脈瓣標本和血液標本80例[男40例，女40例，年齡(61±6)歲]，其中40例合并有代謝綜合征(MS)；以及因夾層動脈瘤或心臟移植進行手術(shù)切除的正常主動脈瓣標本8例[男6例，女2例，年齡(48±7)歲]；健康成人志愿者血液標本40例[男20例，女20例，年齡(60±8)歲]。ELISA法檢測chemerin、瘦素、脂聯(lián)素的血漿濃度，經(jīng)蘇木精-伊紅(HE)染色和免疫組織化學(xué)染色，觀察退行性主動脈瓣的組織學(xué)改變和脂肪因子chemerin、瘦素、脂聯(lián)素免疫組織化學(xué)染色的表達特點，RT-PCR檢測組織中chemerin、瘦素基因的表達。結(jié)果chemerin、瘦素血漿濃度在DAVD患者較成人健康志愿者升高，DAVD合并MS較DAVD不合并MS患者升高；脂聯(lián)素血漿濃度在DAVD患者較成人健康志愿者降低，DAVD合并MS較DAVD不合并MS患者降低；與正常主動脈瓣比較，DAVD患者主動脈瓣增厚，結(jié)節(jié)性鈣化灶周圍存在脂肪樣組織，HE染色發(fā)現(xiàn)在鈣化灶周圍有巨噬細胞和其它的炎癥細胞、泡沫樣細胞、脂肪樣細胞、新生血管形成；免疫組織化學(xué)染色見正常主動脈瓣chemerin、瘦素、脂聯(lián)素陰性表達，DAVD患者主動脈瓣脂聯(lián)素陰性表達，然而可見chemerin和瘦素陽性表達，DAVD合并MS較DAVD不合并MS患者主動脈瓣中chemerin和瘦素表達增加；RT-PCR顯示DAVD合并MS較DAVD不合并MS患者主動脈瓣chemerin和瘦素mRNA表達增高。結(jié)論退行性主動脈瓣存在脂肪因子chemerin和瘦素表達，代謝綜合征影響退行性主動脈瓣脂肪因子chemerin和瘦素表達。

關(guān)鍵詞：退行性主動脈瓣疾病;脂肪因子;chemerin;瘦素；脂聯(lián)素

近年研究表明，退行性主動脈瓣鈣化不是簡單的鈣鹽被動沉積的過程，還存在一個主動鈣化過程，這是一個與3個過程的激活相關(guān)的慢性疾?。褐|(zhì)的蓄積、慢性炎癥，瓣膜鈣化。許多機制和風險因素與動脈粥樣硬化相似[1-3]。自從脂肪因子瘦素被發(fā)現(xiàn)以來，脂肪組織不再被單純當作是能量儲存組織，而是重要的內(nèi)分泌組織。近年來，越來越多的研究文獻表明，脂肪因子參與動脈粥樣硬化[4-8]，調(diào)節(jié)鈣化相關(guān)因子的生成，然而目前對于脂肪因子在退行性瓣膜鈣化中的作用尚不清楚。

1資料與方法

1.1研究對象

收集2012年9月至2015年9月在海南省人民醫(yī)院心外科因退行性主動脈瓣病變進行手術(shù)切除的嚴重鈣化主動脈瓣標本和血液標本80例[男40例，女40例，年齡(61±6)歲]，其中40例合并有代謝綜合征(metabolic syndrome，MS)；以及因夾層動脈瘤或心臟移植進行手術(shù)切除的正常主動脈瓣標本8例[男6例，女2例，年齡(48±7)歲]；健康成人志愿者血液標本40例[男20例，女20例，年齡(60±8)歲]。代謝綜合征診斷標準，以下4項指標中任3項或更多：中心性肥胖(男性腰圍≥90 cm，女性腰圍≥80 cm)；血漿中總?cè)８视汀?.7 mmol/L，高密度脂蛋白-c水平降低(男性<1.29 mmol/L，女性<1.03 mmol/L)；血壓升高，收縮壓≥130 mmHg或舒張壓≥85 mmHg；空腹血糖≥5.6 mmol/L[9]。排除標準包括：先天性主動脈瓣畸形、風濕性心臟瓣膜病、感染性心內(nèi)膜炎和馬凡綜合征，同時排除甲狀旁腺疾病和腎功能衰竭等影響鈣磷代謝的全身性疾病。所有組織標本均根據(jù)《赫爾辛基宣言》經(jīng)患者及家屬知情同意后采集，研究方案獲醫(yī)院倫理委員會批準。

1.2方法

1.2.1ELISA法檢測chemerin、瘦素、脂聯(lián)素血漿濃度血液樣本離心20 min，吸取上清液，分裝并存儲在-80℃，ELISA法檢測chemerin、瘦素、脂聯(lián)素的血漿濃度。

1.2.2標本蘇木精-伊紅(HE)染色主動脈瓣取材后采用10%中性甲醛固定，再進行常規(guī)脫水、石蠟包埋、5 μm連續(xù)切片處理。為了更好地保存抗原，在切片前標本不脫鈣。選取代表性的蠟塊用于分析。常規(guī)HE染色，顯微鏡下觀察瓣膜的厚度、組織結(jié)構(gòu)、細胞組成、鈣化部位以及鈣化灶周圍的變化。

1.2.3免疫組織化學(xué)染色將購于北京博奧森生物技術(shù)有限公司的兔抗人chemerin、瘦素、脂聯(lián)素單克隆抗體按1：100的比例進行稀釋，采用PV-9000通用型二步法試劑盒，具體操作按試劑盒操作說明。免疫組織化學(xué)染色圖片分析：①組織學(xué)和免疫組化的染色結(jié)果判斷：出現(xiàn)棕黃色且高出背景色為陽性。②免疫組化分級：根據(jù)陽性細胞計數(shù)半定量評估，任選4個高倍視野，根據(jù)細胞中陽性細胞所占的比例分為4級。0級：<10%的細胞呈現(xiàn)免疫反應(yīng)陽性；1級：10%～<25%的細胞為免疫反應(yīng)陽性；2級：25%～<50%的細胞為免疫反應(yīng)陽性；3級：≥50%的細胞呈現(xiàn)免疫反應(yīng)陽性。

1.2.4RT-PCR檢測脂肪因子chemerin、瘦素常規(guī)提取各組織總RNA，每20 μL體系各取1 μg總RNA為模板逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA：25℃10 min，37℃120 min，85℃ 5 s，-80℃保存?zhèn)溆?。? μL逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物進行實時定量PCR檢測，以β-肌動蛋白(β-actin為內(nèi)參照)，反應(yīng)體系為25 μL。兩步法擴增：95℃預(yù)變性30 s、；95℃5 s，60℃30 s；共40個循環(huán)。引物設(shè)計：β-actin上游引物5′-GGACGGACC-ACAGGCATCGTG-3′，下游引物5′-CAGGTCT-CTCCCTGAAAGATC-3′，擴增片段為120 bp(541~660)；chemerin的上游引物5′-GTGAGGCTGGAATTTAAGCTG-3′，下游引物為5′-AGCATG-CGCCCATTGCTCTCAA-3′，擴增片段為120 bp(1501~1620);瘦素上游引物5′-GAAGCAAAGCACCAGCTTCTC-3′，下游引物5′-GAGTCACTCAAAATGGGTTCA-3′，擴增片段為120 bp(1081~1200)。

1.3統(tǒng)計學(xué)方法

2結(jié)果

2.1chemerin、瘦素、脂聯(lián)素血漿濃度檢測

chemerin、瘦素血漿濃度在DAVD患者較成人健康志愿者升高，DAVD合并MS較DAVD不合并MS患者升高；脂聯(lián)素血漿濃度在DAVD患者較成人健康志愿者降低，DAVD合并MS較DAVD不合并MS患者降低。見表1。

2.2瓣膜標本肉眼觀察

正常主動脈瓣呈半透明狀，柔韌性好。退行性主動脈瓣，瓣口狹窄，瓣葉明顯不同程度地鈣化、增厚、堅硬，累及瓣膜的基底部、中間部和瓣尖整體，鈣化周圍見脂肪樣組織。

表1　血漿中chemerin、瘦素和脂聯(lián)素的濃度

與對照組比較，*P<0.05；與DAVD合并MS組比較，△P<0.05

2.3HE染色結(jié)果

正常主動脈瓣主要由5層構(gòu)成，依次為：主動脈側(cè)的內(nèi)皮層、富含膠原纖維的膠原層、致密基質(zhì)較少且排列疏松的松質(zhì)層、有明顯彈力纖維的心室層和心室側(cè)的內(nèi)皮層。正常主動脈瓣纖維排列整齊，無炎性細胞浸潤及血管形成(圖1A)。退行性病變瓣膜較正常瓣膜厚，結(jié)節(jié)性鈣化灶存在于瓣膜松質(zhì)層中，鈣化灶周圍纖維組織排列紊亂，瓣膜失去原有的結(jié)構(gòu)(圖1B)，瓣膜中可見新生血管、泡沫樣細胞和脂肪樣細胞(圖1C、D)。

A：正常主動脈瓣(×40)，正常主動脈瓣主要由5層構(gòu)成，依次為主動脈側(cè)的內(nèi)皮層、富含膠原纖維的膠原層、致密基質(zhì)較少且排列疏松的松質(zhì)層、有明顯彈力纖維的心室層和心室側(cè)的內(nèi)皮層；B：退行性主動脈瓣(×40)，可見鈣化灶；C：退行性主動脈瓣(×100)，可見泡沫樣細胞；D：退行性主動脈瓣(×100)，可見脂肪樣細胞圖1　正常主動脈瓣和退行性主動脈瓣切片HE染色圖Fig.1 HE staining of normal and degenerative aortic valves

2.4chemerin、瘦素、脂聯(lián)素免疫組織化學(xué)染色

正常瓣膜chemerin陰性表達(圖2A)，退行性病變主動脈瓣chemerin陽性表達，陽性表達主要見于鈣化灶周圍細胞中，DAVD合并MS以2級表達為主(97.2%)(圖2D)，DAVD不合并MS患者也以1級表達為主(72.3%)(圖2G)。正常瓣膜未見瘦素表達(圖2B)，DAVD見瘦素表達，陽性表達主要見于鈣化灶周圍的新生血管中，DAVD合并MS以0級表達為主(90.0%)(圖2E)，DAVD不合并MS患者瘦素表達以0級表達為主(67.5%)(圖2H)，(P<0.05)。正常瓣膜和退行性瓣膜均未見脂聯(lián)素表達(圖2C、F、I)。總之,chemerin、瘦素和脂聯(lián)素在正常主動脈瓣中均呈陰性表達，脂聯(lián)素在DAVD患者的鈣化主動脈瓣膜中也呈陰性表達，而chemerin和瘦素在DAVD患者的鈣化主動脈瓣膜中呈陽性表達，且在具有MS的DAVD患者鈣化主動脈瓣膜中的表達強度比不具有MS的DAVD患者高。

2.5DAVD合并MS與DAVD不合并MS患者RT-PCR檢測chemerin、瘦素mRNA表達

為了進一步了解DAVD合并MS患者和DAVD不合并MS患者chemerin、瘦素表達是否存在差異，我們檢測兩者間chemerin、瘦素mRNA的表達，盡管DAVD合并有MS患者和DAVD不合并MS患者都表達chemerin、瘦素mRNA，然而DAVD合并有MS患者chemerin、瘦素mRNA表達明顯高于DAVD不合并MS患者，兩者差異有統(tǒng)計學(xué)意義(均P<0.05)(圖3)。

3討論

脂肪因子主要由脂肪組織分泌，是在糖脂代謝、免疫和心血管功能調(diào)節(jié)中具有重要作用的一大類細胞因子，包括chemerin、瘦素和脂聯(lián)素等。血管鈣化是指體內(nèi)的鈣化誘導(dǎo)因子與抑制因子失衡導(dǎo)致鈣磷在血管壁的異常沉積，其中脂肪因子在鈣化發(fā)生、發(fā)展過程中的作用是近年受到關(guān)注的研究領(lǐng)域。研究發(fā)現(xiàn)瘦素[10-11]和腫瘤壞死因子α[12-13]在體內(nèi)外均可促進血管平滑肌細胞成骨樣分化及血管鈣化，而脂聯(lián)素、網(wǎng)膜素[14-16]則可抑制血管鈣化，提示各脂肪因子可能在鈣化過程中以協(xié)同或拮抗的方式發(fā)揮重要的調(diào)節(jié)功能，構(gòu)成促鈣化和抑鈣化的復(fù)雜調(diào)節(jié)網(wǎng)絡(luò)。退行性病變目前認為其中機制之一是脂質(zhì)蓄積導(dǎo)致的瓣膜鈣化，據(jù)此我們推測脂肪因子參與瓣膜鈣化。

Chemerin是脂肪細胞分泌的蛋白，通過自分泌/旁分泌影響組織的發(fā)育和功能。前chemerin在蛋白酶介導(dǎo)下，生成不同片段的活性chemerin參與組織代謝、炎癥、免疫[17-18]過程。有研究團隊發(fā)現(xiàn)血漿chemerin是心血管疾病獨立的危險因素[19]，最近基礎(chǔ)研究表明，chemerin調(diào)節(jié)骨髓間充質(zhì)干細胞分化為成骨細胞和脂肪細胞，能阻斷造血干細胞向破骨細胞分化[20-21]，提示chemerin參與鈣化的調(diào)節(jié)，但目前還不清楚其是否直接參與主動脈瓣鈣化的發(fā)病機制。我們的研究結(jié)果顯示，與健康志愿者相比，chemerin血漿濃度在DAVD患者較成人健康志愿者升高，DAVD患者主動脈瓣chemerin陽性表達。

A：正常主動脈瓣(×40)，未見chemerin表達；B：正常主動脈瓣(×40)，未見瘦素表達；C：正常主動脈瓣(×40)，未見脂聯(lián)素表達；D：DAVD合并MS(×40)，chemerin陽性表達；E：DAVD合并MS(×40)，瘦素陽性表達；F：DAVD合并MS(×40)，未見脂聯(lián)素表達；G：DAVD不合并MS(×40)，chemerin陽性表達；H：DAVD不合并MS(×40)，瘦素陽性表達；I：DAVD不合并MS(×40)，未見脂聯(lián)素表達。圖2　正常主動脈瓣和退行性主動脈瓣chemerin、瘦素、脂聯(lián)素免疫組織化學(xué)染色Fig.2 Immunohistochemisty of the expression of chemerin，leptin，and adiponectin in normal or degenerative aortic valves

與合并MS組比較，*P<0.05圖3　實時RT-PCR檢測chemerin和瘦素mRNA表達Fig.3 Real-time PCR for detection of chemerin and leptin

脂肪因子瘦素水平主要通過能量、食物攝入量、激素、炎癥進行調(diào)節(jié)[22]。在一般人群中高血清瘦素與動脈粥樣硬化、高血壓和代謝綜合征相關(guān)。瘦素通過內(nèi)皮細胞線粒體超氧化物產(chǎn)生和MCP-1的表達誘導(dǎo)啟動白細胞和巨噬細胞浸潤到內(nèi)皮細胞壁，在動脈粥樣硬化發(fā)展的早期階段起著重要作用[23]。Glader等[24]發(fā)現(xiàn)高瘦素水平與主動脈狹窄有關(guān)，這與我們的研究結(jié)果相似，然而，我們的結(jié)果與Kolasa-Trela等[25]研究不一致，Kolasa-Trela等報道嚴重主動脈狹窄患者瘦素降低。Zeadin等[10]利用載脂蛋白E缺陷小鼠證明瘦素能夠促進動脈粥樣硬化斑塊鈣化；載脂蛋白E缺陷小鼠腹腔注射瘦素后發(fā)現(xiàn)脈粥狀硬化斑塊和血管鈣化增加，進一步檢查顯示成骨細胞分化的標記，如骨鈣素、骨橋蛋白的表達明顯增加。目前的研究中，我們觀察到DAVD患者退行性主動脈瓣標本中存在瘦素表達，這表明它可能介導(dǎo)瓣膜鈣化，有趣的是，瘦素細胞因子在退行性主動脈瓣標本的表達與脂肪因子在血液中的濃度相關(guān)，DAVD合并MS患者較DAVD不合并MS患者，其退行性主動脈瓣標本中瘦素表達水平高。

脂聯(lián)素是經(jīng)典脂肪細胞因子，可以減輕炎癥，抑制動脈粥樣硬化的發(fā)生、發(fā)展[26-27]。Son等[16]發(fā)現(xiàn)TNF-α可以促進無機磷誘導(dǎo)的血管平滑肌細胞鈣化，而使用脂聯(lián)素后可完全逆轉(zhuǎn)細胞體外鈣化沉積[28-29]，脂聯(lián)素缺陷小鼠容易發(fā)生動脈鈣化，脂聯(lián)素對血管平滑肌細胞-成骨細胞分化起抑制作用。據(jù)文獻報道[30]，退行性心臟瓣膜鈣化的患者血中脂聯(lián)素水平不同程度地下降，在主動脈瓣狹窄中發(fā)現(xiàn)較低的脂聯(lián)素水平與炎癥及鈣化相關(guān)，與病情嚴重程度相關(guān)。這與我們的結(jié)果一致。然而，我們實驗進一步發(fā)現(xiàn)正常的瓣膜內(nèi)無脂聯(lián)素表達，退行性瓣膜鈣化也未見脂聯(lián)素表達。

我們研究發(fā)現(xiàn)退行性鈣化瓣膜患者血漿中chemerin和瘦素水平增高，脂聯(lián)素水平降低；進一步研究發(fā)現(xiàn)，退行性鈣化瓣膜可見chemerin和瘦素表達而無脂聯(lián)素表達，在正常瓣膜標本無chemerin、瘦素和脂聯(lián)素表達。另一方面我們研究發(fā)現(xiàn)與退行性鈣化瓣膜不合并代謝綜合征患者比較，退行性鈣化瓣膜合并代謝綜合征患者血漿中chemerin和瘦素水平增高，對應(yīng)的瓣膜中chemerin和瘦素表達相應(yīng)增高。總之，我們發(fā)現(xiàn)退行性鈣化瓣膜存在脂肪因子chemerin和瘦素表達，血漿中脂肪因子chemerin和瘦素濃度升高與退行性主動脈瓣脂肪因子表達增加相關(guān)。

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(2015-09-22收稿)

Metabolic Syndrome Influences the Expression of Adipokines in Degenerative Aortic Valves

Xie Ting1，Li Ruzheng1，Zhang Shuhua2etal

1DepartmentofCardiacSurgery，HainanProvincialPeople’sHospital，Haikou570311，China2DepartmentofGeneralSurgery，UnionHospital,TongjiMedicalCollege,HuazhongUniversityofScienceandTechnology，Whuan430022，China

AbstractObjectiveTo investigate the expression of adipokines in the blood and aortic valve in patients with degenerative aortic valve disease(DAVD).MethodsThe severely calcified aortic valve specimens and blood samples were collected from 80 patients who underwent heart surgery due to DAVD from Sep.2012 to Sep.2015 in Hainan Provincal People’s Hospital.The patients consisted of 40 males and 40 females with the average age of (61±6)years old.Among them，40 patients were complicated with metabolic syndrome(MS)；8 patients with dissecting aneurysm[6 males，2 females，aged(48±7)years]had normal aortic valves.Blood samples were also harvested from healthy adult volunteers(n=40；including 20 males and 20 females，aged(60±8)years old).Serum levels of chemerin，leptin，and adiponectin were detected by ELISA.The histological changes of degenerative aortic valves and the expressions of chemerin，leptin，and adiponectin were observed by HE staining and immunohistochemical staining，respectively.The expression levels of chemerin and leptin were also detected by RT-PCR.ResultsThe plasma levels of chemerin and leptin were significantly increased in DAVD patients when compared with those in adult healthy volunteers and they were higher in DAVD patients with MS than in DAVD patients without MS.The plasma level of adiponectin was obviously reduced in DAVD patients relative to adult healthy volunteers，and it was much lower in DAVD patients with MS than in DAVA patients without MS.Compared with normal aortic valves，degenerative aortic valves became thickened，and fat-like tissue was around the calcified nodules.HE staining revealed that macrophages，other inflammatory cells，foam-like cells，fat-like cells，angiogenesis were observed surrounding the calcified nodules.Immunohistochemistry showed that the expressions of chemerin，leptin and adiponectin were absent in normal aortic valves.But in degenerative aortic valves，chemerin and leptin except adiponectin were positively expressed.The protein and mRNA expressions of chemerin and leptin were higher in DAVD patients with MS than in DAVD patients without MS.ConclusionAdipokines including chemerin and leptin are expressed in degenerative aortic valves and MS can influence their expression.

Key wordsdegenerative aortic valve disease；adipokines；chemerin；leptin；adiponectin

中圖分類號：R322.1

DOI：10.3870/j.issn.1672-0741.2016.01.018

*國家自然科學(xué)基金資助項目(No.81270265)；海南省自然科學(xué)基金資助項目(No.814306)；海南省衛(wèi)生廳資助項目(No.瓊衛(wèi)2012-07)

謝霆，男，1983年生，醫(yī)學(xué)博士，主治醫(yī)師，E-mail：masterxieting@163.com